Obecná Mikrobiologie III. Část PDF

OBECNÁ MIKROBIOLOGIE III. ČÁST 2. ročník všeobecného lékařství MUDr. Radka Walková Ústav mikrobiologie FN Plzeň a LF UK v Plzni  Osnova 1. Mikroskopie 2. Kultivace bakterií a hub 3. Speciální kultivační techniky 4. Identifikace vyku...

OBECNÁ MIKROBIOLOGIE III. ČÁST 2. ročník všeobecného lékařství MUDr. Radka Walková Ústav mikrobiologie FN Plzeň a LF UK v Plzni  Osnova 1. Mikroskopie 2. Kultivace bakterií a hub 3. Speciální kultivační techniky 4. Identifikace vykultivovaných mikroorganismů 5. Kultivace virů  Cíle učení 1. Vyjmenujte mikroskopické metody používané v mikrobiologii a uveďte příklady jejich využití. Uveďte nejvýznamnější barvící techniku v bakteriologii. 2. Vyjmenujte kultivační podmínky bakterií. Uveďte základní rozdělení kultivačních půd podle konzistence a podle účelu. Popište formy růstu bakterií v tekutých a pevných kultivačních půdách. 3. Popište princip kultivace v uzavřeném systému. Popište princip zpracování moči, cévních katetrů a materiálů z dolních cest dýchacích. 4. Vyjmenujte metody identifikace mikroorganismů a vysvětlete jejich princip. 5. Popište hlavní odlišnost kultivace virů. Vysvětlete pojem cytopatický efekt. Mikroskopie  Mikroskopické metody + rychlé, jednoduché, (levné, dostupné) - málo citlivé  světelná (optická) mikroskopie pozorování ve světlém poli pozorování v tmavém poli fluorescenční mikroskopie  elektronová mikroskopie  Optická (světelná) mikroskopie rozlišovací schopnost: 0,25 µm maximální zvětšení: 1000x (10x okulár + 100x objektiv) světelný mikroskop - 3 spojné optické soustavy: osvětlovací soustava, objektiv, okulár  Pozorování ve světlém poli základní a nejjednodušší mikroskopická metoda světlo prochází pozorovaným objektem a soustava dvou spojných čoček vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz objekt má tmavé obrysy a nachází se ve světlém poli používá se u barvených nebo přirozeně pigmentovaných preparátů https://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus  Pozorování v tmavém poli = pozorování v zástinu objekt je osvětlený pouze ze stran a paprsky se od něho odrážejí a lámou → do objektivu se dostává světlo, které je rozptýlené předmětem objekt světle září na tmavém pozadí používá se zřídka pro průhledné nebarvené preparáty př.: rychlá diagnostika syfilis (viz obr.) https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid=10179  Fluorescenční mikroskopie využití fluorescenčních barviv (fluorochromů) – po absorpci UV paprsků emitují viditelné světlo delších vlnových délek lepší zvýraznění objektů zastoupených v nízké koncentraci př. využití: průkaz Mycobacterium tuberculosis či mykotických elementů ve vyšetřovaném materiálu; průkaz protilátek ze séra metodou imunofluorescence Foto ÚM FN Plzeň Foto ÚM FN Plzeň Foto ÚM FN Plzeň  Elektronová mikroskopie fotony jsou nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami mnohem vyšší rozlišovací schopnost než mikroskop světelný: 0,1 nm použití nejčastěji ve virologii https://www.vsb.cz/cs/detail-novinky?reportId=38767 https://www.microbiologybook.org/virol/rotaviruses.htm https://phys.org/news/2009-10-genomes-popular-strains-coli-sequenced.html  Typy mikroskopických preparátů Preparát z klinického vzorku Preparát z kultury mikroorganismy – nemusí tam být (mikroorganismy vypěstované na žádné, může tam být jeden i více kultivační půdě) druhů pouze mikrobiální buňky buňky makroorganismu – epitelie, leukocyty, erytrocyty… jiné struktury – hlen, fibrinová vlákna, buněčná drť … Haemophilus influenzae v čisté kultuře cizorodý materiál – např. textilní vlákna Haemophilus influenzae ve sputu https://www.semanticscholar.org/paper/M%C3%A9ningite-%C3%A0- https://microbe-canvas.com/Bacteria.php?p=1258 Haemophilus-influenzae-de-type-non-b-un-Rachidi-Moussair  Typy mikroskopických preparátů  Preparát nativní (nebarvený)  Preparát barvený ̶ nesuší se, nefixuje, překrývá se ̶ před barvením nutná fixace teplem krycím sklíčkem nebo chemikáliemi ̶ pozoruje se suchým objektivem ̶ prohlíží se bez krycího sklíčka při max. zvětšení 80x imerzním objektivem zvětšujícím Využití: 100x s použitím imerzní tekutiny, bakteriologie – minimální využití ve které je objektiv smočen mykologie – plísně Využití: parazitologie – vajíčka červů, bakteriologie – absolutní převaha cysty prvoků nad preparáty nativními mykologie – kvasinky parazitologie – prvoci http://old.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/sacch.htm https://microbeonline.com/candida-albicans-pathogenesis-diagnosis/  Mikroskopické techniky v bakteriologii  barvení dle Grama nejčastěji používaná a nejvýznamnější mikrobiologická barvicí technika dánský lékař Hans Christian Gram 1884 největší využití v bakteriologii – dělí běžné bakterie na grampozitivní barvící se modře a gramnegativní barvící se červeně (podle stavby buněčné stěny) Postup: 1. krystalová violeť 2. Lugolův roztok 3. odbarvení alkoholem nebo acetonem https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-Gram-staining 4. karbolfuchsin nebo safranin  Mikroskopické techniky v bakteriologii  barvení dle Ziehl – Neelsena barvení acidorezistentních tyčinek – hlavně mykobakterií Postup: obarvení karbolfuchsinem za horka odbarvení kyselým alkoholem (1% HCl v 70% etanolu) dobarvení methylenovou modří nebo malachitovou zelení  červené tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí https://www.123rf.com/photo_102830048_mycobacterium-positive-in-acid-fast-stain-sputum.html https://www.inds.co.uk/product/mycobacterium-tuberculosis-smear-from-positive-sputum-stained-after-ziehl-neelsen/  Mikroskopické techniky v bakteriologii  barvení bakteriálních pouzder dle Burriho metoda negativního znázornění – slizová pouzdra se neobarví  světlé dvorce kolem bakteriálních buněk Postup: bakteriální suspenze + čínská tuš tenký roztěr usušení, zafixování dobarvení bakteriálních buněk karbolfuchsinem nebo krystalovou violetí https://www.scicell.org/wp-content/uploads/2018/12/Enterobacteriaceae- predn%C3%A1%C5%A1ka.pdf  Mikroskopické techniky v mykologii  louhový preparát nativní preparát rutinně používaný v diagnostice dermatomykóz materiál (šupiny kůže, nehty, vlasy) se vloží do kapky 10 – 30% KOH na podložním sklíčku a překryje krycím sklíčkem pro lepší zvýraznění mykotických elementů lze přidat barvivo http://docplayer.cz/88977074-Lekarska-mykologie-bi3390-dermatofytozy-dermatomykozy.html vážící se na buněčnou stěnu hub (inkoust Parker, MykoInk)  laktofenolový preparát zhotovuje se z narostlé kultury plísně kultura se smísí na podložním sklíčku s laktofenolovou modří umožňuje sledovat uspořádání a septování vláken, hodnotit přítomnost a vzhled dalších charakteristických struktur (zejména makro- a mikrokonidií) https://fcagr.unr.edu.ar/wp-content/uploads/2015/05/04-2015-CCS.-SANIDAD-PRACTICA-Identific-de-hongos-de-semillas-Aspergillus  Mikroskopické techniky v mykologii  barvení dle Grama kvasinky jsou grampozitivní hyfy plísní jsou gramnegativní https://www.researchgate.net/figure/Photomicrograph-showing-a-septate-branching-hypha-arrow-of-Aspergillus-flavus-in_fig1_44590861  barvení pouzder kryptokoků dle Burriho metoda negativního znázornění – slizová pouzdra se neobarví  světlé dvorce kolem kryptokokových buněk kvasinky rodu Cryptococcus  Mikroskopické techniky v parazitologii  nativní preparát v parazitologii poměrně často užívaný zejména vyšetření stolice na přítomnost vajíček červů a cyst prvoků modifikace: tlustý nátěr dle Kato, flotační a vajíčka roupa dětského sedimentační metody  barvené preparáty vyšetření materiálu na přítomnost prvoků a jejich cyst Giemsa – Romanowski – krevní prvoci (plasmodia, babesie, trypanosomy…); MOP (mikrobiální obraz poševní) – prvok Trichomonas vaginalis cysta Entamoeba histolytica – trichrom – střevní prvoci barvení trichromem hematoxylin – střevní prvoci plasmodia v erytrocytech – barvení dle Giemsy-Romanowského Kultivace  Kultivační průkaz mikroorganismů zásadní význam v mikrobiologické diagnostice:  jednoznačné potvrzení přítomnosti mikroba ve vzorku  přesná identifikace  stanovení citlivosti k antimikrobiálním látkám největší využití v bakteriologii a mykologii  Historie kultivace bakterií nejprve tekuté kultivační půdy – masový vývar, komorová voda z očí jatečního dobytka… později pevné kultivační půdy – zakladatel Robert Koch (kolem r. 1880) – nejprve extrakt z hovězího masa zpevněný želatinou – problém: želatina se stává tekutou při teplotách nad 25 °C i vlivem bakteriálních enzymů – později želatina nahrazena agarem = polysacharid z mořských řas, rozpouští se až při 90 °C – používán dodnes Julius Richard Petri (1887) – zavedl pro kultivaci bakterií ploché skleněné misky s plochými víčky  Petriho misky – používané dodnes (plastové) https://www.janda-dental.cz/petriho-miska-sklenena--9-cm-x-15-mm/  Kultivační půdy 1. podle složení: a) půdy přirozené většina půd užívaných v lékařské mikrobiologii jejich základem je většinou živný bujon b) půdy syntetické sestaveny z chemicky definovaných sloučenin př. Czapek-Doxova půda k pěstování kvasinek a plísní  Kultivační půdy 2. podle konzistence: a) půdy tekuté rozplňují se do bakteriologických zkumavek, uzavírají se kovovou nebo vatovou zátkou výhoda: snadný přístup vody a živin k množícím se mikrobům  pomnožovací půdy nevýhoda: růst mikrobů se projeví zákalem, sedimentem nebo blankou  není poznat, zda je kultura čistá či smíšená bujony, BSK médium (Borrelia burgdorferi), Šulova půda (mykobakterie)… Foto ÚM FN Plzeň  Kultivační půdy b) půdy pevné připravují se ztužením tekutého základu přidáním 1 – 2 % agaru sterilizované agarové půdy se vylévají do Petriho misek, příp. do zkumavek, které se do zatuhnutí ponechají v šikmé poloze (tzv. šikmé agary) mikroby zde rostou ve formě izolovaných kolonií → lze rozpoznat čistou či smíšenou kulturu → lze vyizolovat jednotlivé kolonie mikrobů pro další práci → v některých případech lze mikroby identifikovat již podle morfologie kolonií Agary v Petriho miskách Příprava šikmých agarů http://147.33.74.135/knihy/uid_isbn-80-7080-534-X/pdf/179.pdf https://www.vovcr.cz/odz/zdrav/183/page15.html  Kultivační půdy 3. podle účelu: a) půdy základní ̶ vhodné k pěstování nenáročných bakterií ̶ spíše základ pro přípravu dalších typů půd  základní půda tekutá: živný bujon (masový extrakt + pepton + NaCl)  základní půda pevná: živný agar (živný bujon + agar) b) půdy obohacené ̶ základní půdy obohacené o bílkovinné koncentráty, hydrolyzáty, vitaminy, růstové faktory, sacharidy, krev, sérum…  obohacené půdy tekuté: BHI (Brain Heart Infusion) – dnes nejběžnější pomnožovací půda Šulova půda – obohacená hovězím sérem; k pěstování mykobakterií sérové bujony – k pěstování prvoků (např. trichomonád)  Kultivační půdy  obohacené půdy pevné: krevní agar – vzniká přidáním 5 – 10 % defibrinované ovčí krve k agarovému základu; nejběžnější půda používaná v lékařské mikrobiologii – roste na něm většina bakterií, umožňuje sledovat hemolytické vlastnosti vypěstovaných mikrobů: o viridace (alfa) – změna červeného hemoglobinu na zelený verdoglobin o úplná hemolýza (beta) – odbarvení a dokonalé projasnění KA kolem kolonie o neúplná hemolýza (beta) – červená barva se ztrácí, ale půda v zóně hemolýzy zůstává zakalená čokoládový agar – přidání krve do horkého agaru; k pěstování kultivačně náročných bakterií (př. hemofily, gonokoky..) Levinthalův agar – za horka zfiltrovaný čokoládový agar; průhledný Sabouraudův agar – obohacený cukrem (glukóza, maltóza, dextróza); k pěstování kvasinek a plísní vaječné půdy – obsahují roztřepaná vejce; koagulované teplem; šikmo nalité ve zkumavkách; k pěstování mykobakterií Typy hemolýzy na krevním agaru Úplná beta hemolýza Alfa hemolýza (viridace) https://www.wikiskripta.eu/w/Krevn%C3%AD_agar Neúplná beta hemolýza http://www.bacteriainphotos.com/Streptococcus%20pneumoniae.html http://www.medical-labs.net/colonies-of-staphylococcus-aureus-on-blood-agar-819/  Kultivační půdy c) půdy selektivní ̶ základní nebo obohacené půdy s přidanou inhibiční složkou, která ve směsi bakterií potlačí bakterie nežádoucí a umožní dobrý růst hledané skupiny nebo druhu bakterií  tekuté selektivní půdy: – slouží k pomnožení některých patogenů z klinického materiálu selenitová půda – seleničitan sodný – salmonely alkalická peptonová voda – pH 8,6 – Vibrio cholerae  pevné selektivní půdy: CNA agar – krevní agar s obsahem dvou ATB (kolistin a kys. nalidixová), která potlačují růst g- bakterií agar s 10 % NaCl – stafylokoky Löwenstein-Jensenova půda – vaječná půda s přídavkem malachitové zeleni – mykobakterie  Kultivační půdy d) půdy diagnostické ̶ půdy, na nichž lze prokázat některé vlastnosti mikrobů a na základě toho lze určit druh mikroba ̶ obsahují specifický substrát, který se v důsledku metabolismu mikroba charakteristicky mění – změny substrátu jsou patrné buď rovnou, nebo se ozřejmí indikátorem štěpení různých substrátů (např. cukrů, močoviny…)  změna pH  barevná změna indikátoru tvorba specifických produktů (např. H2S, indol…) schopnost asimilace substrátu (např. citrát jako jediný zdroj uhlíku, různé cukry u kvasinek…) růst mikroba v přítomnosti různých látek průkaz pohyblivosti mikroba chromogenní půdy – pevné půdy obsahující chromogenní substráty (po rozštěpení příslušným enzymem vzniká barevná sloučenina)  kolonie mikrobů jsou na těchto půdách typicky zbarveny  Chromogenní půdy UTI – půda pro diferenciaci hlavních patogenů močových cest https://www.bio-rad.com/en-cz/product/candiselect-agar https://www.carlroth.com/com/en/chromogenic-media/uti-chromogenic-agar  Kultivační půdy e) půdy selektivně diagnostické ̶ kombinace principů půd selektivních a diagnostických: obsahují inhibitor růstu nežádoucích mikrobů + vhodný substrát a indikátor jeho změn ̶ k vyšetření vzorků, u nichž předpokládáme přítomnost patogena ve směsi s velkým množstvím průvodní mikroflóry (stolice, pitevní materiál…)  selektivně diagnostické půdy pro g- tyčinky: Endova půda – inhibitorem růstu g+ bakterií je bazický fuchsin; diagnostickým znakem je štěpení laktózy – bakterie štěpící laktózu rostou na EA v tmavorudých koloniích (často s kovovým leskem), bakterie neštěpící laktózu rostou na EA v bezbarvých průsvitných koloniích MacConkeyho půda – inhibitorem růstu g+ bakterií jsou žlučové soli; dg. znakem štěpení laktózy půda XLD (xylóza, lysin, deoxycholát, thiosíran sodný) – salmonely a shigely  Kultivační půdy  selektivně diagnostické půdy pro g+ bakterie: SB agar (Slanetz-Bartley) – enterokoky – půda obsahuje azid sodný (tolerují pouze enteroky, pro ostatní mikroby toxický) + tetrazoliumchlorid (jeho redukce barví enterokoky do růžova až karmínova) žluč-eskulinový agar – enterokoky – žlučové soli (inhibují většinu g+ bakterií) + eskulin (enterokoky hydrolyzují eskulin za vzniku hnědočerné sraženiny) stafylokokový agar – vysoká koncentrace NaCl (inhibuje růst většiny bakterií kromě stafylokoků) + mannitol (rozlišení druhů stafylokoků) Claubergova půda – Corynebacterium diphtheriae – telluričitan draselný (inhibuje růst g- bakterií a difterickými korynebakteriemi je redukován na kovový tellur → C. diphtheriae roste v modročerných kovových koloniích obklopených modrých dvorcem)  Kultivační půdy f) půdy k anaerobní kultivaci ̶ nízký oxidoredukční potenciál  tekuté půdy: VL-bujon (maso-kvasničný), Schaedlerův bujon (hemin, cystein)…  pevné půdy: VL-agar, Schaedlerův agar, Fortnerův agar, SNVS agar (selektivní pro g- anaerobní tyčinky)… g) půdy k testování citlivosti mikrobů vůči antimikrobiálním látkám  tekuté půdy ̶ používají se ke stanovení minimálních inhibičních koncentrací (MIC) MH-bujon (Muellerův-Hintonové)  pevné půdy ̶ používají se ke zjišťování citlivosti mikrobů na ATB diskovým difusním testem MH-agar (Muellerův-Hintonové)  Kultivační půdy f) půdy udržovací (konzervační) ̶ slouží k zachování životaschopnosti mikroorganismů po delší dobu ̶ nutričně chudé půdy, bez přítomnosti sacharidů – kyseliny vznikající při jejich štěpení by mikrobiální kulturu zahubily g) půdy transportní – cílem je udržet mikroby naživu během transportu do laboratoře – kvůli dostatečné vlhkosti bývají tekuté nebo polotuhé – místo živin obsahují látky, které omezují množení mikrobů – obsahují látky, které absorbují toxické produkty metabolismu (např. aktivní uhlí) Stuartovo transportní médium Amiesovo transportní médium  Kultivační půdy Nejpoužívanější kultivační půdy v mikrobiologii: Krevní agar – nejběžnější kultivační půda v lékařské mikrobiologii – roste na něm většina lékařsky významných bakterií – živný agar obohacený ovčími erytrocyty Čokoládový agar – hemolyzovaný krevní agar k pěstování kultivačně náročných bakterií Endův agar/MacConkeyho agar – selektivně diagnostická půda pro g- tyčinky CNA agar – selektivní půda pro g+ bakterie Sabouraudův agar – agar s cukrem k pěstování kvasinek a plísní  Kultivační podmínky  Voda nezbytná součást živé hmoty základní složka všech biochemických reakcí, nutná podmínka pro vstřebání živin  základní složka všech kultivačních půd  Živiny, růstové faktory, zdroje energie všechny patogenní mikroorganismy jsou chemoheterotrofní = energii i živiny získávají štěpením organických chemických látek zdroje energie – sacharidy (nejč. glukóza) živiny = látky, které mikrobům slouží hl. jako zdroj uhlíku a dusíku – aminokyseliny a peptidy – masový extrakt, enzymatické bílkovinné štěpy (peptony), jiné bílkovinné hydrolyzáty růstové faktory – vitamíny, minerály, koenzymy, kofaktory… – masový extrakt, kvasničný extrakt, krev, sérum  Kultivační podmínky  Optimální pH většina patogenních bakterií vyžaduje neutrální pH 7,2 – 7,4 optimální pH musí být udrženo během celé doby kultivace  Optimální teplota pro většinu lékařsky významných bakterií 36 – 37 °C biologické termostaty = inkubátory  Vhodné složení atmosféry pro většinu patogenních bakterií je vyhovující běžné složení atmosféry – termostaty bakterie mikroaerofilní (vyžadují sníženou tenzi O2) a kapnofilní (vyžadují vyšší tenzi CO2) – termostaty s řízeným složením atmosféry bakterie anaerobní – anaerostaty (hermeticky uzavíratelné nádoby, v nichž se bezkyslíkaté prostředí vytváří pomocí chemického generátoru plynů), anaerobní boxy Ochrana před zářením, sterilita prostředí Mikrobiologické termostaty: skříňové (viz obr.) nebo komorové https://www.bmt.cz/laboratorni-inkubatory-termostaty-29 https://www.verkon.cz/termostat-inkubator-q-cell/ Anaerostat http://fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob/3.html Anaerobní box Foto ÚM FN Plzeň  Průběh kultivace 1. očkování = inokulace infekčního materiálu na kultivační půdu sada půd dle druhu materiálu a diagnózy přesné označení půdy protokolovým číslem nanesení (inokulace) vzorku na kultivační půdu: stěry a výtěry na vatových tamponech se nanáší přímo, ostatní materiály sterilní bakteriologickou kličkou rozočkování sterilní bakteriologickou kličkou (tzv. „křížový roztěr“ viz obr.): cílem je získání izolovaných mikrobiálních kolonií (nutné pro další práci) http://www.biomerieux-culturemedia.com/product/30-columbia-agar-+-5-percent-sheep-blood s.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/js17/cviceni_mikrobiologie/web/pages/steril_prace_ockovani_uchovavani.html  Průběh kultivace 2. kultivace v optimální teplotě a atmosféře nejčastěji 24 – 48 hodin při 37 °C v běžné atmosféře (většina bakterií a kvasinek) anaerobní bakterie 48 – 72 hod při 37 °C v anaerobních podmínkách, mykobakterie 6 – 9 týdnů při 37 °C, dermatofyty 3 – 6 týdnů při 27 °C … 3. odečet = hodnocení vykultivovaných mikroorganismů a rozhodnutí o dalším postupu: nic identifikace stanovení citlivosti k antimikrobiálním látkám (průkaz specifických faktorů virulence – většinou se provádí v Národní referenční laboratoři pro dané infekční agens) Foto ÚM FN Plzeň  Růst bakterií na pevných kultivačních půdách a jeho hodnocení na pevných kultivačních půdách rostou mikroby v podobě kolonií mikrobiální kolonie = společenství buněk vzniklé na povrchu pevné kultivační půdy z původně jedné mikrobiální buňky – stovky miliard buněk  makroskopický útvar viditelný pouhým okem za konstantních podmínek je vzhled kolonií charakteristický pro určitou skupinu nebo rod, případně i druh mikroorganismů  hodnocení morfologie kolonií představuje důležitý diagnostický krok při posuzování bakteriálních kolonií se hodnotí deset různých znaků:  Růst bakterií na pevných kultivačních půdách a jeho hodnocení 1. Velikost – vyjadřuje se průměrem v mm (většinou 1 až 5 mm) 2. Tvar – pravidelně okrouhlý, oválný, nepravidelně laločnatý… 3. Okraje – rovné, zvlněné, vykousané… 4. Profil – plochý, vypouklý, pupkovitý, miskovitý… 5. Povrch – lesklý, hladký, matný, drsný, zvrásnělý… 6. Transparence – kolonie průhledná, průsvitná, neprůsvitná 7. Barva – kolonie bezbarvé nebo barevné (většinou šedobílé); barva závisí na produkci pigmentů ale i na kultivační půdě – diagnostické půdy obsahují indikátor, který difunduje do bakterií a v závislosti na jejich pH mění svou barvu 8. Konzistence – mazlavá, máslovitá, drobivá, vosková, hlenovitá… 9. Zápach – značně subjektivní znak (fekální, hnilobný, kyselý, nasládlý, ovocný, po jasmínu…) 10. Změny okolí – zbarvení dvorce, hemolýza na KA Růst bakterií na kultivačních půdách a jeho hodnocení  Růstové fáze kolonie téhož bakteriálního druhu mohou mít na pevných půdách různý charakter tzv. růstové (disociační) fáze zpravidla se rozeznávají tři základní růstové fáze: M, S, R fáze, v níž roste určitý bakteriální kmen, není jeho stabilní vlastností a může se měnit řadou vlivů – např. opakované pasážování kultury na pevných půdách nebo na nevnímavých jedincích vede k postupné degradaci původní M-fáze ve fázi S nebo R; naopak pasážování na vnímavých jedincích (vhodná laboratorní zvířata) vede ke zvýšení virulence kmene a přechodu z fáze R nebo S do M-fáze  Růstové fáze  M-fáze (mucous = hlenovitý) kolonie hlenovitého vzhledu a konzistence, mají tendenci se slévat v preparátu z těchto kolonií jsou bakterie opouzdřené mikroby rostoucí v této fázi jsou zpravidla nejvirulentnější  S-fáze (smooth = hladký) kolonie hladké, lesklé a plošší než kolonie v M-fázi bakterie nemají pouzdra virulence kmenů v S-fázi je nižší než kmenů v M-fázi  R-fáze (rough = drsný) kolonie s drsným povrchem, nepravidelnými okraji, často rozbrázděné, s vyvýšeným středem virulence těchto mikrobů je nízká až žádná  Růstové fáze https://is.muni.cz/el/1411/podzim2016/VLLM0522c/um/50564877/65241700/P02_strep.pdf?lang=cs Streptococcus pneumoniae v S-fázi Streptococcus pneumoniae v M-fázi https://www.microbiologyinpictures.com/bacteria%20photos/streptococcus%20p neumoniae%20photos/STPN17.html Streptococcus pneumoniae v R-fázi Speciální kultivační techniky  Kultivace v uzavřeném systému materiál je odebrán do odběrové soupravy (lahvičky) s kultivačním médiem již na klinickém pracovišti lahvička je vložena do přístroje (termostatu) v termostatu probíhá automaticky sledování metabolické aktivity v lahvičce (různé principy detekce změn koncentrace CO2) pozitivita je hlášena zvukovým a světelným signálem lahvička se vyjme z přístroje a dále se manuálně zpracovává: mikroskopický preparát + vyočkování na pevné kultivační půdy, následně identifikace Příklad použití: hemokultivace (= kultivace krve) tekuté materiály (likvor, výpotky) kultivace M. tuberculosis + vysoká senzitivita, úspora práce - větší ekonomická náročnost  Kultivace v uzavřeném systému Foto ÚM FN PLzeň Foto ÚM FN Plzeň https://www.dufortlavigne.com/en/produit/BEC442023 https://www.biomerieux-usa.com https://www.biomerieux-usa.com https://www.biomerieux-usa.com  Kultivace moči  Nezáleží pouze na přítomnosti mikrobů, ale na kvantitě!  Semikvatitativní kultivace („kvantitativní bakteriurie“) počet CFU (Colony Forming Units) v 1 ml moči klinicky významná bakteriurie u dospělých 105/ml  Interpretace nálezu v souvislosti s: druhem nalezené bakterie (patogen?) počtem nalezených druhů (infekce X kontaminace) nálezem v sedimentu (leukocyty…) stavem pacienta (diagnóza, věk, pohlaví…)  Kultivace moči – techniky 1. Inokulace moči na pevnou půdu pomocí 1 μl kalibrované kličky 1 kolonie = 103 mikrobů (CFU) v 1 ml moči 10 kolonií = 104 mikrobů v 1 ml moče 100 kolonií = 105 mikrobů/1 ml 1000 kolonií = 106 mikrobů/1 ml 10000 kolonií = 107 mikrobů/1 ml V https://www.novolab-labware.com/calibrated- loops-plastic-1l-sterile-1.html https://www.dutscher.com/frontoffice/product?produitId=0D-03 -22C Foto: ÚM FN Plzeň  Kultivace moči – techniky 2. Destičky s kultivační půdou rozdělenou do šesti sekcí http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/bak/uceb/obsah/moc/moc.htm  Kultivace moči – techniky 3. Uricult kultivační půda je součástí odběrové soupravy kultivace začíná ihned po odběru → Uricult se nedává do ledničky, ale ponechává se při pokojové teplotě https://www.roche.de/diagnostik-produkte/ produktkatalog/tests-parameter/uricult-uricult-plus/ http://www.vetbact.org/popup/ image.php?imgtable=vetbact_images&imgid=442 http://www.urolexikon-a-z.asbh-stiftung.de/index.php/buchstaben/buchstabe-e/417-einschleichen- eintauchnaehrboden-einzeldosis-einzelniere  Kultivace cévních katetrů Terminální konec katetru cca 4 cm dlouhý, ve sterilní zkumavce Celá řada technik zpracování: kvalitativní metoda – ponoření špičky katetru do bujonu semikvantitativní metoda – rolování špičky katetru po povrchu pevné kultivační půdy kvantitativní metody – proplachování lumen katetru, sonifikace, vortexování Hodnocení: počet CFU/katetr (nelze u kvalitativní metody) Interpretace: prahová hodnota pozitivity je různá dle použité metody https://www.polymedicure.com/central-venous-catheters/  Kultivace cévních katetrů – techniky 1. kvalitativní metoda nejjednodušší ponoření katetru do bujonu po 24hodinové kultivaci vyočkování bujonu na pevnou kultivační půdu výhoda: umožňuje průkaz mikrobů z povrchu i z lumen katetru (ne spolehlivě – mikroby z biofilmu se nemusí uvolnit) nevýhoda: pouze kvalitativní metoda – neumožňuje stanovit počet mikrobů!  Kultivace cévních katetrů – techniky 2. semikvantitativní metoda (dle Makiho) nejčastěji používaná rolování katetru po kultivační půdě (krevní agar) interpretace – dle počtu CFU a druhu bakterie: méně než 15 CFU/katetr – susp. kontaminace více než 15 CFU/katetr – signifikantní nález https://www.researchgate.net/figure/Semiquantitative- culture-of-catheter-tip-on-blood-agar-showing-15- nevýhody metody: cfu_fig1_221843466 mapuje pouze povrch katetru, nevypovídá o mikrobech v lumen → doplňuje se metodou pomnožení v bujonu mikroby v biofilmu se nemusí vůbec uvolnit – možnost falešně negativního nálezu nebo falešně nízké kvantity  Kultivace cévních katetrů – techniky 3. kvantitativní metoda pomocí sonifikace rozrušení struktury biofilmu pomocí ultrazvuku sonifikace katetru ponořeného do 10 ml bujonu a následné vyočkování 100 μl suspenze na pevnou kultivační půdu (krevní agar) hodnocení – počet CFU/ml  počet CFU/katetr interpretace – signifikantní nález > 102 – 103 CFU/katetr https://eur.vevor.com/products  Kultivace materiálů z dolních cest dýchacích sputum tracheální aspirát bronchoalveolární laváž (BAL) V případě sputa nejprve hodnocení validity sputa: makroskopicky mikroskopicky poměr polymorfonukleárních leukocytů a dlaždicových epiteliálních buněk přítomnost hlenu bakteriální flóra – nevalidní sputum podle okolností vyřazeno ze zpracování  Kultivace materiálů z DCD – techniky 1. Standardní kvalitativní kultivace vyočkování neředěného vzorku na pevné kultivační půdy: krevní agar + čokoládový agar (+ Endův agar) 2. Kvantitativní kultivace homogenizace materiálu pomocí mukolytika a třepačky naředění materiálu fyziologickým roztokem vyočkování materiálu v několika ředěních zhodnocení počtu kolonií v jednotlivých ředěních a přepočet na CFU v 1ml klinicky významná kvantita 105 – 106 Hodnocení kvantitativně zpracovaného sputa Ředění Počet kolonií Počet mikrobů 10-3 10 106 100 107 10-5 10 108 100 109 10-7 10 1010 100 1011  Kultivace tkáně Záleží na zdroji, velikosti a indikaci (pitevní materiál x excize z kůže…) Pitevní materiál povrch bloku tkáně se opálí (vysterilizuje), rozřízne vlastní odběr na kultivaci se provede z nitra bloku Drobné kousky rozmělnění a následné vyočkování na kultivační půdy + mikroskopie + založení pomnožení v bujonu Indikace vyšetření z invazivního odběru vždy promyslet – je nenahraditelný Identifikace  Identifikace vykultivovaných mikrobů  Orientační identifikace dle morfologie Princip: makroskopické hodnocení kolonií, mikroskopický obraz  Biochemické testy Princip: stanovení biochemické aktivity zkoumaného kmene  Antigenní analýza Princip: stanovení přítomnosti specifických antigenních struktur sérologickými metodami  Hmotnostní spektrofotometrie Princip: identifikaci mikroorganismů na základě analýzy molekulové hmotnosti jejich proteinů  Molekulárně genetické metody Princip: analýza DNA – nejčastěji PCR a následná sekvenční analýza  Biochemické testy  ve zkumavkách pestrá řada cukrů – průkaz schopnosti mikroba využívat různé druhy cukrů (glukóza, laktóza, sacharóza, ribóza, manitol, sorbitol, inositol…) krátká řada biochemických testů – identifikace enterobakterií (zkvašování glukózy + tvorba plynu, tvorba H2S, štěpení močoviny, utilizace citrátu, tvorba indolu) Foto: ÚM FN Plzeň  Biochemické testy  komerční mikrotesty provedení v mikrotitračních destičkách nebo v plastových komůrkách 1 souprava = několik různých testů soupravy pro identifikaci enterobakterií, nefermentujících tyčinek, anaerobů, stafylokoků, streptokoků a enterokoků, kvasinek hodnocení po 24 hodinách kultivace podle barevné srovnávací stupnice pro daný test součet bodů pozitivních testů = specifický kód identifikace mikroba pomocí kódové knihy nebo počítačového programu identifikační index – určuje spolehlivost identifikace  ENTEROtest API test https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/js17/cviceni_mikrobiologie/web/pages/identifikace_bakterii.html https://microbiologyinfo.com/api-20e-test/ https://tvp.vscht.cz/files/uzel/0018868/C_B0d4z3zcwuyk_KTMzJy1TITEnNK8lMy8xOTE5VAEv4OJakFpdUAgA.pdf?redirected https://sites.google.com/site/jordanbiol250/home/protocols/api-20e-system http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/bak/uceb/obsah/ident/ident.htm  Antigenní analýza Využití: identifikace jednotlivých bakteriální druhů rozlišení sérotypů v rámci jednoho bakteriálního druhu Druhy antigenů: tělové (O) a bičíkové (H) antigeny: g- tyčinky (např. enteropatogenní sérotypy Escherichia coli, sérotypy salmonel, druhy shigel…) antigeny pouzdra: rozlišení sérotypů hemofilů, pneumokoků, meningokoků… řada jiných antigenů – skupiny betahemolytických streptokoků, identifikace Staphylococcus aureus…  Antigenní analýza Metody: sklíčková aglutinace s použitím antisér proti různým antigenům vyšetřovaného mikroba (viz obr. vlevo) aglutinace na kartičce – např. určení skupiny betahemolytických streptokoků (viz obr. vpravo) https://slideplayer.cz/slide/12011556/ https://www.bioz.com/result/pastorex%20strep%20kit/product/Bio-Rad  Hmotnostní spektrofotometrie  Hmotnostní spektrofotometrie MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight) metoda umožňující identifikaci mikroorganismů na základě analýzy molekulové hmotnosti jejich proteinů v mikrobiologii využívána od 90. let 20. století rychlá, levná (X pořizovací cena přístroje), jednoduchá a spolehlivá identifikační metoda https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microbiology-and-diagnostics/microbial-identification.html  Hmotnostní spektrofotometrie Stavba hmotnostního spektrometru: 1. iontový zdroj sloužící k ionizaci proteinů a jejich převedení do plynné fáze (laser) 2. hmotnostní analyzátor, který třídí ionty podle jejich hmotnosti 3. detektor monitorující dopadající roztříděné ionty http://www.mayomedicallaboratories.com  Hmotnostní spektrofotometrie Princip a postup: Část kolonie mikroorganismů se nanese na speciální kovový terčík a převrství matricí. Matrice obsahuje organické rozpouštědlo, které z mikroorganismů extrahuje jednotlivé bílkoviny. Dále obsahuje malé molekuly organických kyselin se silnou optickou absorbancí, která koreluje s vlnovou délkou laseru použitou k ionizaci částic. Poté co laser hmotnostního spektrometru ozáří směs matrice se vzorkem, absorbuje matrice energii z laseru a uvolní protony, které plynule přenese na extrahované bílkoviny. Tím dojde šetrné desorpci, ionizaci a odpaření analyzovaných částic. Ionizované molekuly jsou elektrostaticky urychleny a proletí trubicí přístroje, v níž je vakuum, rychlostí, která je úměrná jejich hmotnosti a velikosti náboje. Změřením doby jejich letu pomocí detektoru na konci trubice lze přesně změřit rychlost jednotlivých iontů a z té pak vypočítat jejich molekulární hmotnost. Molekulární hmotnosti všech analyzovaných iontů dohromady vytváří hmotové spektrum, které je druhově specifické. Mikroorganismy pak lze identifikovat srovnáním jejich hmotového spektra se spektry uloženými v referenční databázi. Míra shody změřeného spektra s některým z referenčních spekter je vyjádřena tzv. identifikačním indexem, jehož hodnota určuje spolehlivost identifikace.  Hmotnostní spektrofotometrie Ukázka hmotnostních spekter https://www.bc-diagnostics.com/maldi-tof-ms-biotarget-96/ https://www.researchgate.net/figure/Spectra-of-four-Vibrio-species-generated-by-the-Bruker- Biotyper-MALDI-TOF-MS-system-The_fig2_262882957 Identifikační index určující spolehlivost MALDI-TOF MS identifikace Rozsah skóre Popis 2,300 - 3,000 Vysoce pravděpodobná identifikace druhu 2,000 - 2,299 Pravděpodobná identifikace druhu 1,700 - 1,999 Pravděpodobná identifikace rodu 0,000 - 1,699 Nespolehlivá identifikace Kultivace (izolace) virů  Kultivace (izolace) virů zcela odlišná od kultivace bakterií a hub viry jsou obligátně intracelulární parazité – při svém množení jsou zcela závislé na zdrojích a proteosyntetickém aparátu hostitelské buňky  množí se pouze v živých buňkách k izolaci virů lze použít: o pokusné zvíře o kuřecí embrya o buněčné (tkáňové) kultury v běžné lab. diagnostice se příliš neužívá nahrazena molekulárně genetickými metodami  Buněčné (tkáňové) kultury Typy buněčných kultur: 1. primární kultury: buňky získané přímo z živočišných tkání – směs různých typů buněk; diploidní = dvojitá sada chromozomů; omezená schopnost dělení a životnost kultury; kultivace širokého spektra virů 2. sekundární kultury (buněčné kmeny): získávají se z primárních buněk pasáží; jeden vyselektovaný typ buněk; diploidní; životnost několik desítek pasáží; kultivace užšího spektra virů 3. buněčné linie: povaha nádorových buněk; haploidní = 1 sada chromozomů; nekonečné množství pasáží = „nesmrtelné“; kultivace úzkého spektra virů Nejčastěji používané buněčné kultury: HeLa – buňky z karcinomu děložního čípku (Henrietta Lacksová †1951) Vero, MK2 – buňky z ledvin kočkodana zeleného MDCK – buňky z psích ledvin LEP – lidské embryonální plíce  Buněčné (tkáňové) kultury Kutivační podmínky TK: živiny voda (redestilovaná ve skle) stálé pH (rozmezí 6,8 – 7,8, optimum 7,2 – 7,4) teplota 37 °C antibiotika a antimykotika (zábrana bakteriální a plísňové kontaminace) eliminace toxických vlivů (těžké kovy, detergenty…) → speciální laboratorní sklo, plasty vhodné pro TK Druhy médií: růstová – umožňují množení buněk udržovací – k uchování narostlých buněk odběrová – k uložení a transportu odebraného vzorku  Buněčné (tkáňové) kultury Roux láhev k pěstování buněk Zkumavky s plochou stěnou k izolaci virů na TK https://www.dreamstime.com/photos-images/tissue-culture-flask.html Foto: ÚM FN Plzeň Vero buňky MDCK https://www.britannica.com/science/tissue-culture https://www.researchgate.net/figure/Monolayered-Vero-cell-culture-a-and-MDCK-cell-culture-b_fig1_255177203  Průkaz viru pomnoženého na TK cytopatický efekt (CPE) = změna vzhledu buněk infikovaných virem; pozoruje se světelným mikroskopem; může být specifický nebo nespecifický interference = jev, kdy jeden virus brání množení druhého – zdánlivě normální tkáňová kultura, v níž je pomnožený necytopatogenní virus, je rezistentní k pozdější infekci jiným, spolehlivě cytopatickým virem hemadsorbce = průkaz virů, které mají na svém povrchu hemaglutinin – buňky, v nichž se pomnoží takovýto virus, na svůj povrch adsorbují přidané erytrocyty (hl. viry chřipky)  Přesná identifikace izolovaného viru specifický cytopatický efekt neutralizační testy – zábrana CPE nebo zábrana hemadsorbce vlivem známého specifického antiséra průkaz virového antigenu pomocí značených protilátek – nejčastěji metodou imunofluorescence průkaz virové DNA/RNA pomocí PCR/RT-PCR elektronová mikroskopie – vzácně Cytopatický efekt na tkáňových kulturách LEP – negativní LEP – CMV https://www.cytosmart.com/resources/virus-induced-cytopathic-effect Foto ÚM FN Plzeň https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/VR-734.aspx?geo_country=cz Děkuji za pozornost