Spectrophotométrie UV-visible - Copie de 3 - PDF

**Spectrophotométrie UV-visible** C'est une technique d'absorption et étudie les énergies électroniques dans le cas de la spectroscopie moléculaire Il n'y a pas de différence fondamentale entre la spectrophotométrie dans le domaine du visible et de l'UV, à chaque fois on a une interaction entre la...

**Spectrophotométrie UV-visible** C'est une technique d'absorption et étudie les énergies électroniques dans le cas de la spectroscopie moléculaire Il n'y a pas de différence fondamentale entre la spectrophotométrie dans le domaine du visible et de l'UV, à chaque fois on a une interaction entre la lumière et la matière et lors de l'absorption d'une énergie lumineuse on aura passage d'un électron de l'état E0, à l'état excité (plus énergétique que E0). **3 domaine de l'UV visible :** - [UV lointain (10-200nm)] : les énergies sont trop importantes, risque de destruction des molécules car énergie apportée est supérieure par rapport à l'énergie des liaisons des molécules - Ce domaine n'est pas utilisable dans le domaine de l'analyse - [UV proche (200-400nm)] : les transitions électroniques sont moins énergétiques - Ce domaine est utilisé pour des substances qui ne sont pas coloré - [Visible (400-750nm)] : énergie impliquée est faible et détectable par l'œil humain - Concerne molécules colorées A. **[Les transitions électroniques]** 1. **[Rappel sur les structures électronique (état singulet, triplet)]** Pour les mol organique les électrons sont dits appariés (organisé par paires) pour chaque électron on a un nombre quantique de spin (propriété de la particule à tourner sur elle-même), ces électrons on des nombres quantiques de spin pouvant correspondre à +1/2 ou -1/2 Pour ces mol organique la règle de HUND pour les électrons appariés, majoritairement les pairs on des spin opposé (=antiparallèle), cet état s'appelle l'état singulet (S), (singulet fondamental (S0), singulet excité (S1, Sn)) A côté de l'état singulet on a une proba d'existence d'électron de spin parallèle (même nombre quantique de spin) = état triplet Lorsqu'on a absorption énergie lumineuse on passe de l'état singulet fondamental à singulet excité 2. **[Différents types d'orbitales moléculaires ]** On considère molécule diatomique qui est représenté par la [somme] ou [différence] entre les deux orbitales atomique Une image contenant texte, capture d'écran, Police Description générée automatiquement Prenons le premier atome A avec un électron, cet électron à une orbitale qui est définit par une fonction d'onde (expression mathématique de la présence d'un électron dans une zone donné), Si on considère la mol diatomique la plus simple (hydrogène), pour former mol hydrogène chaque atome de la molécule va mettre en commun un électron. On a recouvrement des deux orbitales atomique pour former une orbitale moléculaire. 2 possibilités pour cette orbitale moléculaire : - [Combinaison additive] : Lors de l'apparition de la liaison interatomique on va avoir, augmentation de la charge entre les deux noyaux. Cette orbitale est dites liantes (sigma) avec comme répartition des électrons (psyA + psyB) -\> **ORBITALE LIANTE** Cette orbitale liante a une énergie inferieur à celle de départ et elle permet la liaison entre les deux atomes - [Combinaison soustractive] : On a une orbitale moléculaire pour laquelle la répartition des charges se fait en dehors de la liaison, la répartition des charges est différente, la fonction d'onde correspond à (psyA -- psyB) on parle d'une **ORBITALE ANTILIANTE** (sigma\*), l'orbitale s'annule entre les noyaux et la répartition de la charge est maximal à l'extérieur. **Le niveau énergétique des orbitales antiliante est supérieur au niveau énergétique des orbitales liantes**  3. **[Types d'électron qui participent à l'absorption (UV-visible)]** Une transition électronique dans le cas de la spectroscopie de l'UV-visible correspond au passage d'un électron d'une orbitale liante à antiliante, ce passage est lié à l'absorption d'une énergie lumineuse par la molécule à une longueur d'onde donnée. - Vocabulaire  On a un spectre avec lambda en abscisse et absorbance en ordonnée. On a une longueur d'onde maximale Si on a décalage des longueurs d'onde vers des valeurs plus grande on parle d'effet : -\> bathochrome Si décalage des longueurs d'onde se fait vers des valeurs moins grande, l'effet est dit : -\> hypsochrome Plus la longueur d'onde est faible plus l'énergie mis en jeu est importante Coef extinction : Si coef extinction (epsilon) augmente : effet hyperchrome Si coef d'extinction diminue : effet hypochrome a. **Électrons liants** Ils participent à la formation d'une liaison au sein d'une molécule, on a des liaisons formées entre les atomes qui sont covalentes et les électrons liants participent à la formation d'une, deux ou trois liaison (triple) - [Molécules **saturées** :] Deux atomes de carbone avec liaison qui les relient appelé sigma, le niveau énergétique de cette liaison est très bas, donc liaison stable et si on veut passer d'une orbitale liante sigma (état fondamentale) à une liaison sigma\* antiliante (excité) il faut apporter énergie importante. Dans le domaine de longueur où on va travailler est de l'ordre de 130nm. Les appareils de spectrophotométrie UV-Visible commence à travailler qu'à partir de 200nm - [Molécules **insaturées** :] Ce sont des molécules qui présentent des carbones s'unissant avec 2 ou 3 liaisons Ex : éthylène, on a une simple liaison (sigma), entre carbone et hydrogène on a aussi liaisons sigma donc simple, la deuxième liaison entre deux atomes de carbone s'appelle liaison (pi) Concernant la liaison sigma, la proba de rencontrer ces électrons dans orbitale moléculaire sigma est fort  Pour cette liaison sigma proba trouver électrons dans cette orbitale moléculaire sigma est bcp plus faible Le niveau énergétique de cette liaison pi est plus élevé que le niveau énergétique de la liaison sigma, Le recouvrement des orbitales moléculaires pi est médiocre, La stabilité de liaison pi est beaucoup moins bonne que sigma - Il est alors plus facile de passer d'une liaison pi (liante) à une liaison pi\*(antiliante) La Transition électronique se fait à 170nm Quand on a orbitale pi isolé les appareils de mesure classiques peuvent pas détecter (car travail à partir de 200nm) - [Doubles liaisons conjuguées :] Liaisons conjuguées : double liaison séparée par liaison simple Quand on a conjugaison on a formation d'une orbitale unique et les électrons vont se délocaliser au sein de cette orbitale unique, ces électrons sont plus mobiles donc liaison moins solide, les électrons sont plus faciles à exciter on parle [d'effet bathochrome] (longueur d'onde max vers valeur plus importante) Ex : bêta-carotène On a un motif avec une double liaison est on va avoir une augmentation du nombre de motif le long de la liaison et au fur et à mesure qu'on a augmentation on a effet bathochrome de l'ordre de 50nm. On a augmentation de la conjugaison (effet bathochrome) qui est accompagné par effet hyperchrome (augmentation coef extinction (absorbance)) - [Dérivés aromatiques :] Ex : benzène On a trois doubles liaisons conjuguées donc 6 orbitales pi possibles, 3oribtales état fondamentales, 3 orbitales états excités, Pour cette molécule on a 3 longueurs d'onde max : - 183nm - 207nm - 264nm - Visible spectro classique b. **Électron non liants** Lié au fait que la molécule comporte un ou plusieurs hétéroatome (ex : O2), qui a un ou plusieurs doublets électroniques libre. Ex : formaldéhyde Sur le plan horizontal on a des électrons sigma (C-H), et les doublets électroniques ns et np libre de l'O2 Sur le plan vertical on a électron qui participent à la liaison sigma-carbone-O2 et pi- carbone-O2, ces électrons non liants ne participent pas à la création d'une liaison, ces différents électrons on différent niveau énergétique. **Diagramme énergétique :** Avec plusieurs possibilités de transition (ns-sigma \*, ns-pi\*, np-sima\*, np-pi\*) Dans la réalité on observe la moins énergétique, on voit que c'est la moins énergétique quand le delta énergétique est le plus faible (flèche la moins longue) Pour le formaldéhyde la seule transition électronique qu'on peut observer, est une transition np-pi\* à 305nm D'autres transitions existent mais sont pas observable avec appareil classique c. **Prévision des longueurs d'onde d'absorption** - Sigma-sigma\* : energie apporté doit être importante et transition faite à 130nm - Pi-pi\* : Observé si y'a une conjugaison, double liaison conjuguais (bathochrome) on travail de 200 à 400nm - n-sigma\* : Longueurs d'ondes observés vont être fonction des groupement fonctionnels (type de groupement sur lequel on travail) - n-pi\* : elles sont dans le domaine de l'UV (250 à 400nm)  4. **[Groupements chromophores]** Certains groupements on absorption propre : groupement chromophore Groupement chromophore : actif dans UV 2 types de transition : - Pi-pi\* : double liaison - N-pi\* : absorbent UV Si au sein d'une solution on a des groupements qui absorbent à une même longueur d'onde, l'absorbance total correspond à la somme des absorbances de chacun des groupements : [loi d'additivité d'absorbance] Il existe des groupements qui n'absorbent pas dans le domaine de l'UVproche (200-400nm) mais qui vont renforcer l'absorption d'un groupement chromophore dans le domaine de UVproche. Ces groupements sont des groupement [auxochrome] qui ont un effet bathochrome (décalage longueur d'onde vers valeur plus importante) sur groupement chromophore (absorbe domaine UVproche) Spectroscopie visible apporte peu d'info sur structure des molécules elle est utilisée surtout dans domaine de l'analyse quantitative 5. **[Facteurs modifiant absorption ]** Facteur liés à : - La molécule : effet mésomère, inductif, stérique - L'environnement : - [Absorption propre du solvant] : Quand on analyse spectre, le spectre correspond à la somme de celui du solvant et de la molécule Il est possible de régler appareil pour éteindre absorption du solvant cependant même si coef d'extinction du solvant est faible il arrive que l'absorption soit trop importante, d'où des limites d'utilisation des solvants - [pH] : effet sur molécule acido-basique (acides et bases) -\> diagramme prédominance espèce en fonction du pH les molécules seront soient à l'état moléculaire soit état ioniser et ça a influence sur le spectre Ex : phénol en fonction pH, molécule sera soit état moléculaire soit ionisé État ionisé : - Trois doublet électronique libre qui rentre en conjugaison avec les électrons pi du cycle benzénique, quand on a conjugaison on a effet bathochrome 6. **[Origine coloration substances]** Lié au fait que certaine molécule absorbe rayonnement du spectre de la lumière [Lumière blanche] : lumière polychromatique, quand elle traverse une solution avec molécule à l'intérieur on a absorption de certains rayonnements  Qu'est-ce qu'il se passe quand on a absorption : On observe coloration de la somme des longueurs d'ondes diffusés (celle que l'on voit) à la somme des longueurs d'onde de la lumière blanche moins somme des longueurs d'ondes absorbés Exemple : Si longueur d'onde absorbé est entre (400-435nm), la couleur absorbée est la violette donc on observe : la lumière blanche moins la couleur violette qui donne la couleur jaune B. **[Appareillage ]** 1. **[Appareillages conventionnels ]** En tout spectrophotomètre il y a 3 points : Spectroscopie d'absorption -\> on a source lumineuse, système dispersif qui sélectionne longueur d'onde particulière et on a [détecteur] qui détecte le rayonnement lumineux. Deux cas de figures : 1. Monochromes avant échantillon : appareil séquentiel il analyse longueur d'onde les unes après les autres 2. Système dispersif après échantillon : [Détecteur à barrette de diode] qui permet d'analyser toutes les longueurs d'onde simultanément **1^er^ type d'appareil** - Photomètre : travail à longueur d'onde fixe - Spectrophotomètre : permet de faire spectre L'échantillon est placé dans une cuve (cuve de section carré de 1cm de coté, en plastique ou verre si domaine visible, quartz domaine UV). Spectrophotomètre conventionnel 2 types : - [Simple vaisseaux] -\> on a un rayonnement monochromatique et polychromatique un système dispersif sélectionne une radiation monochromatique qui va traverser une seule cuve. On analyse un seul échantillon à la fois (d'abord blanc et ensuite échantillon). - [Double faisceau] -\> La source lumineuse émet une lumière blanche, on a ensuite sélection d'une radiation monochromatique et on a un disque dispersif qui oriente rayonnement monochromatique soit vers cuve de référence soit cuve monochromatique et appareil fait différence entre les deux absorbances. 2. **[Spectrophotomètre à barrette de diode ]** Les rayonnements sont analysés simultanément On a un rayonnement lumineux polychromatique qui va irradié l'échantillon, certains rayonnements sont absorbés et après l'échantillon on a système dispersif qui va disperser la lumière poly en un ensemble de radiations monochromatique, et l'intensité des rayonnements monochromatiques vont être analyser par des photodiodes rangées en barrette pour avoir un spectre obtenu simultanément. [Intérêt :] - Analyse plus rapide - Permet étudier cinétique de réaction rapide - Utilisé dans technique chromatographique (méthode de séparation de composé d'un échantillon) C. **[Application aspect quantitatif ]** 1. **[Loi Beer Lambert]** Permet de quantifier les composé grâce à technique d'absorption (cf cours 1) 2. **[Loi additivité absorbance ]** Si on a rayonnement lumineux qui traverse deux cuves de même largeur avec une cuve remplit de substance 1 (concentration C1), et une deuxième de substance 2 (C2) On a l'absorbance qui correspond : Absorbance solution 1 + absorbance 2 Cette loi d'additivité d'absorbance est illustrée par le fait que si cette source lumineuse n'irradie qu'une seule cuve, mais avec dans la même cuve le composé 1 et 2 de même concentration de départ on a même valeur d'absorbance -\> loi additivité absorbance 3. **[Application spectro-UV visible]** a. [Déterminer pKa et étudier cinétiques] - [Déterminer le pKa d'une substance] Ex : molécule à caractère acido-basique On sait que : pH : pKa + log acide/base Donc pkA = pH -logacide On prépare des solutions de pH différent, le pH sera mesuré par le pH-mètre et on détermine par spectrophotométrie-UV visible le pourcentage de forme basique et acide et donc ça nous permettra de déterminer le pKa  - Possibilité [d'étudier des cinétiques de réactions] On a une réaction d'hydrolyse alcaline du salicylate de méthyle, où le frome de départ à un spectre différent de la forme ici d'hydrolyse. On voit l'évolution des spectres (on pourra étudier les cinétiques de réactions) b. [Méthode utilisé en analyse quantitative avec dérivation ] Toutes les molécules n'absorbent pas forcément dans le domaine UV-visible, ce que l'on va faire pour les analyser en spectroscopie UV-visible, c'est leur greffer un groupement chromophore, avec cette technique on peut analyser tout type de composés. Si on veut faire de l'analyse quantitative la réaction de dérivation de transformation chimique effectué en amont de la mesure, il faut qu'elle soit : - Total - Rapide - Reproductible - Obtenir dériver stable - Graphe gauche Pointillé : après dérivation Trait pleins : analyse avant dérivation - Le composé absorbe dans le même domaine spectral que la matrice donc on ne peut pas faire la distinction. Donc on va faire dérivation en utilisant un chromophore qui absorbe à une longueur d'onde différente de celle de la matrice (on a décalage du pic d'absorption) - Graphe droite Avant dérivation : absorbance pas importante pour composer qui nous intéresse Après dérivation : absorbance plus importante (pointillé) c. [Analyse de pureté ] Lorsqu'on fait un dosage on va préparer gamme d'étalonnage avec produit de référence, on prépare solution de concentration croissante de solution croissante, on mesure l'absorbance, deux cas de figures : - Échantillon pure = dosage fiable - Échantillon pas pure ou impureté qui absorbe à la même longue d'onde de mesure = résultat erroné Il faut étudier en amont la pureté de substance Comment vérifier si substance est pure :  Si on mesure absorbance a la longueur d'onde en nanomètre Et si on mesure à la longueur d'onde 10nm l'absorbance a la longueur d'onde lambda/ absorbance lambda 10nm est constant si substance pure \(a) Si on a un mélange x + y le rapport des absorbances sera différent Si on regarde par chromatographie (b) Obtention d'un chromatogramme, on a le temps en abscisse et absorbance en ordonné on a différent pic Pour le premier pic : rapport absorbance est constant (1 seule molécule prélevé) Deuxième pic : dysmétrie donc plusieurs molécules prélevées d. [Analyse de mélange ] L'analyse de mélange s'inscrit dans le cadre de cette modalité des absorbances (loi d'additivité) Cas avec mélange de trois composés (a,b,c) : Premièrement on va analyser les spectres de chacun des composés du mélange et on sélectionne leur longueur d'onde maximal Ensuite on détermine coef extinction de chacune des substances (trois longueurs d'onde max) Quand on a le mélange chacune des longueur d'onde on a une absorbance qui correspond à la somme des absorbance de chacun des composés du mélange On a trois équations à trois inconnu et après il faut résoudre système d'équation à trois inconnues C'est indispensable pour faire ce type d'analyse quantitative, les spectres de chacun des composés soient bien différents 4. **[Spectrophotométrie dérivé ]** *Ne pas confondre avec dérivation qui greffe groupement chromophore sur la structure du composé =\> modification structurale !* Spectrophotométrie dérivé : traitement mathématiques du spectre (ordi qui fait) on obtient des dérivés d'ordre 1,2,3... l'intérêt de cette spectro dérivé est de mettre en évidence les petites différences que l'on présume quand on observe le spectre à l'œil nu Cette spectro met en évidence les faibles variations de pente au niveau du spectre d'ordre 0 et l'intérêt est d'améliorer la précision de la technique On a le spectre ordre 0 au début, et ensuite des dérivés d'ordre 1,2,3... Le spectre d'ordre 1 le max est le point d'inflexion au niveau de la pente montante du spectre et le minimum correspond au point d'inflexion au niveau pente descendante du spectre On va pouvoir faire dosage avec cette technique L'amplitude des maximums et minimums est fonction d'absorbance alors on va préparer solutions de concentrations croissantes, on va les analyser en spectrophotométrie classique et ensuite on fait traitement mathématique du signal pour obtenir par exemple la dérivé... Ceci permet d'établir courbe d'étalonnage et ensuite on analyse échantillon de concentration inconnu  - Exemple intérêt spectrophotométrie dérivé : Si bruit de fond important au niveau du spectre Elle sera sensible qu'au variations de pentes, que sur la partie entouré du graphe tableau  On met en évidence variation pente en exacerbant signal 5. **[Utilisation en chromatographie en phase liquide]** Chromatographie : on a un endroit où on injecte l'échantillon, un endroit où on sépare les composés du mélange et un endroit où on détecte composés séparé Les appareil spectrophotométrie UV-visible sont fréquemment utilisé comme détecteur de chromatographie en phase liquide