Biologia Molecolare A.A. 2023-2024 PDF

10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 Si continua il discorso relativo alla regolazione delle tecniche dell’espressione genica incominciato la lezione precedente che porterà ad una migliore comprensione delle ragioni biologiche del parad...

10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 Si continua il discorso relativo alla regolazione delle tecniche dell’espressione genica incominciato la lezione precedente che porterà ad una migliore comprensione delle ragioni biologiche del paradosso di C. L’argomento che ci si accinge ad affrontare nelle prossime lezioni è ancora ricco di punti interrogativi poiché il tipo di ricerche necessarie implica affrontare uno stato immediatamente successivo alla fecondazione. Dunque, seppur dal punto di vista sperimentale si abbia la possibilità di riprodurre molti aspetti di quelle che sono le prime fasi di uno sviluppo embrionale, ci sono dei limiti che non possono essere violati. METILAZIONE DEL GENOMA DEI MAMMIFERI La riprogrammazione epigenetica del genoma è un tratto distintivo ed esclusivo dei mammiferi. Nei mammiferi si assistono ad ondate di metilazione e demetilazione del genoma che spiegano l'eredità propria data dalla cellula uovo e dallo spermatozoo di ciascuno Zigote e spiegano le specificazioni delle diverse linee cellulari. Di regola si identificano diverse fasi della riprogrammazione del genoma dei mammiferi. La prima comprende un periodo durante il quale ciascuno zigote deve perdere i tratti tipici delle cellule di origine materna e paterna per generare, sempre nel rispetto dell’eredità genetica, un organismo che presenti dei propri tratti caratteristici. Questa fase avviene prima dell'impianto della blastocisti, nel momento in cui si ha lo sviluppo vero e proprio di un embrione, e consiste in una massiccia ondata di demetilazione del genoma attiva e passiva. Una volta liberatasi dai tratti caratteristici dell’espressione genica materna e paterna, il nuovo embrione deve assumere una propria identità cellulare, istologica e tissutale. Quindi la blastocisti, nelle primissime fasi post impianto, subisce un’ondata di rimetilazione de novo che permette di far assumere a ciascuna cellula all’interno dell’embrione delle caratteristiche proprie. Di fatto l’imprinting, cioè il meccanismo di determinazione epigenetica di una cellula, avviene durante questi passaggi. Un discorso a parte deve essere fatto per le cellule germinali in quanto nell’abbozzo dell’embrione le cellule che fanno parte dei progenitori della linea germinale subiscono un processo epigenetico di re-modelling del proprio genoma del tutto particolare. Questo vede di nuovo la perdita totale delle caratteristiche date alle cellule dell’embrione dal punto di vista della metilazione, perché le linee germinali devono tornare ad essere pulite il più possibile della eredità epigenetica del nuovo organismo. L’ondata di demetilazione delle cellule della linea germinale a livello dell’embrione sarà seguita con tempi diversi nella linea femminile e nella linea maschile, in modo da trasferire anche alla linea germinale alcuni tratti del self di origine materna o paterna. Sbobinatore: Francesco Torelli Revisore: Giacomo Mascarin 10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 Nell’analisi step by step di ciò che è stato scorso, il nostro intento non è quello di chiarire il fenomeno, cosa comunque ancora non possibile, ma capire che questo è l’interruttore per dare un imprinting epigenetico alle diverse cellule di un organismo. RIPROGRAMMAZIONE IN GENERALE E ONDATE DI RIPROGRAMMAZIONE CHE L’EMBRIONE SUBISCE DURANTE LO SVILUPPO INTRAUTERINO Ci sono due ondate di riprogrammazione e di demetilazione epigenetica. In particolare, queste avvengono nella fase immediatamente successiva alla fertilizzazione, nella specificazione delle cellule germinali. Esse inoltre costituiscono le 2 finestre in cui la demetilazione attiva, affidata alle TET, e passiva, affidata alla inibizione della metilasi di mantenimento, hanno luogo all’interno dell’embrione. La cellula uovo e lo spermatozoo, in qualità di gameti che appartengono ad individui specifici, hanno dei tratti distintivi che, nel passaggio da zigote a blastocisti, vengono gradualmente persi. Ciò poichè i genomi di origine materna e paterna vengono demetilati estensivamente grazie all’azione delle TET per quanto concerne al genoma di origine paterna; il genoma dell’oocita invece va incontro, specialmente all‘inizio, a demetilazione passiva poichè la metilasi di mantenimento viene tenuta non attiva a livello nucleare dell’oocita fertilizzato. La perdita dei tratti specifici materni e paterni avviene ad eccezione di una ventina di geni, che verranno trattati nel corso di genetica, costituenti l’imprinting, cioè un set di geni che, nonostante la massiccia ondata di metilazione che le cellule germinali subiscono, mantengono inalterato il profilo di metilazione. Questi costituiscono l’eredità più profonda che ciascun individuo mantiene dai propri antenati. Domanda di uno studente: Perché ci sono dei meccanismi diversi per quanto riguarda il genoma materno e paterno? Non si sa ancora: infatti questo è uno dei tanti interrogativi di questo argomento. Una volta che la blastocisti si è impiantata l‘embrione deve svilupparsi e appunto avviene la cosiddetta specificazione dei tessuti che hanno origine dai 3 foglietti embrionali. Le cellule durante lo sviluppo di un mammifero e fino alla formazione della morula hanno ancora la potenzialità di dare origine a tutti i tessuti dell’embrione, ma man mano che procede lo sviluppo si arriva alla blastocisti: una struttura sferoidale con una parte esterna massicciamente coinvolta nell’impianto dell’embrione nell’utero. Alcune cellule della sua porzione esterna faranno parte degli annessi extra-embrionali che saranno fondamentali per guidare lo sviluppo nelle fasi successive Sbobinatore: Francesco Torelli Revisore: Giacomo Mascarin 10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 all’impianto. Dalla cosiddetta inner cell mass, invece, si svilupperà l’organismo vero e proprio. Questa è una fase particolarmente delicata dello sviluppo dei mammiferi poichè qualunque cellula che viene iniettata o si stacca dall’interno della blastocisti, cambiando la propria posizione all’interna di questa struttura, viene integrata nell’abbozzo dell’embrione ed entra a far parte del nuovo organismo. Inoltre, è in questa fase che può avvenire la manipolazione da parte dell’operatore del genoma. L’embrione è caratterizzato da tre linee cellulari maggiori dalle quali derivano tutte le cellule dell’organismo distinto, stabile e gerarchizzato. Queste tre stratificazioni prendono il nome di ectoderma, mesoderma ed endoderma. Durante lo sviluppo si passa da un momento in cui tutte le cellule sono in grado di dare origine a tutti i tipi di cellule differenziate ad una fase in cui, per esempio, il progenitore dei neuroni darà origine solo ai neuroni. Questa specificazione dei tre grandi gruppi cellulari da cui deriveranno i tessuti avviene una volta che la blastocisti si è impiantata e ha subito la nuova ondata di metilazione de novo. Questa metilazione attiva viene svolta dalle metilasi de novo, DNMT3A e DNMT3B, che danno l’imprinting epigenetico di sviluppo ai progenitori di ciascuna delle cellule presenti nei diversi strati dell’organismo. METILAZIONE NELLO SVILUPPO CELLULE GERMINALI PRIMORIDIALI (PGC) Nella linea germinale si deve assicurare al nuovo embrione uno stato legato alla metilazione tale da garantire la capacità di trasmettere i tratti genetici tipici dell’organismo alla progenie. Nelle primordial germ cells (PGC) si assiste a livello dell’epiblasto, cioè lo strato più esterno dell’embrione, ad un processo di metilazione massiccia seguita da a metilazione differente dal punto di vista temporale se si tratta di un organismo di sesso maschile o di sesso femminile. Infatti i gameti di sesso maschile riacquisiscono completamente i tratti della linea spermatica tipica dell’individuo prima della nascita. Viceversa, gli oociti raggiungo un profilo di metilazione tipico della linea oocitaria, caratteristico dell’individuo nelle fasi immediatamente successive ogni ciclo di ovulazione. In altre parole la ri-metilazione del genoma nella linea spermatica assume una conformazione definitiva prima della nascita, mentre negli organismi di sesso femminile il profilo di metilazione viene acquisito prima di ogni ciclo ovulatorio. Ne consegue che il genoma dell’oocita è in attivo modellamento durante il corso della vita fertile di un mammifero di sesso femminile. Questo excursus è il corollario dell’importanza della metilazione del genoma, con conseguenze dal punto di vista dello sviluppo dell’organismo e clinico-terapeutiche. Inoltre questo discorso ha guadagnato il centro dell'attenzione dei ricercatori perché negli ultimi anni c’è stato un enorme sviluppo di quelle che sono le tecnologie di clonaggio degli organismi complessi (in primis i mammiferi). L'iniziale fallimento della tecnologia di clonaggio, infatti, ha proprio come spiegazione le modificazioni epigenetiche del genoma. Questo argomento verrà trattato l'anno prossimo in un modulo del corso di fisiopatologia però è doveroso, dopo aver parlato di imprinting e di metilazione del genoma, trattare e dare un'idea di quello che sta succedendo nelle applicazioni dell’epigenetica. LA CLONAZIONE Creare genocopie e fenocopie di organismi complessi, come i mammiferi, implica non soltanto una tecnologia estremamente avanzata ma ha anche conseguenze di tipo etico e fisiologico a volte imprevedibili, come nel caso della pecora Dolly. Ian Wilmut ha reso possibile dal punto di vista sperimentale il processo di clonazione della pecora Dolly e ha dato il via alle ricerche nel campo della clonazione. Sbobinatore: Francesco Torelli Revisore: Giacomo Mascarin 10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 Nel 1997 veniva, infatti, pubblicato su Nature il protocollo per generare senza fertilizzazione canonica un mammifero (un ovino), sfruttando una tecnica definita Nuclear Transfer. Questo tipo di tecnologia permette, attraverso il trasferimento del nucleo di una cellula somatica all'interno di un oocita a sua volta enucleato, di creare uno zigote che se trasferito nell’utero di un organismo di una femmina pseudogravida è in grado di generare progenie. Per far avvenire il trasferimento in utero di una femmina pseudogravida la femmina deve avere un asset tissutale uterino propenso all'impianto dell'embrione. Di conseguenza la femmina ricettiva deve avere un livello ormonale e un assetto ormonale propenso ad essere ingravidata. Ciò si ottiene attraverso il pseudoestro, evento normale nei mammiferi inferiori, o con un trattamento farmacologico a base di terapie ormonali. Domanda di uno Studente: La cellula somatica per la clonazione da dove viene estratta? La cellula somatica può essere presa essendo somatica da qualsiasi tipo di tessuto in qualsiasi fase della vita dell'organismo. Il momento della fecondazione viene emulato sottoponendo l’oocita in cui si è trasferito il nucleo somatico a scosse elettriche, le quali mimano le grosse alterazioni ioniche che avvengono a livello di membrana nel momento della penetrazione nel nucleo dello spermatozoo. Questo tipo di pratica sperimentale dà origine in vitro ad una blastocisti che una volta impiantati in utero riesce ad attecchire producendo organismi. La percentuale di successo di questa pratica è dello 0,4%. Questa tecnologia è sicuramente valida: infatti da Dolly, che è mancata nel 2003, sono state create quattro fenocopie perfettamente identiche, ma la percentuale di successo di questa tecnologia resta estremamente bassa. APPLICAZIONI DELLA CLONAZIONE La ricerca sulla clonazione degli animali è partita dalle pecore sia perché il genere ovino è largamente diffuso sia perché l’azienda che supportava la ricerca su Dolly era un’azienda farmaceutica. L'obbiettivo, dunque, era quello di portare alla produzione di farmaci liberati all'interno del latte e facilmente somministrabili, specialmente agli infanti, attraverso una tecnologia avanzata a basso costo. Dagli anni 2000 si è iniziato a parlare in modo sempre più compulsivo di clonazione di mammiferi per svariati motivi Un motivo è legato al bisogno di sfamare fette della popolazione sempre più ampie. La tecnologia della clonazione è stata sfruttata per creare degli allevamenti estremamente ampi di animali, ottimizzati nella produzione di carne ad alto tasso nutritivo. Questo tipo di applicazione sposta l'allevamento dagli ovini ai suini poiché costituiscono l'organismo tissutalmente più simile all'Homo Sapiens, portando alla possibilità di creare delle fonti di organi trapiantabili e geneticamente Sbobinatore: Francesco Torelli Revisore: Giacomo Mascarin 10.1 Biologia Molecolare 20 novembre 2023 modellati su pazienti. L’idea è quella di minimizzare i rischi di rigetto e creare una sorta di banca vivente per far fronte alle esigenze specifiche di ogni singolo paziente. Le liste trapianti sono assolutamente non soddisfabili da quella che è l’offerta e di conseguenza la possibilità di sfruttare la clonazione per questo scopo è una fonte di inesauribile preziosità dal punto di vista terapeutico Ad oggi le specie che sono andate incontro a clonazione sono le più varie e dietro al mondo della clonazione è nato un business. La richiesta di mercato in nicchie precise, ad esempio negli Stati Uniti, è quella di clonare gli animali domestici. Gemini Genetics è una delle aziende più in voga insieme alla ViaGen. I costi sono 50.000 $ per il cane, 25.000 $ per il gatto, 15.000 $ per il furetto, 80.000 $ per cavallo Questo tipo di procedura sta venendo sfruttata anche in ambito veterinario per preservare dall'estinzione alcune specie in drammatico pericolo o per migliorare le specie. Ci sono quindi infinite applicazioni di questa tecnologia, ma quella che assolutamente non è uno dei fini del processo di clonazione è il trattamento dell’infertilità perché il processo di clonazione implica il trapianto nucleare e la manipolazione di quelli che sono gli embrioni in un preciso contesto sperimentale in cui le cellule vengono manipolate. Il fine ultimo di questo tipo di tecnologia è quello di portare alla terapia dei pazienti. L'essere umano in sé però non è manipolabile e allora si deve cercare un escamotage biologico in modo tale che, una volta svelato il funzionamento del processo della clonazione, esso renda possibile la formazione e la creazione di bio-banche tissutali ‘cucite’ sui pazienti in maniera tale da avere la possibilità di usare la tecnologia per correggere, eventualmente in vitro, mutazioni genetiche a carico di uno o molti tipi cellulari. Sbobinatore: Francesco Torelli Revisore: Giacomo Mascarin