Replicación del ADN y Recombinación Genética PDF

REPLICACIÓN DEL DNA EN PROCARIOTES-EUCARIOTES Y RECOMBINACIÓN GÉNICA ¿Como se transmite la información genética con tanta exactitud de una generación a otra? Replicación del DNA Es el mecanismo que permite al DNA duplicarse ¿Inicio de la...

REPLICACIÓN DEL DNA EN PROCARIOTES-EUCARIOTES Y RECOMBINACIÓN GÉNICA ¿Como se transmite la información genética con tanta exactitud de una generación a otra? Replicación del DNA Es el mecanismo que permite al DNA duplicarse ¿Inicio de la replicación ?  Replicón Ya sea que la célula tenga un cromosoma o múltiples cromosomas, el genoma debe ser replicado en cada división celular Una vez iniciada la replicación se termina Replicón: Es una unidad de replicación que contiene un origen Célula procariota: Genoma haploide Plásmidos Un solo replicón Un solo origen de replicación Ori C  Características de origen bacteriano E. coli Ori C 245 pb 11 secuencias palindrómicas Lugares de metilación Metilasa Dam Dam agrega metilos a las Adeninas (ADN metilado) Replicación da lugar a ADN hemimetilado Los productos hemimetilados se acumulan ADN hemimetilado no puede iniciar un ciclo de replicación La replicación no se da hasta que la metilasa Dam metile los orígenes Aprox. 13 min después de la replicación Otros genomas aprox. 1.5 min después  Secuestro de los orígenes de replicación La metilación se puede retrasar Proteína SeqA: Proteína de membrana Se une al ADN hemimetilado Impidiendo la metilación Inhibiendo la función de la DnaA No se da la replicación Además de la secuencia palindrómica el Ori C tiene Unión a la proteína DnaA (DnaA boxes) Unión del factor de integración (IHF) Elementos ricos en AT (DUE) DiaA: Proteína de 196 aa homotetramérica Tiene sitio de unión a la proteína DnaA Estimula el ensamblaje en OriC DnaA se une al sitio de unión del ADN Se forma un complejo IHF, DiA y oligómeros de DnaA-ATP Se abre el DNA Entra la helicasa (DnaB) las enzimas de la replicación Una vez incorporada la replicasa, DnaA se separa del complejo para que no empiece otro ciclo de replicación  Direccionalidad Ojos de replicación, horquillas de replicación ó burbuja de replicación El genoma eucarionte tiene múltiples orígenes de replicación La síntesis comienza en los orígenes de replicación Son secuencias del DNA que no codifican para una proteína Son ricas en A-T Cada cromosoma tiene numerosos orígenes de replicación Se unen mediante dos puentes de hidrogeno Mas fácil de separar que los G-C En estas secuencias se unen proteínas que ayudan a la separación de la doble hebra Permite la formación de la “Horquilla de replicación”  La horquilla de replicación Separación de la doble hélice del DNA Intervienen proteínas que separan y mantienen el DNA abierto Intervienen proteínas que se unen al DNA y lo replican y/o reparan  La replicación es bidireccional y comienza en varios sitios diferentes al mismo tiempo (muchos orígenes de replicación  Los replicones individuales del genoma eucarionte son pequeños Aprox 40 kb-100 kb Se replica mas rápido que el genoma procarionte Si todos los replicones se activaran al mismo tiempo duraría 1 h en replicarse todo el genoma La fase S dura 6 h aprox. Unión de los replicones  Inicio de la replicación en eucariotas Los orígenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ricas en A-T que tienen una secuencia esencial de 11 pb El ORC es un complejo de seis proteínas (400 KD) que se une a una ARS ARS “secuencia de replicación autónoma” Regiones ricas en A-T ORC recluta a Cdc6, al complejo Mcm y a Cdt1 (complejo pre- replicativo) en la etapa G1 (salida de mitosis) En la fase S, se fosforilan Cdc6 y Cdt1, se desinhibe la helicasa permitiendo que las hebras se abran y se de la replicación ORC permanece unido al origen todo el ciclo celular  Orígenes mitocondriales y de cloroplastos ADN mitocondrial está en replicación constante DNA con cadena H y L Replicación asíncrona Las cadenas se replican en tiempos diferentes y distintos orígenes, en dirección contraria El comienzo se da en el origen de la cadena pesada Formando un bucle o lazo D (500-600 pb) Replica la cadena H tomando como molde la cadena L Cuando se alcanza el segundo origen, comienza la replicación de la cadena L en sentido opuesto Un genoma puede tener múltiples lazos D REPLICACIÓN DEL ADN  La replicación da lugar a dos dobles hélices completas a partir de la molécula del DNA original Cada nueva hélice es idéntica , excepto por errores pocos frecuentes Se originan dos moléculas de ADN: Una compuesta de una hebra de ADN original y de una hebra complementaria nueva. Las hebras existentes sirven de molde complementario a las nuevas Velocidad de replicación: aprox. 500 nucleótidos por segundo en las bacterias 50 nucleótidos por segundo en los mamíferos Carácter semiconservador TAREA: Investigar el experimento de Meselson y Stahl En Word, bien explicado y con imágenes No copy-paste Enviar al correo más tardar el miércoles 26/03 Proteínas que intervienen en la síntesis del DNA DNA helicasas Topoisomerasas I y II Proteínas de unión al DNA monocatenario DNA primasas DNA polimerasas DNA ligasa Telomerasa DNA Helicasas Son proteínas motoras requeridas para desenrollar segmentos cortos del DNA original Rompen los puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas Usan la hidrólisis del ATP para separar las hebras de DNA y formar la horquilla de replicación Actúan de forma oligomérica Tiene dominio de unión a ADN, y ATP Se agrupan en 6 superfamilias  Proteínas de unión al DNA monocatenario (SSB) Estructura tri ó tetramérica de 74 kDa con sitio de unión al ADN Impiden que el DNA monocatenario de hibride para formar un DNA bicatenario SSB Protege a la hebra monocatenaria hasta que se sintetice su hebra complementaria Topoisomerasa I: rompe en solo una hebra del DNA y después vuelve los extremos formando nuevos enlaces fosfodiéster Topoisomerasa II: rompe en ambas hebras del DNA , que permite que se desenrrolle y luego las vuelve unir La enzima se envuelve con el DNA y corta las dos hebras Deja pasar por el hueco el resto del DNA Se invierte ATP para el proceso Vuelve a ligar los dos extremos del DNA Relajan el DNA tanto cuando tiene superenrollamiento positivo como negativo, ya que la energía la sacan del superenrollamiento.  DNA primasas Enzima que sintetiza fragmentos pequeños de ARN Necesarios para que replicasa tenga un punto de partida (gpo. 3’OH libre) en la hebra molde Sentido 5’-3’ Inician la síntesis de una molécula de RNA esencial (cebador de RNA) para empezar la síntesis de DNA Los primeros nucleótidos son ribonucleotidos y después desoxirribonucleotidos  DNA Polimerasas Están implicadas en la replicación y reparación del DNA Cada una tiene una función particular Nucleótido trifosfato entrante Pulgar Dedos: interacción con el nucleótido entrante. Dedos Palma: realiza la formación del enlace fosfodiester. Pulgar: Proporciona anclaje a la cadena molde del ADN Palma  ADN polimerasa de E. coli Características Polimerasa I Polimerasa II Polimerasa III Gene estructural Pol A Pol B Pol C Masa (Da) 109,900 120,000 900,000 Constitución monómero monómero Dímero asímetrico V max (nucleotidos/ seg) 16/120 2-5 250-1000 Actividad Exonucleasa 3’-5’ y Exonucleasa 3’-5’ Polimerasa 5’-3’ polimerasa 5’-3’ Función Retira cebadores y rellena Reparación Replicación espacios Exonucleasas: enzimas rompen nucleótidos uno a uno a partir del extremo terminal (exo) de una cadena polinucleotídica  ADN polimerasa en eucariotes Polimerasa Localización Actividad Función  Núcleo Polimerasa 5’-3’ Replicación  Núcleo Exonucleasa 3’-5’ Reparación  Núcleo Polimerasa 5’-3’/exonucleasa 3’-5’ Replicación y reparación Alarga la cadena conductora  Mitocondria Polimerasa 5’-3’/exonucleasa 3’-5’ Replicación y reparación  Núcleo Polimerasa 5’-3’/exonucleasa 3’-5’ Replicación y reparación Alarga la cadena retrasada Parámetros cuantitativos de la duplicación del DNA en diferentes células  DNA Ligasa Enzima que cataliza el cierre de las rupturas del DNA monocatenario Las rupturas se forman cuando se quita el RNA cebador y se cambia por nucleótidos Se encarga de crear el último enlace fosfodiéster entre los nucleótidos adyacentes de una hebra de DNA  Telomerasa Telómero: Repeticiones de TTAGGG en el DNA Se encuentran en los extremos de los cromosomas Protegen de la degradación del DNA El telómero se va acortando con cada división celular El acortamiento forma parte del envejecimiento normal La telomerasa: Se encarga de añadir repeticiones TTAGGG en los extremos de los cromosomas Coloca el RNA cebador complementario (UCCCAA) La DNA polimerasa sintetiza el fragmento faltante ver video La oveja clonada Dolly, muestra su edad Dolly, primer animal que se clono en 1997 Mediante células somáticas y transferencia nuclear Las células se obtuvieron de la glándula mamaria de una oveja donante Dolly es un duplicado genético de la oveja donante Al nacer parecía normal y desarrollo convencionalmente hasta los 3 años Se hicieron análisis de los telómeros de los cromosomas y revelaron que eran mas cortos que los de una oveja de su edad Los telómeros de Dolly tenían la longitud de una oveja de 6 años Edad de la oveja de cuyas células se clono Dolly video Dolly murió de enfermedad pulmonar a los 6 años Por lo que Dolly biológicamente era mucho mayor que se edad cronológica  Mecanismo de la Replicación del DNA La replicación procede siempre en añadir un nuevo nucleótido Las DNA polimerasas (DNA pol) sintetizan el nuevo DNA en sentido 5’-3’ Por lo que la cadena molde debe estar en sentido 3’-5’ Las DNA polimerasas requieren un extremo 3´-OH libre en el nucleótido sobre el que va a hacer la unión  Una vez que se activo la replicación del DNA Las moléculas de la replicación llegan a los orígenes de replicación Se forma la burbuja de replicación con sus respectivas horquillas Las DNA polimerasas son las encargadas de la replicación del DNA Se necesita un dímero de DNA polimerasa “un monómero para cada hebra” El dímero de DNA-pol se mueve en sentido de la horquilla de replicación Ver video Replicación del DNA https://www.youtube.com/watch?v=SMLSAl5igeY  La replicación es semidiscontinua Las DNA pol “leen” una hebra en sentido 3’-5’ y sintetiza la copian en sentido 5’-3’ Como el DNA tiene dos hebras antiparalelas: La DNA-pol sintetiza una hebra continua de 5’-3’, es la hebra adelantada o continua La otra hebra se sintetiza también en sentido 5’-3’ pero de forma retrasada o discontinua, se forman fragmentos de Okazaki ( de 100 a 200 nucleótidos) ¿Como hace la DNA-pol para sintetizar la hebra retrasada? Las DNA-pol “leen” una hebra en sentido 3’-5’ y sintetiza la copian en sentido 5’-3’ La otra hebra se encuentra en sentido 5’-3’ Sin embargo, la hebra debe entrar a la DNA-pol en sentido 3’-5’ Como sucede eso? Se forma un loop “bucle” de DNA, para que la cadena entre a la DNA-pol en sentido 3’-5’ y la copia se haga en sentido 5’-3’  En la cadena retrasada, se coloca un cebador de RNA complementario al DNA molde La polimerasa se ensambla sobre la cadena DNA molde y el primer  Se forma el loop-DNA La DNA-pol sintetiza un fragmento de Okazaki en dirección 5’-3’, aprox. 100-200 nucleótidos Hasta el inicio del fragmento del fragmento de Okazaki vecino La polimerasa se suelta y vuelve a unirse el cebador en otro segmento del DNA molde y se repite el proceso Ver video DNA replication --Signalling model for loop release  A la vez que se sintetizan los fragmentos de Okazaki : La polimerasa I se posiciona sobre la muesca entre fragmentos de Okazaki LA DNA-pol I quita los cebadores de RNA de los fragmentos de Okazaki y sintetiza DNA en esa sección Punto clave: apareamiento y Finalmente, la DNA ligasa une los fragmentos complementariedad del ADN adyacentes RECOMBINACIÓN DEL ADN  El apareamiento de las bases nitrogenadas es fundamental para todos los procesos relacionados con los ácidos nucleicos. Generación de las nuevas cadenas de ADN Recombinación genética Meiosis en Generación de combinaciones nuevas de alelos en cada generación células de organismo diploides eucariotas Resulta del intercambio físico o entrecruzamiento del material cromosómico (meiosis) Tipos de procesos de recombinación genética: Recombinación homóloga o general Recombinación heteróloga Transposicón  Recombinación homóloga Es el resultado de un entrecruzamiento se llama quiasma (sitio en que do de las cromátidas de un bivalente se han roto en puntos específicos Solo se da en dos de las 4 cromátidas Ejemplo: Recombinación homóloga de E. coli 1. La endonucleasa genera escisión en el DNA 2. Helicasa separa las hebras de DNA 3. SSB evita la hibridación se cadenas sencillas 4. Unión a RecA: facilita alineamiento con secuencia complementaria de DNA adyacente 5. Intercambio de DNA homólogo 6. REGIONES HETERODÚPLEX Quiasma  Recombinación heteróloga o específica de lugar El intercambio se produce entre secuencias cortas de nucleótidos Son reconocidas específicamente por una enzima de recombinación específica de lugar La recombinación específica de lugar altera las posiciones relativas de las secuencias de nucleótidos en los genomas  Sistema de reparación por recombinación Polimerasa es incapaz de reconocer una hebra para replicarla por daños en el ADN Complejo replicativo lo salta y comienza más adelante Generándose un hueco en el ADN muy cerca de la horquilla El proceso de replicación termina cuando toda la cadena de DNA es duplicada, sin errores Las inserciones, deleciones producto de duplicación o recombinación, así como agentes químicos o ambientales también puede generar errores. MUTACIONES EN EL ADN Los organismos experimentan cierto número de mutaciones como resultado de las funciones celulares rutinarias Mutaciones espontaneas Son eventos raros Sin exposición a mutágenos Mutaciones dañinas se eliminan durante la evolución El incremento de mutaciones se da con Por Mutaciones originadas por: la exposición a mutágenos Errores en la replicación Mutaciones inducidas Radicales libres oxidativos Quimioterapias Radiaciones ionizantes “rayos X, radioactividad, Rayos UV del sol”  Mutación espontanea Cambia solo un par de bases provocado por: Modificación química del ADN (una base se convierte en otra) Error en la replicación (inserción de una base por otra) Emparejamiento erróneo (A-G, A-C, T-G, T-C) Hay una probabilidad de mutación en todas las bases de la secuencia Puntos calientes Sitios donde pueden ocurrir de 10 a 100 veces más mutaciones espontaneas Los mutágenos diferentes pueden tener diferentes puntos calientes  ¿Perdida o ganancia de la función? Mutaciones recesivas: perdida total o parcial de función de la proteína Mutaciones dominantes: ganancia de función (aún cuando solo muta en la secuencia de uno de los cromosomas) Mutaciones silenciosas: no tienen ningún efecto en el fenotipo Mutaciones rezumantes ó hipomorfas: se produce una cantidad suficiente de proteína para que cumpla con su función, aunque la actividad se reduce  Sistemas de reparación del DNA Reparación de emparejamientos erróneos Este fallo se hace al momento de la replicación, cuando la ADN polimerasa agrega nucleótidos que no se aparean Ej. A-G Proteínas que reparan el error: MSH2, MLH1, MSH6, PMS1 Y PMS2 Una mutación en los genes que codifican para esas proteínas predispone a la persona a una forma de cáncer heredada de: Colon Endometrio Ovario Estómago Reparación por escisión “fragmentación” de bases En ocasiones las bases nitrogenadas pierden el grupo amino, lo que genera: La conversión de Citocina en Uracilo Uracil (U) (RNA) Esta reparación implica el reconocimiento y eliminación de los nucleótidos modificados Reparación por escisión de nucleótidos Esta sirve para eliminar lesiones en el DNA generado por Luz UV o sustancias químicas que provocan: Formación de dímeros de Timinas adyacentes en el DNA Cuando hay mutaciones en las enzimas que reparan el DNA por escisión de nucleótidos se producen enfermedades: Xerodermia pigmentosa Por la Luz UV se forman dímeros de timina Alguna de las enzimas que repara el DNA “el gen esta mutado” por lo tanto no hay enzima Consecuencia: La reparación no se lleva a cabo Pacientes propensos a cáncer de piel  Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes “Polimorfismo” RFLP y SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético MAPEO DE UN GEN