Metilazione e demetilazione PDF

9.2 biologia molecolare 14/11/2023 METILAZIONE E DEMETILAZIONE LE METILTRANSFERASI Siamo arrivati a scoprire l'esistenza di due classi di metil-transferasi, entrambe essenziali alla vita e allo sviluppo di un vertebrato, in cui si d...

9.2 biologia molecolare 14/11/2023 METILAZIONE E DEMETILAZIONE LE METILTRANSFERASI Siamo arrivati a scoprire l'esistenza di due classi di metil-transferasi, entrambe essenziali alla vita e allo sviluppo di un vertebrato, in cui si delineano specificità diverse: Le metilasi di tipo 1 o di mantenimento: contribuiscono al mantenimento e all'identificazione del self di una cellula, quindi dell'identità a livello molecolare dell'espressione genica. Le metilasi di classe 3 o de novo: sono fondamentali nelle ondate morfogenetiche che avvengono a livello degli embrioni durante il loro sviluppo. IL MANTENIMENTO DEL PROFILO DI METILAZIONE Il trasferimento sul filamento neosintetizzato del profilo di metilazione (cioè del gruppo metile) della cellula parentale è svolto dalla metilasi di mantenimento, nelle fasi immediatamente successive al passaggio della forca replicativa. La metilasi di mantenimento fa quindi parte del complesso DNA polimerasico, perché non si può far correre il rischio ad una cellula che ha appena duplicato il suo genoma di avere incertezze sulla propria identità e di passare a uno stato di emimetilazione. Di conseguenza, sul filamento che è stato duplicato, i nucleosomi avranno le modificazioni chimiche immediatamente copiate perché il mantenimento del profilo epigenetico di una cellula, cioè la capacità di identificare una cellula col tipo di RNA messaggero che esprime, si basa anche su questo tipo di modificazioni. Si ha quindi un passaggio delle modificazioni a livello istonico e un passaggio delle modificazioni genetiche a livello di DNA. Perciò, quando si parla di complesso di duplicazione non si intende solo la replicasi, ma anche l'intorno delle proteine che contribuiscono ad ottimizzare il processo. Tra queste ci sono le metil-transferasi e le proteine MeCP2 (immagine a destra), che sigillano il profilo di metilazione una volta che viene stabilita l'espressione di un gene, in modo da proteggere il gruppo metile ed evitare attivazioni aberranti. Sbobinatore: Bogdana Ostahie Revisore: Leonardo Signor 9.2 biologia molecolare 14/11/2023 I GENI HOUSEKEEPING Fino ad ora si è parlato di metilazione, di corpo di Barr e di proteine che vanno a sigillare quello che è l'intorno del DNA, arrivando alla completa repressione dell'espressione genica di un certo gene. C'è tuttavia un'eccezione che non rientra in quello che è stato spiegato fino ad ora, ovvero i geni housekeeping. La professoressa ricorda che: I geni housekeeping vengono costitutivamente espressi dalle cellule di un organismo multicellulare, e sono caratterizzati dal non avere un promotore con la tata box, ma multiple ripetizioni di sequenze ricche di citosine e guanine che formano degli isolotti, le CpG islands, a livello della cromatina. I geni housekeeping sono legati dal fattore di trascrizione Sp1, un fattore di trascrizione ubiquitario che guida l'espressione costitutiva di questi geni. Si sa che la modificazione che va a reprimere in maniera definitiva l'attività trascrizionale della polimerasi è la metilazione della citosina, che è super abbondante in questi geni espressi ad altissimi livelli. Tuttavia i promotori dei geni housekeeping non possono, per definizione, mai essere metilati; di conseguenza, ci deve essere qualcosa che eviti che queste zone vengano metilate ma non si sa tuttora come questo avvenga. Quello che si sa è che non è l'intorno nucleotidico, quindi la sequenza in sé, quello che repelle la metilasi di mantenimento, dato che sul cromosoma X che deve essere compattato e represso le CpG islands sono metilate. LA GLOBINA Esempio classico di come avviene la regolazione da parte della metilazione dell'espressione genica è quello della globina, la proteina globulare incaricata negli eritrociti di coniugare il gruppo eme per trasportare l'ossigeno a livello tessutale. Nei vertebrati sono espresse tre isoforme di questa globina perchè durante le fasi di sviluppo cambia l’affinità con l’ossigeno. Sbobinatore: Bogdana Ostahie Revisore: Leonardo Signor 9.2 biologia molecolare 14/11/2023 Le tre isoforme della globina sono: Epsilon globina, durante le prime fasi dello sviluppo embrionale; Delta globina, durante lo sviluppo intrauterino; Beta globina, la cui espressione sale in maniera significativa in corrispondenza della nascita ed è l'isoforma che viene mantenuta durante la vita adulta. All'interno delle stesse cellule, ad ogni singolo punto dello sviluppo degli embrioni, viene mantenuto il profilo di metilazione dei promotori dalla metilasi di mantenimento, ma il cambio dell'espressione che avviene durante le diverse fasi dello sviluppo embrionale è guidato dalle metiltransferasi de novo. Per passare dalla globina fetale a quella adulta, è necessario esprimere un promotore prima inespresso, devono quindi essere tolti i gruppi metili in modo tale che il gene diventi trascrizionalmente attivo. Questo implica che la metilazione sia una reazione reversibile: ci sarà la possibilità all'interno delle cellule dei vertebrati, anche di rivertire la metilazione. LA REVERSIBILITÀ DELLA METILAZIONE Due sono le ipotesi più forti che potrebbero spiegare il meccanismo di perdita di metilazione: Demetilazione attiva: una demetilasi cancella i metili dalla citosina e rende quindi accessibile i promotori di un dato gene alla trascrizione; Demetilazione passiva: si va ad inibire la metilasi di mantenimento, ottenendo così due molecole di DNA emimetilate, le quali durante i cicli di replicazione successivi andranno a perdere completamente il profilo metilato. Nel febbraio del 1999, su Nature, venne pubblicato un articolo dal gruppo di un grande studioso, che fa parte dei fondatori di quella che è la moderna epigenetica e uno dei maggiori esperti mondiali di trascrizione negli eucarioti. In questo articolo (immagine a destra) si riportava l'individuazione della demetilasi, specifica per le 5 metil-citosine, che era in grado di legarsi con residui ben precisi al gruppo metile e in qualche modo ripartire la reazione producendo metanolo. Questo articolo ha fatto la storia della ricerca epigenetica perché l’enzima chiariva tanti dubbi ancora oggi poco chiari; tuttavia, è stato dichiarato uno dei più grandi falsi della letteratura scientifica recente. Sbobinatore: Bogdana Ostahie Revisore: Leonardo Signor 9.2 biologia molecolare 14/11/2023 Di fatto, la demetilazione delle citosine avviene davvero e un articolo pubblicato nel 2012, 13 anni dopo il grande fake, ha chiarito in maniera assoluta e indiscutibile le modalità del processo di demetilazione nelle cellule dei vertebrati. Questo processo (immagine sopra) non coinvolge una reazione diretta, ma prevede degli step di ossidazione successive che portano alla creazione di una citosina, che viene sentita dal meccanismo di riparazione come una mutazione puntiforme. Quindi questa carbossi-citosina (o formil-citosina) viene sentita dalla macchina di riparazione delle mutazioni puntiformi come una mutazione puntiforme che viene riparata tramite il BER. In breve, i meccanismi che governano il processo di demetilazione sono due: Demetilazione passiva durante le successive divisioni; Azione delle proteine TET, che vanno a lavorare con la demetilazione attiva in modo da andare a modificare quello che è il profilo di metilazione durante le varie fasi dello sviluppo embrionale. Sbobinatore: Bogdana Ostahie Revisore: Leonardo Signor