Mikrobiologie Zusammenfassung PDF

MIKROBIOLOGIE VO1 – Einführung Mikroorganismen Mikroorganismen - erste Organismen vor ca. 3,8 Mrd. Jahre Vielzeller erst vor ca. 600 Mio. Jahren Homosapiens vor ca. 130 000 Jahren Progenot = Urvorstufe → 3 Domänen: Bakterien, Archaea, Eucaryoten (Einteilung aufg...

MIKROBIOLOGIE VO1 – Einführung Mikroorganismen Mikroorganismen - erste Organismen vor ca. 3,8 Mrd. Jahre Vielzeller erst vor ca. 600 Mio. Jahren Homosapiens vor ca. 130 000 Jahren Progenot = Urvorstufe → 3 Domänen: Bakterien, Archaea, Eucaryoten (Einteilung aufgrund RNA- Sequenzvergleich) Mikroorganismen: Bakterien, Archaea, Pilze, Mikroalgen, Protozoen, Viren 1837 skizzierte Darwin 1. Stammbaum des Lebens (Arten, die sich aufspalten) Phylogenese = Stammesgeschichte (stellt evolutionäre Geschichte zwischen zwei Arten her) Phylogenetischer Stammbaum: Knoten = gemeinsamer Vorfahre; Kantenlänge geben Verhältnis der Zeit an Systematische Kategorien der Bakteriologie: Domäne Bacteria Bacteria Abteilung/Stamm Actinobacteria Proteopacteria Klasse Actinobacteria Epsilonproteobacteria Ordnung Actinomycetales Campylobacteaceae Familie Mycobacteriaceae Helicobacterales Gattung Mycobacterium Helicobacter Art M. tuberculosis H. pylori (ceae = häufige Endung der Familie) Anzahl an Mikroorganismen übertreffen alle anderen Spezies Mikroorganismen 70% der Biomasse (gesamte organische Substanz) Wichtige Bedeutung für Ökologie, Medizin, Biotechnologie, Gentechnologie, Evolution, Agrarbiologie Unterschiede Bakterien & Archaea Unterschiede in Zellwand, Membran, Lipide, Stoffwechsel, DNA/RNA-Sequenzen Alle krankheitserregenden Prokaryoten sind Bakterien Archaea sind nicht sensitiv gegenüber Antibiotika Archaea sind Eukaryoten ähnlicher als Bakterien Typische Bakterien: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis Typische Archaea: extrem Thermophile & Methanproduzenten: Picrophilus torridus, Methanocaldococcus jannaschii Bakterium Hefe Humane Zelle Durchmesser (µm) 1 10 100 Volumen (µm3) 1 1000 10 000 Oberfl.-Volumen-Vh. 1 0,1 Je nachdem Generationszeit (h) 0,3 – 1 2 >20 Systematik Prokaryot Eukaryot Eukaryot Soffwechsel Gr. Vielfalt Einheitlich Einheitlich Entwicklung Mikrobiologie Früher Krankheiten Gottesstrafe 1676: Anthony van Leeuwenhoek baute 1. Mikroskop (Zahnbelag kleine, sich fortbewegende Tiere) 1828: Otto Friedrich Müller Begriff: Bakterium (aus gr. Bazille/Stäbchen) 1847: Ignaz Philipp Semmelweis für Hygiene in KHs (Hände Überträger) 1822-1895: Louis Pasteur entwickelt Impfstoffe, entdeckte Pasteurisierung (erhitzen auf 60-70°C) 1843-1910: Robert Koch kultivierte Milzbranderreger & entdeckte Mycobacterium tuberculosos Koch’sche Postulate Erreger muss im kranken Tier nachgewiesen werden (Mikroskop) Erreger muss in Reinkultur gebracht werden „reiner“ Erreger muss in gesundem Tier gleiche Krankheit auslösen Erreger muss wieder isolierbar sein →Postulate treffen nicht auf alle Erreger (z.B. Viren und Protozoen) zu Bedeutung von Mikroorganismen Anzahl übertrifft alle andere Spezies Stellenmit 70% den größten Anteil an Biomasse (gesamte organische Masse) dar Bedeutung Medizin und Ökologie Geochemische Stoffkreisläufe (z.B. Bodenbakterien = Destruenten, Nährsalze) Beeinflussen globales Klima (Stoffwechsel C & N, Erzeugung O2) Cyanobakterien betreiben Photosynthese → photoautotroph, bilden gemeinsam mit Grünalgen und anderen als Phytoplankton Nahrungsgrundlage vieler Ökosysteme Bakterien können als Symbionten im Darm und in der Verdauung und weiteren physiologischen Vorgängen vieler Lebewesen vorkommen Mensch besteht aus 10^13 Zellen und ist Träger von 10-100-mal so vielen Bakterien (0,5-1kg) Mensch rund 10 Billionen Bakterien im Mund Auf Haut (durchschnittliche Hygiene) ca. 10^12 Bakterien (Nahrung: Hautschuppen, Mineralstoffe, Lipide) → Hautflora = wichtige Schutzbarriere 99% aller mit uns lebenden Arten → Darmflora (mindestens 400 Arten) → wichtig für Verdauung, Immunsystem Bakterien in Darmflora: Verdauung, Immunsystem, produzieren Vitamine (Biotin, Vitamin K, Folsäure), vermindern die Ansiedlung von Pathogenen Bakterien in der Hautflora: Schutzbarriere Krankheitserreger: Karies, eitrige Entzündungen, Sepsis, Entzündung von Organen, Hirnhautentzündung Hygiene: o Sterilisation (med. Geräte keimfrei machen) o Desinfektion (Zahl der Bakterien auf Haut/ Gegenständen kann vermindert werden) o Herstellung und Entwicklung von Antibiotika o Operationen mir Eröffnung und Säuberung von Eiterherden Biotechnologische Bedeutung Produktion wichtiger Stoffe, wie Antibiotika, Enzyme, Gentherapien, Antikörper Nahrungsmittelproduktion Beseitigung problematischer Abfälle (z.B Abwasserreinigung, Beseitigung giftiger organischer Substanzen) Industrie z.B Enzymzusätze in Waschmittel ➔ Strenge gesetzliche Regelungen Gentechnologische Bedeutung Moderne molekularbiologische Methode zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen Isolierung, Charakterisierung und Neukombination von Erbmaterial Wichtig für die Biotechnologie, z.B. Herstellung rekombinanter Stoffe (z.B. Insulin) Wichtig in der Forschung, z.B. Untersuchung einzelner Proteine ➔ Strenge gesetzliche Regelungen Hilfsmittel Stereomikroskop: getrennter Strahlengang für beide Augen (bis 40x) Lichtmikroskop (zusammengesetztes Mikroskop): 2 Linsensysteme (bis zu 1000x) (Okular 10-fach) Elektronenmikroskop: Rasterelektronenmikroskop & Transmissionselektronenmikroskopie Molekularbiologische Methoden Sequenzierung von DNA und RNA Analyse der Genexpression Biochemische Techniken: Proteine können in elektrischem Feld der Größe nach sortiert werden (Westernblattanalysen) Makroskopische Unterscheidung von Bakterienkolonien: Farbe (abhängig von Temperatur, Sauerstoff, Licht, Nährmedium) Größe (Durchmesser) Geruch (z.B. erdig, fischig, muffig) Konsistenz (z.B. schmierig, bröckelig) Oberfläche (z.B. glatt, granuliert, wellig) Kolonierand (z.B. glatt, gekerbt, wellenförmig, gelappt, wimpernförmig, gefranzt) Profil (z.B. flach, konvex, erhaben, halbkugelig, knopfförmig) Drei morphologische Grundformen Kokken Stäbchen Andere/ schraubenförmig Bakterienformen Kokken o Streptokokken (Perlenkette) o Diplokokken (2 nebeneinander) o Sarcinen (Würfelförmige Pakete) o Staphylokokken (viele auf einem Haufen) Stäbchen o Kokkobazillus (oval) o Bazillus o Diplobazillus (2 hintereinander) o Palisaden (senkrecht nebeneinander) o Streptobazillus (hintereinander wie Kette) Andere Formen: o Vibrio (erinnert an Seegurke, unförmig länglich) o Helikale Form (z.B. Helicobacter pylori) o Korkenzieherform o Filamentös (Schnüre) o Spirochäte (eingekringelt) Vorkommen von Bakterien: freilebend (planktonisch) oder im Biofilm (99,9% in heterogenen Biofilm, z.B. Schleim auf Steinen) BIOFILM Schicht von angesiedelten lebenden und abgestorbenen Kleinstwesen Entsteht, wenn Mikroorganismen sich an Grenzflächen ansiedeln, → es bildet sich dünne meist geschlossene Schleimschicht (Film), in die Mikroorganismen eingebettet sind Hüllen sich in schleimige, extrazelluläre Grundsubstanz = aus Polymeren (EPS) → viele Nährstoffe Zum Schutz vor mechanischen Einflüssen (z.B. Regen), Hunger, chemische Einflüsse, Strahlung etc. Bildung von Biofilm 1. Bakterien heften sich an Grenzfläche 2. Bakterien bilden extrazellulärepolymere Substanz, → wenn EPS fertig gebildet ist, ist die Anheftung irreversibel  3. Bakterien können in EPS wachsen und reifen 4. EPS entwickelt sich über mehrere Stadien weiter → können dort auch mehrere Untergruppen bilden 5. Wenn sie aus dem EPS entlassen werden, können Bakterien einen neuen Biofilm bilden Quorum Sensing: Definition: Signalübertragung von Zelle zu Zelle in einem Biofilm, welche die Genexpression in Abhängigkeit von der Populationsdichte steuert Aufbau und Ausbreitung werden durch Quorum Sensing reguliert Kleine diffusionsfähige Signalmoleküle (Hormone analog) werden ausgeschieden → anhand lokaler Konzentration kann festgestellt werden, wie viele andere Mikroorganismen in der Nähe sind Genetisches Material kann über horizontalen Gentransfer mit Nachbarzellen ausgetauscht werden Signale ändern sich je nach Umweltbedingungen → Kommunikation auch über Artgrenzen hinweg Zusammenhang Biofilme und chronische Infektionen: Mittelohrinfektion (bei Kindern häufig Biofilm auf Trommelfell die Ursache für eine chronische Mittelohrentzündung) Mukoviszidose (bei mehr als 80% der erwachsenen Patienten bilden Pseudomonas aeruginosa einen Biofilm → chronische Infektion → Schädigung der Lunge wird beschleunigt) Zahnplaque ist Ursache von Karies, Gingivitis & Parodontitis Wachstum Bakterien vermehren sich exponentiell 2^n (n=Generation) o Lag-Phase: Verzögerungsphase o Log-Phase: exponentielles Wachstum o Stationäre Phase: Zellen teilen sich nicht mehr (Nährmedium ist aufgebraucht) o Zelltod: Absterbephase mit abnehmender Lebendzellzahl Ernährungsgewohnheiten von Bakterien Heterotroph: benötigen organisches Material als Nahrung und zur Energiegewinnung Autotroph: erzeugen Nahrung aus CO2 (=C-Quelle) → Photoautotroph (benutzen Licht) und Chemoautotroph (benutzen chemische Energie) Auxotrophie (Mutierte): Fähigkeit manche Substanzen herzustellen verloren → ins Minimalmedium Prototrophie: benötigt nur C-Quelle & Salze zum Wachsen (AS etc. werden selbst synthetisiert) Was brauchen Bakterien zum Wachsen? Nährstoffe für heterotrophe Mirkoorganismen: o Kohlenstoffquelle (C-Quelle): Zucker, Alkohole, Fettsäuren o Stickstoffquelle (N-Quelle): Pepton (Proteine, freie AS), anorg. Salze (NO3-) N2 (Luftstickstoff) o Anorganische Salze (meist in Leitungswasser) o Spurenelemente: Mn, Zn, Cu, Ni, Na, Se, Si o Evtl. Stoffe für auxotrophe Organismen o Optimaler pH-Wert o Optimale Temperatur (37°) Sauerstoffbedarf 1. Obligat aerob (brauchen unbedingt O) 2. Obligat anaerob (O ist toxisch) 3. Fakultativ anaerob (kein O ist nicht so schlimm, O ist besser)  4. Mikroaerophile (geringe O-Sättigung ist optimal) 5. Aerotolerante (egal) Stoffwechselvielfalt Energiequelle o Chemische Reaktion → Chemotroph o Lichtreaktion → phototroph Reduktionsäquivalent o Org. Verbindungen → Organotroph o Anorg. Verbindungen → Lithotroph C-Quelle o Organ. Verbindungen (Zucker) → heterotroph o Anorg. Verbindungen (CO2) → autotroph Temperaturbereich: o Niedrig 0-20 °C: psychrophil o Mittel 20-45 °C: mesophil o Hoch 45-70 °C: thermophil o Sehr hoch 70-110 °C: hyperthermophil pH-Bereich o niedrig: acidophil o mittel: neutrophil o hoch: alkalophil Anlegen von Bakterienkulturen Abstrich o Wattestäbchen anfeuchten o Abstrich (z.B. Mundhöhle, Nase ertc.) o Wattestäbchen auf Nährmedium ausrollen o Mit Impföse ausdünnen Ausspateln von Bakteriensuspensionen Drei-Ösenausstrich Gußplattenverfahren Medien für Mikroorganismen Vollmedium: mehr Nährstoffe als erforderlich → fördert hohe Populationsdichte, Zellausbeute, schnelles Wachstum (z.B. DNA) Minimalmedium: Mindestansprüche → z.B. nur eine Kohlenstoffquelle Selektivmedium: bestimmte Organismen mit besonderer Eigenschaft → z.B. Antibiotika-Medium Differentialmedium: Unterscheidung mehrere Organismen mit bestimmten Eigenschaften → z.B. Hämolyse ➔ Die Medien können als Flüssig- oder Festmedien hergestellt werden Bakterien (Mangel)Mutanten Bio- benötigen Biotin Arg- benötigen Arginin Met- benötigen Metionin Gal- kann Galaktose nicht verwerten Lac- kann Laktose nicht verwerten Strr resistent gegen Streptomycin (Antibiotika) Strs sensitiv gegen Streptomycin Drei Ösenausstrich 1. Probe wird mit Impföse genommen und auf eine Agarplatte aufgetragen 2. Impföse wird durch Ausglühen sterilisiert (mit Bunsenbrenner 1500°) 3. Material wird übers erste Drittel des Agars ausgestrichen (A) 4. Impföse wird durch Ausglühen sterilisiert 5. Aus Bereich A wird etwas Material ausgezogen und wird ausgestrichen (B) 6. Impföse wird durch Ausglühen sterilisiert 7. Aus Bereich B wird etwas Material ausgezogen und wird ausgestrichen Gußplattenverfahren → Keimzahlbestimmung Bakterien werden verdünnt (9ml sterile Lösung in jedem Reagenzglas) Von der Verdünnung wird 1ml mit flüssigem Nähragar bei einer Temperatur von 45 ± 1°C gegossen Aushärten bei Raumtemperatur Inkubation der Platten bei 37 °C Zählen der Kolonien (Bakterien pro ml) Anlegen einer Reinkultur Reinkultur: Kultur von Organismen, die alle genetisch identisch sind, →müssen ursprünglich von einer Zelle abstammen = Klon Grundsätzliche Arbeit mit Reinkulturen oder mit definierten Mischkulturen Koloniebildende Einheit (KBE oder CFU, colony forming unit): vermehrungsfähige Mikroorganismen, die bei der Kultivierung zur Bildung einer einzelnen Kolonie führen AUFBAU VON BAKTERIEN Der typische Aufbau einer Bakterienzellen Allgemein Kapsel Schutz vor Umwelteinflüssen (Austrocknen, UV,) Chromosom Doppelsträngig, ringförmiges DANN-Molekül, das nur in einer einzigen Kopie vorkommt Haploid im Zytoplasma frei liegend Ribosomen frei im Zytoplasma Plasmide Ringförmige DANN-Moleküle Für Notzeiten Pili Adhäsion an Oberflächen Zellkommunikation Geißel Fortbewegung Zytoplasma-Membran Spezifischer Transport von Stoffen, ist semipermeabel Aufbau von (Protonen-)Gradienten Energiestoffwechsel an inneren Membran(ATP-Synthese) Phospholipid-Doppelschicht mit eingelagerten und angelagerten Proteinen  Verankerung für Geißeln, Proteine Fluid-Mosaik-Membran= immer in Bewegung Phospholipid-Doppelschicht Ausrichtung im Wasser: Anlagerung in eine Hohlkugel, mit hydrophil außen und hydrophob innen Phospholipide bestehen aus Glycerin, Fettsäuren, Phosphat Transport über die Membran = Spontaner Prozess der Ausbreitung von Stoffen einem Konzentrationsgradienten folgend = erleichterte Diffusion, Carrier-vermittelt: z.B. Kalium-Uniporter = Gekoppelter Transport zweier Substanzen, Carrier vermittelt: z.B. Laktose-Protonen Symporter = Transport von zwei verschiedenen Molekülen in gegenläufiger Richtung, Carrier-vermittelt: z.B. Natrium-Protonen-Antiporter = An eine chemische Reaktion gekoppelter Transport Zellwand Druckfestigkeit gegen den osmotisch bedingten Überdruck Form der Zelle Stofftransport und Ernährung Besteht aus Murein in Eubakterien (N-Acetyl-Glucosamin) Protein, Polysacchariden oder Pseudomurein (Archaea extrem morphil) Gram-positive Bakterien Positive und negative Gram Bakterien GRAM POSITIV GRAM NEGATIV Aufbau der Zellhülle Murein (Aufbau von Peptidoglycan) besteht aus Polysaccharid-Strängen, die abwechselnd aus dem Glucose-Derivat N-Acetyl-Glucosamin und dessen Milchsäureether N-Acetyl-Muraminsäure gebildet werden und über kurze Peptidketten miteinander vernetzt sind. Lebensbaum in einem Phylum In verschiedenen Phyla Beispiele Stäbchen: Stäbchen: Bacillus subtilis (Bodenbakterium, bildet Escherichia coli (Darmbakterium) Endosporen) Pseudomonas Fluoreszenz Streptomyces coelicolor (Bodenbakterium, bildet Fluoreszin) (Bodenbakterium, bildet Mycel, produziert Vibrio fisheri (Marines Bakterium, Antibiotika) Symbiose mit Hering, Biolumineszenz) Lactobacillus plantarum (Pflanzen, Yersinis pestis (wilde Nagetiere, Früchte, Sauerkraut) Zwischenwirt sind Flöhe) Clostridium tetanus (Bodenbakterium, Salmonella typhi (Darmbakterium) bildet Endosporen, bildet Tetanustoxin) Kokken: Kokken: Neisseria gonorrhoeae (Gonorrhö Staphylococcus aureus (Phatogen, Erreger) Nasenschleimhaut) Moraxella catarrhaltis (z.B Bronchitis, Streptococcus salivarius Sinustis, Otitis media) (Milchsäurebakterium, Mundflora)  Gram Färbung (1884 Christian Gram) Durchführung: 1. Ausstreichen eines Tropfens Bakterienkultur 2. Hitzefixierung 3. Färben mit Gentiana violett 4. Behandeln mit Lugol’scher Lösung (J/KJ) 5. Differenzierung mit Alkohol (96%) 6. Gegenfärbung mit Karbonfuchsin ➔ Gram-positive Bakterien = LILA (haben ein dickes Mureinnetz in Zellwand, die die Farblackabgabe beim Entfärben verhindert) ➔ Gram negativ = hellrot Kapseln und Schleime Schleimhülle besteht aus mehr als 90% aus Wasser und Polysacchariden DNA Träger des genetichen Materials, das an die Nachkommen vererbt wird In Prokaryoten: ein doppelsträngiges Molekül, das ringförmig geschlossen ist Keine Kernhülle, sondern liegt im Zytoplasma und bildet Nukleoid E. coli Umfang von 1,6 mm 10% des Zellvolumens 1000 x länger als das 1,2 Mikrometer lange Bakterium Generationszeit 20 min Replikationszeit von 20 min ➔ Mensch: 46 Chromosomen ca. 1000x länger (1,6m) Prokaryotische Ribosomen Ort der Proteinbiosynthese: Boten mRNA wird in eine Polypeptid-kette umgesetzt Frei im Zytoplasma Wichtig für phylogenetische Untersuchungen Untereinheiten Dir große 50S UE besteht aus 5S rRNA, 23S rRNA und >30 Proteinen Die kleine 30S UE besteht aus 16S rRNA und >20 Proteinen Unterscheidung bei Eu und Pro ist die Sedimentationsgeschwindigkeit Geißeln und Pili Fortbewegung Kommunikation Pili= unbeweglich, dienen dem Transfer von DANN, Proteinen oder der Anheftung an Oberflächen Geißeln: dienen der Fortbewegung sind unterschiedlich zu den eukaryotischen Geißeln Pili Sind typische prokaryotische Zellfortsätze Röhrenförmige Gebilde und bestehen aus Pilin-Protein Fimbrien (Typ-1 Pili, „Fransen“9 [Adhäsion, Anheftung, 3-25nm Durchmesser, bis 2- 5µm Länge, meist in großer Anzahl) Pili (Haare): Austausch von DNA (Konjugation), Adhäsion, Anheftung, 3-25nm Durchmesser, bis 10µm Länge, nur wenige Pili vorhanden) Geißeln Fortbewegung, 20nm Durchmesser, 5-20 µm Länge Bestehen aus: Filament, Haken, Basalkörper Nicht zu vergleichen mit eukaryotischen Zellen Aufbau Mobilität Begeißelung Chemotaxis - Orientierung von Bakterien in chemischen Gradienten Speicherstoffe Sporen von Bakterien Endosporen: in Reaktion auf Nährstoffmangel hitzeresistente Dauerformen (können kochendes Wasser einige Stunden überdauern) enthalten eine Kopie des Genoms, sind vom einer Membran umgeben, weitgehend wasserfrei, physiologisch inaktiv, Keimfähigkeit bleibt manchmal Jahrhunderte erhalten BEISPIELE Typische Formen 1. Zentrale Spore 2. Terminale Spore mit Einschlusskörper (Protein) 3. Terminale Spore treibt Bakterie keulenförmig auf 4. Zentrale Spore treibt Bakterie spindelförmig auf 5. Terminale Spore, rund 6. Laterale Spore treibt Bakterie spindelförmig auf Zytoskelett: wichtig für zahlreiche Vorgänge: Formgebung, Migration, etc. (Mikrotubuli Aktinfilamente Intermediärfilamente) Organellen: Zellkern, Geißeln, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat, Mitochondrium, Chloroplast Mitochondrien und Plastide Umgeben von Doppelmembran Eigene, zirkuläre Erbsubstanz , Ribosomen Einstülpungen zur Oberflächenvergrößerung Ort der Photosynthese bzw. Atmung (Energiekraftwerke) Keine de -novo Bildung, sondern entstehen durch Teilung Endosymbiontentheorie Plastide und Mitochondrien gehen auf procytische intrazelluläre Symbiosen zurück: Plastide sind aus Cyanobakterien, Mitochondrien aus atmenden Purpurbakterien entstanden. Ein relativ großer, amöboid beweglicher, wandelloser Ureucyt hat sich Prokaryoten einverleibt und in sein zelluläres Funktionsgefüge integriert Anpassungen: Mehrzahl der Proteine der Mitochondrien und Plastide werden in Kern kodiert und im Zytoplasma synthetisiert Reduktion des Erbmaterials Gemeinsamkeiten von Chloroplasten und Mitochondrien und Bakterien: Zirkuläre DNA in Nukleoiden ohne Histone Replikation von Mitochondrien + Plastiden ist unabhängig vom Wirtszellzyklus Die rRNA von Mitochondrien und α–Purpurbakterien, sowie Plastiden und Cyanobakterien ist sequenzverwandt Analog zu den Bakterien existiert in Plastiden nur eine RNA Polymerase, im Zellkern jedoch drei Die Ribosomen von Plastiden und Mitochondrien entsprechen in Größe und Empfindlichkeit gegenüber Hemmstoffen den bakteriellen 70S–Ribosomen Eukaryot vs. Prokaryot MIKROBIOLOGIE- DNA AUFBAU Genetische Informationen Gen: DANN Teilstück, das für ein Protein (über die Bildung einer mRNA), eine tRNA oder eine rRNA kodiert Chromosom: genetisches Element, das für die Zellfunktion lebenswichtige Gene enthält Genom: Die Gesamtheit aller Gene einer Zelle Bausteine der DNA Nukleotide BASEN (DESOXY) RIBOSE PHOSPHAT DNA und RNA Der DNA-Strang Chromosom Prokaryonten: einzelnes, kovalent geschlossenes, ringförmiges Chromosom In einem dichten Knäuel angeordnet: Nukleoid Enzym DNA-Gyrase: verdreht die DNA führt Doppelstrangbruch ein zieht intakten Strang durch geöffneten Strang verschließt den Doppelstrang → Überspiralisierte DNA und Verdrillung Relaxierter Ring Ein Teil des Führt zu einem Kontakt Nach der Überspiralisierte DNA Rings wird mit der Helix an zwei Gyraseeinwirkung liegt über den Stellen. Man beachte, eine Verdrehung anderen dass bisher keine (Überspiralisierung) vor gelegt Überspiralisierung vorliegt DNA-Replikation Replikation= DNA-Synthese mittels einer DNA-Matrize Semikonservative Replikation: DNA-Synthese, bei der zwei neue Doppelhelix entstehen, die jeweils einen Elternstrang und einen Tochterstrang enthalten. Replikationsrichtung 5‘ -> 3‘ Richtung: DNA-Polymerasen fügen Nukleotide an Esterbindungen zwischen der 5‘-phophatgruppe eines Nukleotids und der 3‘-OH Gruppe des vorherigen Nukleotids ➔ Bildung einer langen Kette in 5‘ -> 3‘ Richtung DNA-Polymerasen 1. Damit eine neue Kette begonnen werden kann, muss eine 3‘-OH Gruppe vorhanden sein 2. An das 3‘-OH Ende kann die DNA-Polymerase die Desoxyribonukleotide binden: Verlängerung der RNA Primers als DNA-Molekül ➔ RNA Primer ist komplementär zu den Basen der DNA-Matrize ➔ Primas: RNA-polymerisierendes Enzym, welches oft Fehler macht ➔ Primer: Nukleinsäure Molekül, an das die Polymerase das erste Nukleotid binden kann BITTE IN MEINER ZUSAMMENFASSUNG NACHSCHAUEN UND DANN NOCHMAL ÜBERARBEITEN: DNA-REPLIKATION Replikation ringförmiger DNA Replikationsursprung= Stelle auf dem Chromosom, wo dir DANN Synthese begonnen wird Replikationsgabel wird von Helikase (ATP abhängiges Enzym) gespalten !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Bidirektionale Replikation Mutationen Fehler in der DNA-Replikation führen zu Mutationen Jedoch ist die Mutationsrate von 10-8 bis 10-11 Fehlern pro Basenpaar sehr niedrig DNA-Polymerasen I und III haben eine Korrekturlesefunktion: 3´ → 5´ Exonuklease- Aktivität Entfernt falsch eingefügtes Nukleotid und setzt richtiges ein Zu unterscheiden von der 5´ → 3´ Exonuklease-Aktivität von Pol I: entfernt RNA Primer Korrekturlesen: Transkription RNA-Synthese RNA weniger stabil als DANN -> leichter abbaubar Synthese kann de-novo beginnen (kein Primer notwendig) Bausteine: ATP, GTP, UTP, CTP RNA-Polymerasen: katalysieren die Bindung von Phosphodiesterbindungen und nutzt die DNA als Matrize Syntheserichtung: 5‘->3‘ Richtung (antiparallel zum neuen mRNA Strang Transkriptionsprodukte: mRNA, tRNA, rRNA BITTE AUCH HIER WIEDER NACHSCHAUEN!!!!!!!!!!!!!!!!!! Schritte der RNA Synthese Die Initiationsstelle ist eine spezifische Nukleotidsequenz auf der DNA: Promoter Der Sigma -Faktor wird während der Elongation freigesetzt Die RNA -Polymerase bewegt sich an der DNA - Kette abwärts Transkription eines DNA -Stranges Erreichen einer Terminationsstelle die mRNA und die Polymerase werden freigesetzt Rho-una MIKROBIOLOGIE- GENTECHNIK Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen →rekombinante DNA-Technologie Beinhaltet: Herstellung von Proteinen Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren Gendiagnostik Somatische Gentherapie CRISPR/Cas9 (seit 2018) CRISPR/CAS - Guide RNa (mit Cas9-Schniedeprotein) findet im Genom seine Ziel DNA und kann sie dort schneiden - Reparatursystem von Tier nicht gut genug um fehlerfrei zu flicken ➔ Proteintranslation Werkzeuge der Gentechnologie: Spender DNA Vektor oder Plasmid DNA (Transport) Restriktionsenzyme (Schneiden) Ligasen (verbinden) DNA-Transfermethoden Wirtsorganismen Klonieren DNA Fragment wird durch Ligation in Plasmid eingesetzt →rekombinantes Plasmid →Einschleusen in Wirtszelle → Selektion → Vermehrung →Klone Vorteile von Mikroorganismen: klein, vermehren sich schnell, Genom leicht manipulierbar, leicht kultivierbar Klonierungswirte E.coli: Vorteile: gut entwickelte Genetik, viele Stämme, sehr gut untersucht Nachteile: potentiell patogen, Periplasma hält Proteine zurück Bacillus subtilis: Vorteil: leicht transformierbar, nicht pathogen, scheidet Proteine aus, Endosporen Nachteile: genetisch nicht stabil, genetisch weniger entwickelt Hefepilz: Vorteile: Genetik gut entwickelt, nicht pathogen, kann mRNA & Proteine prozessieren Nachteile: Plasmide nicht stabil, kann die meisten prokaryotischen Plasmide nicht replizieren Restriktionsenzyme Typ 1 zufällige Stelle, weit weg von Erkennungssequenz (braucht ATP) Typ 2 schneidet innerhalb oder in Nähe von Erkennungssequenz (kein ATP) Typ 3 20-25 Basen von Erkennungssequenz entfernt (braucht ATP) Typ II Erkennen bestimmte Sequenz → durchtrennen genau dort Spezifische Erkennungsstelle Meist aus palindromischen (spiegelverkehrt) Sequenzen aus 4/6/8 Basenpaaren Nomenklatur Namen: Eco R I → Escherichia (Gattung) coli (Art) R (Stamm) 1. Enzym (Reihenfolge der Entdeckung) Schutz vor eigenen Restriktionsenzymen: DNA-Methylierung an Erkennungssequenzen R-Enzymen sind Dimere, die sich an DNA anlagern können → genau an Erkennungssequenz →Entweder klebrige (EcoRI) oder glatte (AluI) enden Isoschitzomere: gleiche ES und Schlitstelle z.B. HindIII & HsuI A-AGCTT Restriktionsprodukt & Vektor (Plasmid) müssen kompatible Enden haben PCR Polymerase-kettenreaktion Zur Vervielfältigung spezifischer DNA DNA Polymerase muss hohe Temperaturen aushalten Benötigt: DNA Template, 5‘-& 3‘-Primer, dNTPs, Pufferlösung, H2O, DNA-Polymerase PCR Schritte: 1. Denaturierung 95°C → Trennung in Einzelstränge 2. Annealing/Hybridisierung 54 -63°C → Primer lagern sich an 3. Elongierung/ Polymerisierung 72°C → Polymerase synthetisiert von Primer weg Nach 3. Zyklus ist gewünschtes DNA-Fragment vorhanden Nachweis: PCR-Fragmente haben kalkulierbare Größen → Elektrophorese Phosphatgruppen neg. geladern → wandern von der Katode zur Anode Kleinere DNA-Fragmente wandern im Gel schneller Primer: 18-30 Nukleotide lang Nukleotide gleichmäßig verteilt G/C am 3‘-Ende Keine Hairpin-Loops Primer-Dimer ausgeschlossen sein Schmelzpunkt zwischen 65-70°C Annealingtemp. 10-15°C niedriger Schmelzpunkt nimmt mit höherem G-C-Anteil zu (über 40%) Mit Primer können auch Restriktionsschnittstellen (für Ligation) angefügt werden Wenn bei PCR keine Schnittstellen eingefügt werden→ TA-Zwischenklonierung (Taq-Polymerase fügt an 3‘-Ende A an Ligation An 3‘ OH-Gruppe; an 5‘ ist Phosphatgruppe → Ligase enzieht H2O → Stücke verbinden sich Plasmide: Kleine ringförmige DNA-Moleküle Replikation unabhängig von Haupt-DNA durch eine bestimmte Nukleotidsequenz In Gentechnik häufig Resistenzgene o Fertilitäts-Plasmide: nur transfer-Gene, Funktion: Einleitung Konjugation o Resistenz-Plasmide: Resistenz gegen Antibiotika / Gifte o Klonierungs-Plasmide: Ligation neuer Sequenzen & deren Vermehrung o Expressions-Plasmide: optimiert zur Expression der neuen Sequenz Klonieren von Plasmiden: ORI/Replikationsursprung Selektionsmarker: ermöglicht Selektion von Zellen mit rekombinierter DNA: Transformanten Polylinker/ MCS: Stelle mit vielen Restriktions-erkennungs-sequenzen Genetischer Austausch Transformation: Aufnahme freier DNA Konjugation: Genübertragung zwischen Bakterienzellen mithilfe von F-Plasmiden und Pili Transduktion: Übertragung von Genen mithilfe von Viren Griffith: S-Zellen wegen Kapsel tödlich; R-Zellen ohne Kapsel → nicht tödlich Tote S-Zellen + lebende R-Zellen tödlich R-Zellen nehmen freigewordene DNA von S-Zellen auf (kodiert für Kapsel → Kapselbildung) →freie DNA (z.B. von lysierten Bakterien) kann von kompetenten aufgenommen werden Transformation: 1. Kompetente E. coli auf Eis auftauen 2. Zugabe DNA 3. Inkubation auf Eis ca. 30 min 4. Hitzeschock 60s 37-42°C 5. Zugabe Medium 6. Kultivierung für 30 min bei 37°C 7. Ausplattieren auf Selektionsplatten Blau-Weiß-Selektion Operon = Promoter + Operator + Gene +Terminator = Funktionseinheit auf DNA von Prokaryoten zur Regulation der Genexpression LacZ kodiert für Proteine zum Abbau von Lactose → β-Galactosidase spaltet x-Gal → 1 Spaltprodukt ist blauer Indigo Farbstoff In LacZ ist eine MCS → wenn Insert in MCS eingebaut wird → LacZ inaktiv →weiße Klone Konjugation Zellen verbinden sich durch F-Pilus →Transfer von Plasmid vom fertilen zum nicht fertilen (F-) Bakterium F+ → Fertilitätsplasmid F‘ → Fertilitätsplasmid + Gene Hfr → Fertilitätsplasmid in Genom tra-Region enthält Gene, die an Konjugation mitwirken oriT = Ursprungsstelle des Transfers während der Konjugation MIKROBIOLOGIE – STOFFWECHSEL Metabolismus Die Gesamtheit der chemischen Umwandlungen, die in einer lebenden Zelle oder einem Organismus ablaufen. =Stoffwechsel Die daran beteiligten chemischen Verbindungen heißen Metabolite Der geordnete Ablauf chemischer Reaktionen erfolgt über eine Reihe von enzymkatalysierten Reaktionen, den Stoffwechselwegen Die Wege, die dem Auf-, Ab- und Umbau wichtiger Metabolite sowie der Energiekonservierung dienen, bezeichnet man als intermediär Stoffwechsel Nährstoffe für heterotrophe Mikroorganismen 1. Kohlenstoffquelle 2. Stickstoffquelle 3. anorganische Salze: meist in Leitungswasser oder Zusätzen enthalten), PO4 3- , Mg2+, Fe2+, Ca2+, S-, K+ 4. Spurenelemente: Mn, Co, Zn, Cu, Ni, Na, Se, Si, Wo 5. Evtl. Stoffe für auxotrophe Mikroorganismen 6. Optimaler pH-Wert 7. Optimale Temperatur ➔ Bakterien haben aufgrund ihrer Stoffwechselvielfalt eine enorme Anpassungsfähigkeit an ihre Umwelt Enorme Stoffwechselvielfalt der Mikroorganismen Unterscheidung anhand der ➔ Energiequelle: um ATP aufzubauen ➔ Elektronendonator: um Reaktionen im Stoffwechsel durchzuführen ➔ Kohlenstoffquelle: um Biomasse aufzubauen Energiequelle o Lichtbeziehende Energie (Phototrophe Bakterien) o Energie aus chemischen Reaktionen (Chemotrophe Bakterien) Elektronendonatoren o Stammen aus organischen Verbindungen (Organotrophe Bakterien) o Stammen aus anorganischen Verbindungen (Litotrophe Bakterien) Kohlenstoffquelle o C aus organischen Verbindungen; häufig aus Umgebung (Aminosäuren, Fettsäuren, organischen Säuren, Zucker, …) (heterotrophe Bakterien) o C aus CO2 (Autotrophe Bakterien) ➔ Energie zum Aufbau von Zucker wird durch Licht oder anorganischen Stoffen bereitgestellt ➔ oft Photosynthese betreibende Bakterien: chemische Speicherung von Lichtenergie Stickstoffquelle o Neben Kohlenstoff ist auch Stickstoff ein Bestandteil (Proteinen, DNA/RNA) o Ich kann in organischen Verbindungen und anorganischen Verbindungen vorkommen (Proteinen, Nukleotide, Ammoniak, Nitrat, N2…) Katabolismus =Stoffabbau; Stoffwechsel zum Abbau organischer Verbindungen im Energiestoffwechsel chemoorganotropher Organismen - Abbau energiereicher hochmolekularer Verbindungen - Reaktion exergonisch - z.B. Zellatmung Stärke/Glycogen+O2 CO2+H2O+ Energie - Die freiwerdende Energie wird in einem energiereichen Molekül meist dem ATP freigesetzt Anabolismus =Stoffaufbau; Stoffwechselwege zum Aufbau von Zellmaterial in allen Organismen - Synthese hochmolekularer Verbindungen aus einfach gebauten Molekülen - Reaktion läuft endergonisch ab (thermodynamisch ungünstig) - Synthese von Proteinen aus Aminosäuren, Stärke aus Glucose, … - Bei diesen Reaktionen wird das energiereiche ATP abgebaut Bioenergetik Befasst sich mit Energieumwandlungen in lebendigen Organismen Definition von Energie: Fähigkeit, Arbeit zu verrichten in Joule ➔ Bakterien müssen Energie konservieren Gibbs-Helmholtz-Gleichung ∆G= freie Energie ∆G= ∆H-T x ∆S ∆H= Enthalpie Änderung T = absolute Temperatur in K ∆S= Entropieänderung Bei chemischen Reaktionen geht ein Teil der Energie als Wärmeenergie verloren Freie Energie steht für weitere Arbeit zur Verfügung: Energie, die nötig ist, um ein System zu generieren, das bei definierter Temperatur im thermischen Gleichgewicht mit seiner Umgebung steht. Bioenergetische Grundlagen Exergone Reaktion o Spontan o Verbunden mit Abnahme von freier Energie o ∆G0 ➔ Prinzip von der Erhaltung der Energie Enzyme sind Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren benötigen keine erhöhten Temperaturen bzw. hohe Drucke wie chemische Katalysatoren wirken häufig sehr spezifisch (spezifische Konfirmation im aktiven Zentrum)  ➔ setzen die Aktivierungsenergie runter -> Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit Enzyms Klassen 1. Oxidoreduktase: katalysieren Redoxreaktionen 2. Transferasen: katalysieren intermolekulare Gruppenübertragung 3. Hydrolasen: katalysieren hydrolytische Spaltungen 4. Lyasen: nicht-hydrolytische Spaltungen häufig unter der Bildung von Doppelbindungen 5. Isomerasen: Isomerisierungsreaktionen 6. Ligasen: Verknüpfung zweier Moleküle unter ATP Verbrauch Beispiele Redoxreaktionen Gekoppelt: Oxidationen und Reduktionen (Redoxreaktionen) ein Elektron von A wird auf B übertragen. B ist dabei der Elektronenakzeptor (= Oxidationsmittel) und A ist dabei das Reduktionsmittel Bei einer Redoxreaktion wird ein Stoff (A) oxidiert, ein zweiter (B) durch die Aufnahme von Elektronen reduziert ➔ Energiespeicherung Elektronenüberträger: Prosthetische Gruppen kovalent an Enzymen (FAD+/FADH2) Co-Enzyme nicht kovalent (NAD+/NADH katabolisch; NADP+/NADPH anabolisch) NAD (Nicotinadenindinucleotid) o NAD kann oxidieren, NADH dagegen reduzieren o Ein NAD+ -Ion kann ein Wasserstoffatom und ein zusätzliches Elektron aufnehmen und wird dann zum NADH. Das NADH-Molekül dann kann ein zusätzliches Proton anlagern und wird dann zum NADH/H+ -Ion o NAD+ kann Wasserstoff locker binden und bei Bedarf wieder abgeben. NAD+ ist die oxidierte Form und nimmt zwei Elektronen und ein Proton auf. Die dabei entstehende reduzierte Form des Coenzyms heißt NADH Biochemischer Energiespeicher Coenzym A ATP Aufbau zeichnen können Organismen brauchen fortwährend Energie für die Aufrechterhaltung von Ionengradienten, für die Synthese von Proteinen und Nukleinsäuren und um energetisch ungünstige Reaktionen durchzuführen ATP ist die generelle Energieeinheit des Stoffwechsels Die Energie kann durch Hydrolyse (Spaltung unter Wasseraufnahme) des ATP in ADP und Phosphat freigesetzt werden Es werden nur 30-40% der freiwerdenden Energie konserviert Rest in Reibungsverlust ➔ Konservierung der Energie durch Ungleichheit auf Seite von ATP ATP + H2O  ADP +P -32 kJ/mol exotherm ➔ Die chemischen Bindungen zwischen den drei Phosphatgruppen sind sehr energiehaltig ➔ Spaltet man eine solche Bindung, so wird ein hoher Energiebetrag freigesetzt, der dann eine endotherme Reaktion antreiben kann ATP + H2O →Hexokinase→ Glucose-6-P + ADP ➔ Hexokinase spaltet ATP ➔ ATP als Carrier eine Phosphat Gruppe Es entstehen neue Moleküle, die aus ihren Bestandteilen allein nicht entstehen könnten Biophysikalischer Energiespeicher Konzentrationsgradienten und Membranpotentiale Chemische Potentialdifferenz Aufgrund ungleicher Verteilung einer ungeladenen Verbindung in zwei Kompartimenten (Membran) Elektrische Potentialdifferenz Aufgrund ungleicher Verteilung von Ladungen in zwei Kompartimenten, =Membranpotential Protonenmotorische Kraft  Elektrochemische Potentialdifferenz, ungleiche Verteilung von Ionen (Protonen) an Membranen „proton motive force“ (pmf) Potentialdifferenzen Chemisches potential= Differenz der Molekülanzahl (=Ionendifferenz) Eklektisches potential= Ladungsdifferenz (=Spannung) Protonenpumpe = Pumpen Protonen gegen das Konzentrationsgefälle und gegen das elektrische Feld = Transmembranprotein ➔ Energie stammt aus ATP-Hydrolyse ATP Synthase F0 = Protonenkanal in Membran verankert F1 = katalytische Komplex ➔ ATP-Synthese wird durch Verbrauch der protonenmotorischen Kraft angetrieben CHEMOORGANTROPHIE = zentrale Abbauwege zur Oxidation organischer Verbindungen I. Abbau von Kohlenhydraten II. Polysaccharid Stärke/Glykogen viele Bakterien können Glykogen als Kohlenstoff und Energiequelle nutzen bis zu 50.000 Glucose Bausteine sind α-1,4-glykosidisch geknüpft sind. Alle 8 bis 12 Glucose-Bausteine erfolgt eine weitere α-1,6-glykosidische Verknüpfung: → Verzweigung des Moleküls III. Glykolyse =Embden-Meyerhof-Parnas-Weg (EMP) =Fructose-Diphosphat-Weg (FP) Oxidation von Glucose Abbau von Glucoase zu Pyruvat unter Energiegewinnung Substratkettenphosphorylierung liefert Energie (ATP-Synthese) Bei Eukaryoten und vielen Prokaryoten  1. Aktivierung von Glucose durch ATP 2. Schlüsselreaktion: Spaltung von C6 -> 2 C3 3. Dehydrogenierung unter Reduktion von NAD+ und Energiegewinnung durch Substratkettenphosphorylierung 4. Substratkettenphosphorylierung unter Energiebildung; Phosphoenolpyruvat ist eine energiereiche Verbindung; Bildung von Pyruvat Glucose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi ➔ 2 Pyruvat + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP Einschleusen von anderen Zuckern in die Glycolyse: Abbauwege des Pyruvats: Oxidation des Pyruvats: Oxidative Decarboxylierung: Reaktion verbindet die Glykolyse mit dem Citratzyklus - Atmende MO, die NADH + H+ mit O2 als e-Akzeptor reoxidieren können - Pyruvat-DH, ein Multi-Enzymkomplex im Cytoplasma - Katalysiert die oxidative Decarboxylierung des Pyruvats - Acetyl-Coenzym A ist eine energiereiche Verbindung Citratzyklus - Vollständige Oxidation der Acetylgruppe, entstanden durch die Pyruvat-DH - Im Cytoplasma der Prokaryot lokalisiert - C4-Verbindung dient als Akzeptor der Acetylgruppe, 2cO2 werden freigesetzt und der Akzeptor regeneriert - Übertragung der Reduktionsäquivalente auf NAD(P)+ - Liefert wichtige Vorstufen für den Baustoffwechsel - Substratstufenphosphorylierung liefert Energie (GTP-Synthese) Hauptaufgabe: Viele H-beladene Coenzyme zu erzeugen, die anschließend ihre H - Atome in der aerobe Atmungskette unter großem Energiegewinn (3 ATP je NADH/H+ und 2 ATP pro FADH 2) auf O 2 übertragen werde Vollständige Oxidation von Glucose Glucose + 6H2O + 2ADP + 4Pi → 6CO2 + 24 H + 4 ATP Atmung Atmende chemoorganotrophe Mikroorganismen übertragen die bei der Oxidation organischer Verbindungen anfallenden Elektronen auf einen externen Elektronenakzeptor Sauerstoff dient als finaler Elektronenakzeptor Unter Aufbau der protonenmotorischen Kraft (pmf) werden die Elektronen weitergeben ➔ Energetisierung der Zytoplasma Membran ➔ ATP Synthese ATP Synthetasen Aerobe Atmung Atmung findet an der inneren Membran statt Vier hintereinander geschaltete Membrankomplexe: Komplex I: NADH Dehydrogenase, pumpt Protonen Komplex II: Succinat Dehydrogenase Komplex III: Cytochrom-bc1 Komplex, pumpt Protonen Komplex IV: Cytochromoxidase, pumpt Protonen Die Elektronen werden von einem Komplex auf den anderen übertragen: Elektronentransportkette Oxidation von NADH, Reduktion von Sauerstoff ist über eine elektrochemische Membranspannung mit der ATP-Synthese verbunden energiefreisetzende Redoxreaktionen werden dazu genutzt, Protonen gegen ein Konzentrationsgefälle über die Membran zu pumpen Die von den protonenpumpenden Komplexen transportierten Wasserstoffionen werden über eine ATP-Synthase zurücktransportiert Fluss der Protonen durch das Enzym wird zur Synthese von ATP ausgenutzt Gärung anaerobe Bedingungen: Sauerstoff als Elektronenakzeptor fehlt Oxidation von organischen Verbindungen, Zwischenprodukte dienen als Elektronenakzeptoren: Bildung von reduzierten Gärungsprodukten Wichtige Gärprodukte: Ethanol und Milchsäure (Lactat) Spezialisten: Buttersäuregärung durch Clostridien Propionsäure Gärung durch Propionibacterium Milchsäuregärung Vor allem Milchsäurebakterien: Familie der Lactobacillaceae: o Anaerob bis mikroaerophil o Natürliches Vorkommen: Milch, Milchprodukte, pflanzliche Produkte, Schleimhäute o Verwerten Laktose (Milchzucker) als Zuckerquelle Bauen Glucose zu Milchsäure (Laktat) ab Sind häufig aerotolerant, betreiben jedoch keine Atmung (fehlen Komponenten aus den Atmungskomplexen) Milchsäurebakterien Grampositive Bakterien Milchsäurebakterien: Lactobacillus Streptomyces Lactococcus Leuconostoc pediococcus Milchprodukte, Backwaren, Rohwurst, Gemüsesäfte, Bier, … Andere aerob und fakultativ anaeroben Bakterien:  Straphylococcus, Mircococcus, Propionibacterium, Streptomyces Rohwurst, Käserinde, Käseschmiere, Käse Gramnegative Bakterien: Acetobacter, Zymomonas, Halomonas, Vibrio Essig, alkoholische Getränke, Rohschinken, Matjes Milchsäurebakterien: Bakterien, die Milchsäure als einziges oder hauptsächliches Gärungsprodukt erzeugen - Fehlen der für die Elektronentransportphosphorylierung nötigen Porphyrine und Zytochrome → gewinnen Energie durch die Substratkettenphosphorylierung homofermentative Stämme: Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus und Pediococcus sowie einige Angehörige der Gattung Lactobacillus heterofermentative Stämme: haben keine Aldolase (keine Glykolyse möglich) Leuconostoc und einige Angehörige der Gattung Lactobacillus Homofermentative Milchsäure Gärung Alkoholische Gärung Wenn Sauerstoff fehlt, können die Mikroorganismen Glukose zu EtOH und CO2 abbauen Dabei wird weniger Energie in Form von ATP gewonnen, Regeneration von NAD+ hauptsächlich Hefearten: fakultative Anaerobier (wechseln zwischen aerobe Atmung und Vergärung je nach Vorhandensein von Sauerstoff Zusammenfassung Mikrobiologie- VO6 Metabolismus Metabolismus= Katabolismus + Anabolismus Monomere sind die Bausteine der Polymere und müssen vom Organismus aufgenommen oder synthetisiert werden Die Energie für den Anabolismus wird durch ATP oder protonenmotorischer Kraft bereitgestellt Wachstum durch Anabolismus (Assimilation, Biosynthese) ist zwangsweise an Katabolismus (Dissimilation, Mineralisierung) organischer Substanz gekoppelt Aus dem Abbau organischer Substanz gewinnen die Bakterien die Energie, die zum Aufbau neuer Biomasse erforderlich ist Ausnahme: Litho autotrophen Organismen, die ihre Biomasse aus anorganischen Vorstufen aufbauen können Anabolismus Synthesestoffwechsel: Aufbau von Polymeren aus niedermolekularen Intermediär Stoffwechselprodukten mit Hilfe von Energie Vier Ebenen des Anabolismus: o Bildung von Vorstufen und Reduktionsäquivalenten o Monomere o Makromoleküle o Zielstrukturen Viele Bakterien sind in der Lage, mit einem einzigen einfachen Substrat zu wachsen: alle Zellbausteine können dabei aus einem einzigen Vorgängermolekül gebildet werden. Divergenter Anabolismus: etwa 2000 verschiedene Reaktionen und komplizierte Regulationsmechanismen existieren Konvergenter Katabolismus: Alle verwerteten Substrate werden einigen wenigen Stoffwechselprozessen zugeführt Zucker und Polysaccharide Polysaccharide sind Schlüsselbestandteile der Zellwände  Zellen lagern häufig Kohlenstoff- und Energiereserven in Form von Polysacchariden (Glykogen, Stärke) ein Monomer-Untereinheiten von Polysacchariden sind Zucker aus 6 Kohlenstoffatomen (Hexosen) oder 5 Kohlenstoffatomen (Pentosen): o Glucose oder Glucose Derivate o Ribose oder Desoxyribose Gluconeogenese: „Glykolyse in umgekehrter Richtung“ Neusynthese von DGlucose (Hexose) aus organischen NichtKohlenhydratvorstufen (Pyruvat, Oxalacetat, Dihydroxyacetonphosphat) Phosphoenolpyruvat ist ein Zwischenprodukt der Glykolyse und dient als wichtiges Ausgangsprodukt in der Gluconeogenese Aktivierung des Zuckers Aktivierung des Glucose-1-phosphat durch Uridintriphosphat (UTP) Es entsteht die aktivierte UDP-Glucose: Baustein der Glykogensynthese UDPG wirkt vor allem an der Biosynthese von Glucose Derivaten mit, wie N- Acetylglucosaminsäure UDPG ist eine so energiereiche Verbindung, das die Glykosyleinheit an einen Glykogenstrang hängen kann, ohne dass eine weitere Energiezufuhr nötig ist Biosynthese der Pentosen Pentosen entstehen durch die Abspaltung eines Kohlenstoffatoms (CO2 ) von einer Hexose: Decarboxylierung Ribose-5-phosphat ist eine Vorstufe für die Synthese von Nucleotiden und Nucleotidcoenzymen wie FAD oder NADH Ribonukleotid Reduktase wandelt Ribose durch die Reduktion des 2´- Kohlenstoffs des Rings in Desoxyribose um Aminosäuren Hydrophob: Rest für sich allein betrachtet wäre nicht wasserlöslich Hydrophil, weil der Rest ein wasserlösliche Gruppe enthält Sauer, weil im Rest eine saure Gruppe enthalten ist, die ein H+ -Ion abgeben kann Basisch, weil im Rest eine basische Gruppe enthalten ist, die ein H+ -Ion aufnehmen kann Aromatisch, weil der Rest z. B. einen Phenylring (= Benzolring) enthält Aminosäure-Synthese aus Zwischenprodukten Bakterien synthetisieren alle Aminosäuren Menschen synthetisieren die roten Aminosäuren nicht Kohlenstoffskelett der meisten Aminosäuren stammt entweder aus dem Zitronensäurezyklus, Glykolyse oder Pentosephosphatweg Die Synthese verschiedener Aminosäuren innerhalb einer Familie erfordert häufig viele getrennte, enzymatisch katalysierte Schritte, die mit der ElternAminosäure beginnen Biosynthese von Aminosäuren Nukleotide Ausgangssubstanz für DNA und RNA Chemischer Energiespeicher Kofaktoren von NAD, FAD, CoA UDP Glucose Pyrimidine Purine sechsgliedrige heterocyclische aromatische heterobicyclische aromatische organische organische Verbindung mit zwei Verbindung mit vier Stickstoffatomen Stickstoffatomen Nukleotid-Biosynthese Komplexer Vorgang, die Schritt für Schritt aus verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zusammengesetzt werden Ribonukleotide Desoxyribonukleotide MIKROBIOLOGIE- BIOTECHNOLOGIE Geschichte Phase 1: unbewusste Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken mit Hilfe von Mikroorganismen Phase 2: PASTEUR; Mikrobiologen und Chemiker ermöglichen Ende des 19. Jahrhunderts die „bewusste“ Entwicklung von Produkten aus MO´s (Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure...) Phase 3: Alexander Fleming entdeckt das Antibiotikum Penicillin. Sterile Prozessführung, es folgen andere Antibiotika, Vitamine, Gibberelline (Pflanzenwuchswuchsstoffe) etc. Phase 4: 1953 beschreiben Watson und Crick die Struktur der DNS; 1973 das erste gentechnologische Experiment Definition: ▪ Herstellung von Medikamenten, Vitaminen, Biofuel und Life-style Drugs ▪ Biotechnologie behandelt den Einsatz biologischer Prozesse im Rahmen technischer Verfahren und industrieller Produktionen“ ▪ Biotechnologie ist die integrierte Anwendung von Biochemie, Mikrobiologie und Verfahrenstechnik mit dem Ziel, die technische Anwendung des Potentials der Mikroorganismen, Zell- und Gewebekulturen sowie Teilen davon zu erreichen Biologische Agenzien Mikroorganismen, einschließlich genetisch veränderter Mikroorganismen, Zellkulturen Genetisch verändert Erbmaterial wurde durch gentechnische Verfahren so verändert, wie dies unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt Arbeiten mit Bakterien ▪ Große Population: Statistik ▪ Kurze Generationszeit ▪ Haploid, kleine Genome ▪ Gasaustausch und Mutationsmöglichkeiten WEIßE BIOTECHNOLOGIE =Einsatz in der Industrie; Verwendung von Mikroorganismen Vorgehensweise Anwendungen ▪ Neue oder optimierte Enzyme Backwaren, Getränke, Papier, Spülmittel, Textilien, ▪ Proessentwicklung Waschmittel, Leder, Käse, Fleisch und Fisch ▪ Prozessvereinfachung ▪ Optimierung der Produktaufbereitung ▪ Einsparen von Rohstoffen und Energie ▪ Vermeidung von Abfallprodukten  Enzym- Chymosin bei Kälber Lab (Beispiel) ▪ Säuerungsmittel in der Käseherstellung ▪ Aus dem Magen säugender Kälber: Gemisch aus Chymosin und Pepsin Lab-Ersatzstoffe: ▪ Protease Gemische aus Schimmelpilzen ▪ Aus Pflanzen ▪ Unerwünschte Aromakomponenten Gentechnisch hergestelltes Lab ▪ Chymosin-Gen aus Schleimhautzellen eines Kalbes in Mikroorganismen transferiert ▪ Chymosin Gen wird überexprimiert. ROTE BIOTECHNOLOGIE =Einsatz in der Medizin Behandlung von Krebs, AIDS, Alzheimer, Parkinson, Multiple Sclerosis → Medikamente → Impfstoffe → Gentherapien → Diagnostik Insulin (Beispiel) ▪ erstes gentechnische hergestellte Medikament ▪ vor 1980 aus Bauchspeicheldrüsen von Rindern oder Schweinen -> Allergien + Unverträglichkeit 1. Aus Zelle entnimmt man eine menschliche DNA, bei der man das Insulingen ausschneidet 2. Einem Bakterium wird das Plasmid entnommen und aufgeschnitten 3. Das menschliche Insulingen wird in das Bakterium Plasmid eingefügt 4. Die Plasmide werden vervielfältigt und anschließend induziert 5. Herstellung von Insulin und Humaninulin VORTEILE MEDIKAMENTE DURCH GENTECHNIK - Mehr Sicherheit - Größere Mengen - Weniger Nebenwirkungen - Verminderung des Einsatzes von Tieren z.B.: Interferone (Krebstherapie), Insulin (Diabetes mellitus)  GRÜNE BIOTECHNOLOGIE = Einsatz in der Pflanzenbiotechnologie Anti-Matsch-Tomate (Beispiel) ▪ das Enzym Polygalacturonase (PG) zerstört die Zellwände bei der Reifung ▪ Integration eines Anti-PGGens → komplementäre Anti-mRNA enzymatischer Abbau der mRNA → weniger PG gebildet → Tomate bleibt länger fest BRAUNE BIOTECHNOLOGIE = Umweltbiotechnologie - Abfallwirtschaft - Altlastensanierung - Umweltverträgliche Produktionsprozesse BIOLOGISCHE SANIERUNG ▪ Dünger kann den biologischen Abbau durch ansässige Bakterien stimulieren ➔ Vermehrung der Mo, Erhöhung der Rate des biologischen Abbaus ▪ Arbeiter sprühen nach dem Leckschlagen des Tankers stickstoffreiche Düngerlösung auf einen ölgetränkten Strandabschnitt ▪ Kontaminierter Erdboden wir abgetragen und dann mehreren verschiedenen Reinigungsverfahren unterworfen Schlämmphasenbiosanierung ▪ In großen Bioreaktoren wird kontaminiertes Material mit Wasser, Sauerstoff und Dünger vermischt (meist für kleiner Mengen geeignet) Festphasenbiosanierung ▪ Zeitaufwändig, größere Mengen → Kompostierung → Erdwaschung → Regenerationsmieten (Dämpfe) KLÄRWERK 1. Abwasser wird in Kläranlagen gepumpt und gefiltert 2. Exkremente und Papierreste werden in kleinere Teilchen zermahlen, die sich absetzen und einen Bodensatz bilden (Klärschlamm) 3. Der Überstand vom Absetzbecken fließt ab (vorgeklärtes Wasser) 4. Vorgeklärtes Wasser wird in Belüfterbecken geleitet 5. Aerobe Mo oxidieren organische Verbindungen Oder 6. Vorgeklärtes Wasser kann in ein Aktivschlammsystem verbracht werden : Behälter mit schmutzabbauenden MO unter kontrollierten Bedingungen 7. Klärschlamm wird in Faultürme gepumpt, in denen anaerobe Bedingungen herrschen : anaerobe Bakterien bauen weitere Stoffe ab 8. CO 2 und Methan (Biogas) entsteht : Methan wird abgefangen (Brennstoff zur Energieversorgung der Anlage) 9. Schlamm wird getrocknet und auf Deponien gelagert oder als Dünger eingesetzt 10. Geklärtes Wasser wird durch den Zusatz von Chlor desinfiziert und in Flüsse oder ins Meer entlassen 11. Klärschlamm wird abtransportiert, deponiert oder in der Landwirtschaft eingesetzt BLAUE BIOTECHNOLOGIE ▪ Produkte, die mit Organismen aus dem Meer hergestellt werden ▪ Technische Verwendung von Prozessen und Organismen der marinen Biologie Ziel: Steigerung des Nahrungsmittelangebotes Wiederherstellung und Schutz mariner Ökosysteme verbesserte Sicherheit und Qualität von Nahrungsmitteln aus dem Meer Verbesserung der Kenntnisse zu biologischen und biogeochemischen Vorgängen in den Weltmeeren  GELBE BIOTECHNOLOGIE = Lebensmittelbiotechnologie; Haltbarkeit Fermentation = Umsetzung von biologischen Materialien mit Hilfe von Bakterien-, Pilz- oder Tellkulturen oder aber auch künstlichen Zusatz von Enzymen SPONTANE FERMENTATION ▪ keine zusätzliche Zugabe von Mikroorganismen, sondern sie sind im Produkt bereits vorhanden oder kommen sich aus der Umgebung dazu ▪ Fermentation ist von Umgebungsbedingungen abhängig ▪ unsterile Prozessführung ▪ keine direkte Beeinflussung des ▪ Fermentationsablaufes Fermentationsführung beruht auf empirischen Erfahrungen ▪ hohe Gefahr von Fehlproduktionen TRADITIONELLE FERMENTATIONSVERFAHREN ▪ Zugabe von Mikroorganismen als Reinkultur: → fremdkeimarme Prozessführung ▪ Mikroorganismen haben konservierende Wirkung durch die Bildung primärer Stoffwechselprodukte, wie z.B. Milchsäure, Essigsäure oder Alkohol ▪ Fermentation kann beeinflusst werden ▪ Einsatz im Bereich von Massenproduktionen ALKOHOLISCHE GÄRUNG C6H12O6 -> 2 C2H5OH + 2 CO2 [kultivierte] Wildhefen (Beispiel) ▪ um Wildhefen abzutöten, wird SO2 zugesetzt, die die kultivierten Wildhefen tolerieren können ▪ Abtrennen: Wein wird vom Sediment getrennt ▪ Lagerung bis Reifung ▪ Zur weiteren Klärung: können Klärungsmittel zugegeben werden STARTERKULTUREN = Stämme von Mikroorganismen, die in Rein- oder Mischkultur einem Lebensmittel gezielt von außen zugesetzt werden (von Pflanzen oder Tieren) homofermentierte Milchsäuregärung Lactose -> Milchsäure (GRAS-Status= sind gesundheitlich unbedenklich, hygienisch einwandfrei und technologisch wirksam) Käseherstellung (Beispiel) MIKROBIELLER FERMENTER ▪ Kultivierung der Mikroorganismen im geschlossenen, sterilen System ▪ Über Einlässe mit Sterilfilter können von außen Stoffe zugesetzt werden : Regulierung des pH Wertes, Sauerstoffkonzentration oder andere Parameter ▪ Stellgrößen werden von im System befindlichen Sensoren erfasst ▪ Bis zu 500.000 l möglich ▪ Fermenter für aerobe und anaerobe Vorgänge ▪ Äußerer Mantel : zur Regulierung der Temperatur durch Kühl - oder Heizwasser (oder Dampf) ▪ Belüftungssystem : Verteilung von steril filtrierter Luft, besteht aus Verteiler und Rührer ▪ Kontrolle von pH Wert, Temperatur, Sauerstoffkonzentration, Zellmasse, Nährstoffe und Produktkonzentration : → Datenerfassung in Echtzeit MIKROBIOLOGIE-INFEKTIONSKRANKHEITEN Immer weniger Menschen sterben an Infektionen ➔ Durch Identifizierung von Mikroorganismen besser verstehen ➔ Durch Antibiotika besser behandeln ➔ Hygiene+ bessere Ernährung Definition: Infektiöse Erkrankung durch Eindringen und Vermehrung von Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Viren, Pilze oder Protozoen) im menschlichen Körper. KLASSIFIZIERUNG VON KRANKHEITEN Endemie Epidemie Pandemie ▫ Andauernd gehäuftes ▫ Ungewöhnlich große Weltumspannende Epidemie Auftreten Fallzahlen ▫ Begrenzte Region/Population ▫ Örtlich begrenzt ➔ Infektionserkrankungen hängen häufig mit mangelnder Hygiene und nicht zugänglichen Therapien zusammen. Somit weltweit häufigste Erkrankung Ursachen: ▪ Luftwegs Infektion ▪ AIDS ▪ Diarrhoe ▪ Tuberkulose Parasiten Organismen, die auf Kosten eines Wirts in oder auf ihm leben Obligat pathogene Keime Erreger, sind bei fast jedem nicht-immunen Individuum krankheitserregend Fakultativ pathogene Keime Erreger, die nur bei allgemeiner oder lokaler Abwehrschwäche zu sog. opportunistischen Infektionen führen Lokale Infektion Die Infektion beschränkt sich auf die Eintrittspforte des Erregers (z.B. Wundinfektion) Generalisierte Infektion Erreger dringen ins Gefäßsystem vor und ziehen den gesamten Organismus in Mitleidenschaft. Generalisierte Infektionen können zu einer Sepsis führen ( z.B. Typhus) Sepsis Systemerkrankung, die durch Mikroorganismen und/oder deren toxischen Bestandteile verursacht wird. Oft ist ein lokaler Herd vorhanden, von dem aus die Bestandteile in die Blutbahn gelangen. Es kommt zu Organschäden, beim septischen Schock zum Multiorganversagen Infektionsdosis Minimale Anzahl an Mikroorganismen, die eine Infektion verursachen NOSOKOMIALE INFEKTION Definition: im Krankenhaus erworbene Infektion, kurz Krankenhausinfektion - Harnwegsinfektion - Postoperative Wundinfektion - Atemwegsinfektion - Bakteriämie und Sepsis PATHOGENITÄTSSTRATEGIEN 1) Adhärenz Bakterien müssen an Oberfläche von Zellen 2) Invasion Aufnahme von Bakterien 3) Spreading Innerhalb Zelle und über interzellulären Raum auf nächste Zelle 4) Transcytose =Ausschleusen oder nach Invasion ➔ Invasion in andere Zelle ➔ Transmigration im Gewebe KOCH’SCHE POSTULATE 1. Optischer Nachweis (Mikroskop) 2. Kultureller Nachweis (Kultivieren) 3. Pathogenitätsnachweis (gesunder auch krank werden) 4. Mikroorganismus muss aus experimentell infizierten Organismen erneut kultivierbar sein (wieder erneut kultivieren) Streptococcus (Beispiel) ▪ Kettenbildende Kokken ▪ Gram -positiv ▪ Beta -hämolysierend : Auflösen der Erythrozyten in Blutagarplatten ▪ Scharlach , Mittelohrentzündung , etc Bacillus anthracis (Beispiel) ▪ Stäbchen ▪ Gram -positiv ▪ sporenbildend : Bildung von Endosporen erhöht die Fähigkeit von B. anthracis, sich durch Aerosole zu verbreiten ▪ Milzbranderreger ▪ nichthämolytische Kolonien Neue Pathogene Immer wieder neue Krankheiten. Jedoch dachte man 1899, dass es vorbei sei. 1969 war das Goldene Zeitalter der Antibiotika. BMMF (Bovine Meat and Milk Factors) ▪ Unbekannter Erreger in Kuhmilch und Rindfleisch ▪ einzelsträngige, ringförmige DNA-Elemente mit Ähnlichkeiten zu Acinetobacter baumannii und Gemycircular Virus Übertragungswege Horizontale, direkt Horizontale, indirekt Vertikale ▪ Kontakt: Hände, ▪ Vehikel: Wasser, ▪ Pränatal Sexualkontakte Lebensmittel, ▪ Perinatal ▪ Aergon: Tröpfchen, Aerosol Körperflüssigkeiten ▪ Vektor: Mücken, Zecken PATHOGENITÄT Stumme Infektion Infektion ohne klinische Symptome Inkubationszeit Zeit zwischen Infektion und Auftreten von Krankheitssymptomen; charakteristisch Endogene Infektion von kolonisierenden Mikroorganismen ausgehend exogene Infektion von außen eindringenden Mikroorganismen verursacht Pathogenität Fähigkeit eines Keims, Krankheiten hervorzurufen Virulenz Ausmaß einer krankheitserzeugenden Eigenschaft einer pathogenen Spezies; „Grad der Pathogenität auf eine Population bezogen EINTRITTSPFORTEN Wunden Insektenstiche intakte Schleimhaut intakte Haut vor Geburt über Plazenta Pathogenitätsfaktor/Virulenzfaktor Ist es ein Pathogenitätsfaktor? Pathogenitätsfaktoren sind qualitativ wichtig: Krankheit ja oder nein... Ist es ein Virulenzfaktor? Virulenzfaktoren sind quantitativ wichtig: stärkere oder geringere Symptome Ist es ein (unwichtiges) Begleitprodukt? Kodiert durch Plasmide, Chromosomen, Phagen ➔ Ziel: Kolonisierung, Schädigung von Geweben und/oder Zellen → Verbreitung Das Patogenitätspotential steckt im Genotyp -> Horizontaler Gentransfer  Escherichia coli (Beispiel) Pathogenitätsfaktoren - Enterotoxin (lokale Schäden) - Eisenaufnahmesysteme (Ernährung) - Fimbrien und Adhäsine (Adhäsion) - Cytotoxin - Kapsel, K-Antigene - Geißel, H-Antigene - O-Antigene - Lipopolysaccharidschicht (da gram negativ -> Fieberschübe) Allgemeine Daten - 1919 von Theodor Escherich entdeckt - Gram negativ - Stäbchen - Peritriche Begeißelung - Infektionen durch fakultativ pathogene Enterobakterien entstehen endogen im Darm PATHOGENITÄTSINSELN Aufbau ▪ tragen Virulenz Gene ▪ Vorkommen in pathogenen Stämmen, fehlen in nicht-pathogenen Stämmen ▪ Große genomische DNA-Fragmente (10-200kb) ▪ Wiederholungssequenzen ▪ Instabil INFEKTIONSABWEHR Angeborene, unspezifische Abwehr - Physikalische Barrieren - Zelluläre Abwehr - Chemische Barrieren Erworbene, spezifische Abwehr - Zelluläre Abwehr - Humorale Abwehr ABWEHRSTRATEGIEN - Haut (verhornt, Fettsäuren, Normalflora) - Schleimhaut (Schleim, Normalflora) - Respirationstrakt (Zitterbewegung des Flimmerepithels) - Magen (Salzsäure) - Darm (Perstltik) - Harntrakt (Harnstrom) PATHOGENE VERDAUUNGSWEG UND ATEMWEGE ADHÄRENZ Schlüssel-Schloss-Prinzip MIKROORGANISMEN UND PATHOGENESE IMMUNABWEHR = ist die Reaktion des Immunsystems auf Organismen oder Substanzen, die es als fremd erkannt hat Der Erreger zum Beispiel ein Virus dringt ein und wird zuerst von der angeboren Immunsystemseite bekämpft. Sollte das nicht ausreichen um ihn zu vernichten, kommt die erworbene Immunantwort zum Zuge. Das erworbene Immunsystem muss erst lernen um welchen Erreger es sich handelt und entwickelt dann zielgerichtete Mechanismen wie z.B.: Antikörper. Danach kann sich ein Immungedächtnis entwickeln. Wenn die Erreger ein zweites Mal in den Körper eindringen, ist das Immunsystem bereits vorbereitet und kann den Erreger noch schneller bekämpfen ANGEBORENE IMMUNANTWORT Nach Eindringen eines Krankheitserregers kommt es zu einer unspezifischen Erkennung ▪ Die Immunzellen dieses Systems besitzen Erkennungsrezeptoren, die auf unspezifische Weise sogenannte pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen und eine erste Reaktion ermöglichen ▪ Schnell, jedoch nicht besonders effektiv ▪ Erreger wird „in Schach" gehalten, bis das adaptive Immunsystem eine erregerspezifische Antwort aufbauen kann ▫ Fresszellen: Makrophagen, Monozyten, Dendritische Zellen, natürliche Killerzellen ▫ Granulozyten: Neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, basophile Granulozyten P ROINFLAMMATORISCHE A NTWORT LPS bindet an einen Komplex auf Zelloberfläche das aus TLR4, CD14 und LBP (LPS bindendes Protein) besteht. Dadurch werden Signalwege aktiviert, die die Genexpression und Sekretion von Interleukin 1, IL8, IL6 oder des Chemokin TNF alpha reguliert. Die Substanzen sind dann daran beteiligt, andere Immunzellen anzulocken, Makrophagen zu aktivieren, B-Zellen und T-Zellen wachsen zu lassen, usw. Zytokine= Glykoproteine mit regulierender Funktion auf das Wachstum und die Differenzierung von Zellen P HAGOZYTOSE DURCH F RESSZELLEN aktivierte Signalwege können auch die Mortalität von Fresszellen steuern; Aufnahme von Nahrungspartikeln bis hin zu kleineren Zellen A NTIGENPRÄSENTIERENDE Z ELLEN ▪ Beim Verdauen der Bakterien lassen Monozyten und Makrophagen kleine, charakteristische Fragmente übrig. ▪ Die Fresszellen transportieren diese Antigene an ihre Zelloberfläche und klinken sie dort in den MHC (Major Histocompatibility Complex) ein. ▪ Mit den Antigenen im MH-Komplex gelangen die antigenpräsentierende Zellen in die Lymphknoten ADAPTIVE IMMUNANTWORT - humorale und zelluläre Immunantwort - adaptiv= können lernen, neue Erreger spezifisch zu erkennen und sind damit höchst effektiv - Aufbau dauert länger - B-Zellen: B-Lymphozyten, Plasmazellen, B-Gedächtniszellen - T-Zellen: T-Helferzellen, T-Suppressorzellen, T-Gedächtniszellen, T-Killerzellen Antikörper: Proteine der Klasse der Globuline, die in Wirbeltieren als Reaktion auf Antigene gebildet werden. Antikörper werden von einer Klasse von weißen Blutzellen (Leukozyten) produziert Antigene: Antigene (Antibody generating) sind Stoffe, an die sich Antikörper und bestimmte Lymphozyten- Rezeptoren spezifisch binden können WAS PASSIERT IN EINER SCHNITTWUNDE ? 1. Verletzung : Bakterien dringen ein 2. Unspezifische Abwehr durch Defensine (Haut), Lysozym (Gewebe), Plasmaproteine (Komplementsystem, Blut) 3. Phagozytose durch Fresszellen (neutrophile Granulozyten , Makrophagen, Monozyten), die durch Ausschüttung von Zytokinen weitere Immunzellen anlocken 4. Makrophagen und Monozyten präsentieren Antigene auf der Oberfläche (MH Komplex) 5. Fresszellen wandern in den Lymphknoten und präsentieren den wartenden T -Zellen ihre Antigene 6. T -Helferzellen aktivieren B -Zellen 7. B -Zellen gehen in die Blutbahn und wandeln sich in Plasmazellen 8. Produktion und Freisetzen von Antikörpern 9. 9. Antikörper binden Bakterien und werden zerstört MIKROBIOLOGIE- KEIMREDUKTION UND ANTIBIOTIKA KEIMREDUKTION CAMPYLOBACTER INFEKTIONSKETTE ▪ Campylobacter jejuni: gram-negativ, mikroaerophil ▪ Campylobacter Enteritis Entzündliche Durchfallerkrankung ▪ Schwere Komplikation: Guillain-Barré-Syndrom ▪ Überträger des Erregers sind Nutztiere, insbesondere Geflügel, seltener werden die Erreger über verschmutztes Trinkwasser übertragen. SALMONELLEN ▪ Durchfallerreger: Salmonella enteritidis oder Salmonella typhimurium ▪ Meist spontan ausheilend ▪ Übertragung durch unsaubere Lebensmittel, Ausscheidungen, Oberflächenwasser, unhygienisch aufgetautes Geflügel, rohe Eier HALTBARMACHUNG VON LEBENSMITTEL Räuchern, Salzen, Zuckern, Pasteurisieren, Einkochen, Gefrieren, UV-Bestrahlung, Milchsäure- Gärung EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIR LEBENSFÄHIGKEIT ▫ DR= Zeitspanne, nach welcher bei einer gegebenen Temperatur nur noch 10 % der ursprünglichen Population des Organismus lebensfähig sind ▫ 70 °C, D = 3 Min. 60 °C, D = 12 Min. 50 °C, D = 42 Min DER AUTOKLAV (STERILISATION ) (1) Druckkessel mit Thermometer, Manometer, Kontroll- und Sicherheitsinstrumente (2) Werden mit Wasser gefüllt und bei geöffnetem Ventil aufgeheizt: Wasser verdampft und vertreibt Luft aus dem Kessel (3) Ventil wird geschlossen und bis zur vorgeschriebenen Temperatur aufgeheizt (Bildung eines Überdrucks) (4) danach abkühlen Desinfektion Gezielte Entkeimung; totes oder lebendes Material in einen Zustand versetzen, dass es nicht mehr infizieren kann; Maßnahmen zur gezielten Verminderung der Keimzahl, die normalerweise nicht zur Sterilität führt. Keimreduktion um einen Faktor von mindestens 10^5 Sterilisation Abtötung von Zellkulturen sowie von Mikroorganismen und Pflanzen einschließlich deren Ruhestadien bzw. Dauerformen (Sporen) durch physikalische und chemische Verfahren. Reduktion von KBE um einen Faktor von mindestens 10^6 Inaktivierung Vollständige Zerstörung der Vermehrungs- und Infektionsfähigkeit sowie der Toxizität von Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren sowie Zellkulturen und Zerstörung der Toxizität ihrer Zellinhaltsstoffe  ➔ Schädigung der Nukleinsäuren durch chemische Agenzien bzw. physikalische Einwirkungen ➔ Zerstörung der Raumstruktur von Proteinen durch Hitze oder chemische Agenzien ➔ Zerstörung der Zytoplasma-Membran durch Herauslösen von Memran-Lipiden DESINFEKTIONSMITTEL Alkohol, Aldehyde, Chlorhexidin, Ethylenoxid, Stickstoffverbindungen, Halogene, Phenole, Schwermetalle PHYSIKALISCHE VERFAHREN Strahlung ▪ Kurzwellige UV- Strahlung (Desinfektion großer Flächen bzw. ganzer Räume ▪ Radioaktivität (Sterilisierung von medizinischen Einwegmaterialien und von Nahrungsmitteln ▪ Gamma Strahlung (hohe Dosis tötet alle Organismen ab, ohne dass die Gegenstände selber radioaktiv würden) Membranfilter ▪ Die Struktur der Membran dient als Filtration von Flüssigkeiten durch verschiedene Größen und Porenweiten ▪ Vereinfacht das Mikroskopieren ANTIBIOTIKA ▪ Kleine, chemische Verbindung ▪ Gebildet von Mikroorganismen ▪ Wirken in niedriger Konzentration (wachstumshemmend oder abtötend) Bakteriostatisch Bakteriozid Bakteriolytisch Wachstumshemmend Zellen werden abgetötet Zellen werden abgetötet + Zelllyse EMPFINDLICHKEIT Minimale inhibitorische Konzentration ▪ Verdünnungsreihe des Antibiotikums in Kulturmedium ▪ Jedes Kulturröhrchen wird beimpft ▪ Inkubation ▪ Wachstum (erkennbar an der Trübung) ist in Röhrchen feststellbar, in denen die Antibiotikakonzentrationen unterhalb der MIK liegt Agar Diffusionstest - Bakteriensuspension wird gleichmäßig auf eine Nähragarplatte ausgebracht - Antibiotika-haltige Scheibchen werden auf die Oberfläche abgelegt - Inkubationszeit für 24-48 Stunden - Testorganismen zeigen Empfindlichkeit für einige Antibiotika, kenntlich an der Hemmung des bakteriellen Wachstums im Umkreis der Scheibchen (Hemmzonen) nach der Bebrütung  Salvarsan „heilendes Arsen“ bei Syphilis (Beispiel) Verlauf ▫ Stadium I: nach 2-3 Wochen, Auftreten von Knötchen/Geschwüren, Lokalinfektion ▫ Stadium II: nach 9-10 Wochen, grippeähnliche Symptome ▫ Stadium III: nach 3-4 Jahren, Befall innerer Organe, Lymphknoten ▫ Stadium IV: nach 10-20 Jahre, Befall von Hirnhäute, Nervenstränge Demenz, Ataxien, Sprachstörungen Antibiotika ▪ arsenhaltige Verbindung ▪ Das erste nützliche, antimikrobiell wirksame chemotherapeutischen Stoffe (Paul Ehrlich) Arten von Antibiotika Wirkungsweisen BETA LACTAM ANTIBIOTIKA ▪ ß-Lactam-Ring bindet D-Alanin-Transpeptidase, das für die Quervernetzung der Peptidoglykane in den bakteriellen Zellwänden gram-positiver Bakterien zuständig ist. Somit kann das Peptidoglykan nicht mehr vernetzt werden ➔ Bakterium platzt -> Zellwand kann nicht mehr aufgebaut werden ▪ Bakterien können sehr schnell gegen ß-Lactam-Antibiotika resistent werden, indem sie eine ß-Lactamase exprimieren. Das ist ein Enzym,das den ß-Lactam-Ring aufspaltet. ➔ Penizillin kann nicht mehr die D-Alanin-Transpetidase binden -> wirkungslos ▪ ß-Lactamase wird von einem bla Gen meist in Plasmid kodiert ➔ Gentechnik als Selektionsmarker: Plasmide auf die man selektionieren will muss eine Resistenz gegen Antibiotika vorhanden sein -> Man verwendet Gen das für ß-Lactamase kodiert Penizillin Ampicillin Unterschiede Gram Positive Bakterien - NH2 zusätzlich - Membramgängiger - Gram negative Bakerien ➔ Wirkungsspektrum erweitert Gemeinsamkeiten Beta-Lactam-Ring INAKTIVIERUNG VON ANTIBIOTIKA ▪ Mechanismen die von Bakterien aufgebaut werden um diesen Selektionsdruck umgehen zu können. ▪ Durch Anhängen von weiteren funktionellen Gruppen können Antibiotika inaktiviert werden und Bakterien haben dann einen Vorteil überleben zu können. → Spaltung → Phsophorylierung → Adenylierung → Acetlylierung Ndm1: New Delhi metallo-beta-lactamase (Beispiel) ▪ Carbapenemasen : β -Lactamasen , die neben Penicillinen und Cephalosporinen auch Carbapeneme spalten können ▪ hauptsächlich in Indien und Pakistan in den Enterobakterien Escherichia coli (Wundinfektionen) und Klebsiella pneumoniae (Lungeninfektionen) ▪ Resistent gegen fast alle bekannten Antibiotika (Ausnahmen Tigecyclin und Colistin ) ▪ Tigecyclin: umgeht zwei wichtige Resistenzmechanismen : die Effluxpumpe und ribosomale Schutzmechanismen ▪ Colistin: Schädigung der äußeren Membran (Permeabilität) auf gramnegative Bakterien BEISPIELE VON ANTIBIOTIKA Ciprofloxacin ▫ ist gut löslich und erreicht im Blut und im Gewebe klinisch verwertbare therapeutische Konzentrationen ▫ Harnwegsinfektionen und Milzbrand, der von penicillin-resistenten Bacillus anthracis-Stämmen verursacht wird ▫ Hemmt die bakterielle Gyrase (Replikation) Kanamycin ▫ lagert sich an die 30S-Untereinheit der Ribosomen an und hemmt damit die bakterielle Proteinsynthese ▫ Inaktivierung von Kanamycin durch Phosphorylierung, Adenylierung oder Acetylierung ▫ Klonierung Erythromycin ▫ hemmt den durch den Elongationsfaktor EF-G katalysierten Vorgang der Translokation bei der Translation und somit die Proteinbiosynthese ▫ Resistenz durch Veränderungen an den bakteriellen Ribosomen durch eine Methylase Tetracyclin ▫ Verhindert die Anlagerung von Aminoacyl-tRNA an die mRNA in der 30-SUntereinheit des Bakterien-Ribosoms. Dadurch wird die Translation und letztlich die Proteinbiosynthese gestoppt ▫ Resistenz z.B. durch aktiven Export des Antibiotikums aus der resistenten Zelle durch einen membranständigen Proton-Tetracyclin-Antiporter ▪ Penicillin wird kaum noch verabreicht, wegen der zunehmenden Medikamentenresistenz der Erreger. ➔ Antibiotikatherapien wurden zu früh abgebrochen ➔ zu häufig P verschrieben ▪ Vermehrung von antibiotikaresistenten Bakterien nahm stetig zu Multiresistenten Stämme MRSA (Methicillin resistente Staphylococcus aureus) ▪ Abwehrmechanismen gegen Antibiotika wie Methicillin bzw. Oxacillin ▪ Wunden in Krankenhäusern schwer zu behandeln ▪ Staphylococcus aureus kommt regelmäßig auf er Haut gesunder Menschen vor, kann jedoch in den Körper eindringen und dort Infektionen verursachen ▪ MRSA stellt für gesunde Patienten keine Gefahr dar ▪ MRSA-Träger sollten innige Berührungskontakte vermeiden ➔ bei Kontaktpersonen mit offenen Wunden oder Hautekzemen ➔ im Umgang mit Personen des häuslichen Milieus, die beruflich Pflegedienste am Patienten in einem Krankenhaus ausüben ▪ nimmt stetig zu THERAPIEERFOLG 1. In vitro Aktivität des Antibiotikums 2. Immunstatus des Patienten Es bleiben auch nach einer Antibiotikatherapie einige Bakterien übrig, die vom Immunsystem beseitigt werden müssen 3. Infektionslokalisierung Je nach Ort der Infektion (z.B. Gehirn) kann das Antibiotikum besser oder schlechter eindringen NEBENWIRKUNGEN Biologische Nebenwirkungen Andere Nebenwirkungen o Soor, andere Infektionen o Allergische Reaktionen o Pseudomembranöse Kolitis (Überwucherung o Toxische Wirkungen von Clostridien) o Herxheimer Reaktion Aber: Antibiotika sind die Medikamente, die die meisten Leben gerettet haben und auch heute noch Leben retten  ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON PATHOGENEN MIKROBIOLOGISCHE KULTUR BSP.: EOSIN/METHYLENBLAU AGARPLATTE ▪ Unterdrückt das Wachstum von gram positiven Bakterien und zeigt durch Eosin und Methylenblau das Wachstum von gram negativen Bakterien ▪ Dient zur Isolierung pathogener Enterobakterien insbesondere Salmonellen und Shigellen und zur Identifizierung von Candida albicans ▪ Coliforme Bakterien sind gram negative laktosespaltende Bakterien mit fäkalen Ursprung. → Wenn vorhanden entstehen Stoffwechselprodukte die einen Farbumschwung der Kolonien bewirken → E.coli -> schnelle Laktosefermentierung → Pseudomonas aeruginosa -> keine Fermentierung BUNTE REIHEN Bestimmung von Bakterien durch bestimmten Enzymaktivitäten, Substrat, Gasbildung, Gattungsart, Art SEROLOGISCHE METHODEN IN DER BAKTERIOLOGIE Antikörpernachweis Antigennachweis - Infektionsdiagnostik - Kulturen (Erregertypisierung) - Immunstatus - Direkt im Untersuchungsmaterial ELISA TEST Ob in dem Material Partikel von dem Erreger befinden 1. Antikörper gegen das Bakterium oder Virus auf eine Oberfläche aufgebracht und bleibt haften 2. Probenmaterial auf gecodete Platte geben. Dann würden die Komponenten, die von dem Antikörper erkannt werden gebunden werden und Rest wird weggewaschen 3. Zugabe von zweiten Antikörper, welcher ebenfalls gegen das Antigen gerichtet ist, bindet erneut an immobilisierten Antigen 4. Waschen mit Pufferlösung 5. Zugabe des Substrat mit Farmumschlag EIA (ENZYME IMMUNOASSAY) TESTPRINZIP 1. Es werden M. pneumonide spezifische rekombinierte Antigene auf die Platte gegeben 2. Zugabe des Blutes/Serum 3. Die Mykoplasma spezifischen Antikörper binden an das Antigen 4. Antikörper, welcher über eine enzymatische Reaktion verfügt bindet an den ersten 5. Über eine enzymatische Reaktion kann es detektiert und quantifiziert werden ➔ Rückschluss auf Immunstatus, indem man den Titer der Antikörper bestimmen kann WESTERN BLOT Proteinmischung die man in einen porösen Polyacylamid der Größe nach auftrennen kann. Proteine in einem elektrischen Feld trennen sich nach der Behandlung mit einem Probenpuffer entsprechend ihrer Größe auf. Diese Proteine kann man aus dem Gel über Elektroverfahren auf eine Membran transferieren. Zugabe von spezifischen Antikörpern und 2. Antikörper, er eine enzymatische Reaktion trägt. Diese kann man auf der Membran sichtbar machen BAKTERIELLE -SEROLOGISCHE DIAGNOSTIK PRO CONTRA ▪ Einfache Probengewinnung ▪ Ergebnisinterpretation wesentlich schwieriger ▪ Möglichkeit der gleichzeitigen Durchführung als in der Virologie vieler Tests ▪ Bakterien sind komplexe Organismen und ▪ Standardisierte und automatisierbare Methoden induzieren eine vielfältige Immunantwort vorhanden ▪ Einzelwerte oft schwierig zu interpretieren ▪ Rasche Befunderstellung ▪ Teilweise nur wenige aussagekräftige Studien ▪ Sinnvoll, wenn direkter Erregernachweis vorhanden schwierig oder nicht mehr möglich ▪ Publizierte Daten vielfach mit nicht erhältlichen „in-house“ Tests erarbeitet ▪ Kommerziell erhältliche Tests oft unzureichend definiert und validiert