Técnicas Moleculares de Diagnóstico Viral PDF

Qiaxel - Qiagel Secuenciación Lo Todo el Genoma sec de exomu Lo sulo los exones to Lo Panel =ovarios exones Técnicas moleculares de diag...

Qiaxel - Qiagel Secuenciación Lo Todo el Genoma sec de exomu Lo sulo los exones to Lo Panel =ovarios exones Técnicas moleculares de diagnóstico viral Configuración adn ® Para poder empezar PCR, hay que recordar cómo estaba configurado el ADN. Recordemos que el ADN estaba formado por 1azúcar (nucleósido) y 1 base nitrogenada. Cuando se le agrega la base nitrogenada al nucleósido se forma el nucleótido. ® El ADN está formado por 4 nucleótidos: Guanina, Citosina, Adenina y Timina. ® El ADN está configurado de manera que 1 hebra va de 5´a 3´ y otra hebra de 3´a 5´, de manera complementaria. ® Las guaninas van a estar unidas a las citosinas y las timinas van a estar unidas con las adeninas. ESTAS BASES SIEMPRE VAN A SER COMPLEMENTARIAS. ® Esto es importante, porque nosotros vamos a copiar los nucleótidos, entonces hay que saber cómo está compuesto para amplificarlas Fundamento de una reacción en cadena de la polimerasa ® Tenemos ADN doble banda y le aplicamos calor (95oC), pasa lo siguiente: ® ADN de doble banda se abre, se hace una cadena sencilla y separa cada una de las regiones genéticas (de 5´ a 3´ y la complementaria de 3´ a 5´). Entonces, con calor logro separas las dos hebras que inicialmente estaban unidas. Dalit Schutz Lerner 1  ® Cuando ya tengo las 2 bandas separadas, hay que detectar una región y eso se define en el laboratorio. Entonces, si uno detecta una región de un gen específico, no se tiene que parecer a ninguna otra región porque sino tendría un problema y ese problema es que tenía un gen presente cuando en realidad tenía uno que se parecía mucho y esto en diagnóstico molecular de virus NO puede suceder. ® Para poder detectar cierta región, se dirige un segmento que se va a unir a una región específicamente y no se va a unir en otro lugar, sino que solamente ahí. ¿Cómo se diseña esto en un laboratorio¿ por ejemplo, con SARS-CoV-2 se busca las estructuras más conservadas de este virus, las que mutan menos y las que cambian menos y se ve que secuencia de nucleótidos tiene. Se agarra cierta cantidad de nucleótidos para 5´-3´y la misma cantidad para 3´-5´. ® Esa región que se toma/agarra como segmento se llamara primer. ® Primer es una cadena pequeña de ADN/segmento pequeño de ADN complementario a región que quiero marcar en un gen, en este primer al final hay una región (grupo hidroxilo) que favorece al sitio de anclaje para una enzima (polimerasa). o Hay Primer forward y Primer reverse ® La polimerasa va a reconocer esa región del primer y se pega ahí. ® La polimerasa después de pegarse, comienza a sintetizar una hebra complementaria a partir del primer, es decir, la polimerasa (estructura roja) llega, se une al primer y con la adición de nucleótidos los empieza a pegar de manera complementaria y con eso hace una nueva cadena. ® Una vez que la polimerasa termina de hacer eso, de la cadena de arriba se obtiene una cadena de ADN (la original + la sintetizada) y de la otra cadena de abajo, otra polimerasa me hace exactamente lo mismo. Entonces, tengo dos productos de esta reacción. ® Veamos que partimos con 1 cadena de ADN de doble banda y terminamos con 2 cadenas de ADN de doble banda. ® Ahora, en un segundo ciclo, con la nueva cadena de 1 banda original + 1 banda sintetizada, se va hacer lo mismo que se hizo con la anterior y se termina con 2 cadenas más de cada una de las que se sintetizaron, es decir con 4 cadenas más de doble banda y así sucesivamente. ® En el ciclo 1 se obtuvo 2 copias de ADN, en el ciclo dos se obtienen 4 copias, en el ciclo 3 se obtendrían 8 copias de ADN…Si hacemos 50 ciclos, eso va ser una cantidad de ADN amplificada de manera exponencial. ® Es exponencial porque la formula (la que se ve en la imagen que esta dentro del cuadrado turquesa) de esta reacción es 2x10n, donde n es el número de ciclos del PCR. Dalit Schutz Lerner 2  o Entonces, se parte de una hebra de ADN y tenemos miles de millones de copias cuando terminamos una reacción de 50 ciclos, por ejemplo. Pregunta de Jonathan Nunca entendió cómo se visualiza cuando ya está amplificado. ¿Cómo uno sabe que se esta amplificando o que ya está amplificado? ® Respuesta del profeà Al principio no se puede visualizar porque visualizar 1 sola copia es muy difícil. Si quisiera visualizar 1 sola copia, hacer PCR no tendría sentido porque si nos dan la muestra y nos dicen ?tiene virus o no tiene virus? Y di la respuesta es tiene 1 copia, entonces si tiene. Más adelante se explica mejor esto. Pregunta de Gonzálo ® ¿Al amplificar el ADN, se amplifica toda la hebra, o es solo un segmento específico? Un segmento en específico ® Usted dijo que con calor se abrían las hebras, ¿cómo hago, para que solo con calor se abra en el segmento que yo quiero? El ADN se abre en su totalidad, ahora, ¿cómo llego a la región de mi interés? Por medio de los primers, utilizando el primer puedo ubicar la región que deseo, por eso, éste debe ser específico. o Para diseñar el primer, se debe estar seguro de que la secuencia de nucleótidos a utilizar solamente está ahí (es única y específica), es decir que no se repite en ningún otro lugar del genoma. o Usualmente los primers son de 40 o 50 nucleótidos (para darle especificidad), porque si se hacen de pocos nucleótidos es muy probable que esa combinación se repita muchas veces a lo largo del genoma. Se requiere de un primer más grande para que esa combinación sea más difícil de ubicar a lo largo del genoma. ® ¿Entonces no se abre todo un marco de lectura, sino las 2 hebras? Exactamente, usted tiene que “targetear” la diana específica (el gen que se desea) con un primer. o No se desea determinar cualquier región del genoma del microorganismo, sino una región que ojalá únicamente tenga ese espécimen, por tanto, debo determinar cuál es la secuencia del virus que deseo y que lo diferencia de los otros. o ¿Cómo determino esa secuencia diferenciante en un virus, específicamente? Por medio de la secuenciación completa del genoma del virus y compararlo con los genomas de los demás virus, Dalit Schutz Lerner 3  las regiones que sean únicas y diferenciantes en mi virus de estudio, en comparación con los otros, es las que se “targetean” en el PCR. ¿Cómo determino la secuencia que quiero determinar que no se parece a ninguna otra? ® Se hace una secuenciación, o sea, se determina todos los aminoácidos de todo el genoma y se compara con la secuencia de los otros virus Ver Video: Polymarase Chain Reaction (PCR) PCR convencional ® Supongamos que queremos determinar la presencia de un gen de un virus como el Virus Respiratorio Sincitial en un niño o un bebé. Pero se quiere hacer eso en sangre. ® Se hace un PCR para ver se logra “pescarlo”: ® Paso 1 o obtengo la muestra de sangre del paciente. Me llevo esa muestra de sangre al laboratorio y hago el paso 2 ® Paso 2 o Extraer el material genético. Para esto hay un montón de métodos, se puede usar un kit especial o manual, también equipos automatizados que hacen todo. Entonces, una vez que ya se tiene el ADN extraído en el tubo eppendorf. ® Paso 3 o Reacción de PCR. En el laboratorio se mezcla: un reactivo de polimerasa, un reactivo con primers, un reactivo con nucleótidos, agua para equilibrar la reacción y los otros reactivos que vienen en Dalit Schutz Lerner 4  los PCRs. Se mezcla todo en el tubo y se agrega a un strip de pocillps y luego se agregan las muestras. Se tapa bien para que no se condense y se mete a un equipo. o Se mete al termociclador y que lo que hace es subir la temperatura, abrir el ADN (queda expuesto todo el genoma) y con los primers que se le agregó se unen a regiones específicas, llega la polimerasa a pegarse y comienza a sintetizar hebras. Termina el primer ciclo y hace lo mismo para un segundo, tercero y muchos ciclos más. ® Paso 4 o Cuando ya tengo en el tubito las miles de copias hay que evidenciarlo de alguna manera y hay varias formas de hacerlo. Dependiendo del PCR que uno hace se puede evidenciar de distintas maneras. Le decimos PCR convencional cuando obtenemos todos esos amplicones (ADN amplificado) del mismo tamaño. Si se corre ese ADN en una electroforesis, ese ADN empieza a migrar de acuerdo al tamaño y a la carga, cuando se revela el gel, en la columna de peso molecular se va a ver una raya en 100, otra en 500, otra en 1000, otra es 1500 y asi sucesivamente hasta 2000-3000 pares de bases. ® Si uno ya sabía que pesaba por ejemplo, 500, si yo tengo muchos amplicones, a la par de donde dice 500 en la columna de peso molecular, se va a tener una mancha/rayita y eso significa que hay un montones de amplicones ® Entonces, un PCR convencional se puede correr en un gel de agarosa para revelarlo ® Paso 5: una vez que termina el termociclador, se monta el gel de agarosa y correrlo, el cual dura 1 hora, esperar y revelarlo en una plataforma luminiscente para poder ver. ® Por lo general lo marca el gel con bromuro de tidio para que cuando corre, cada pocillo vaya rastrando el bromuro y uno logre ver una mancha fluorescente para después montarlo en una plataforma fluorescente Desnaturalización ® In vivo: complejo de replicación ® In vitro: a 95 oC Dalit Schutz Lerner 5  Con respecto a la imagen, es un proceso normal de un PCR convencional. Lo que se nos quiere dar a entender son los diferentes procesos ® Proceso de desnaturalización ® Cuando se abren las cadenas a 95 grados ® Con respecto a esta otra imagen, están las regiones originales (las que están dentro del círculo morado) y al frente tiene los primers(las que están dentro del círculo verde). ® El grupo hidroxilo (HO) queda suelto y llega la polimerasa a pegarse ahí. ® El Anneling que es cuando se pegan los primers se da a 50 grados ® Si vemos hacia la derecha sigue extendiéndose y sintetizando la cadenas. ® El proceso de elongación se da a 72 oC Dalit Schutz Lerner 6  ® Aquí se ve todo el producto amplificado al final de la reacción Respecto a la imágenes de arriba ® Esto es un ejemplo donde se puede ver un gel ® En el caso de la imagen de la derecha o En pocillo 1se corrió una escalera de pesos moleculares. Es como un líquido que viene con muchos pedacitos de ADN con diferentes pesos moleculares. Cuando uno hace la corrida empieza a migrar, en 250 quedan pegados los más pequeños y sigue migrando hasta llegar a la más grande. o El pocillo 8 es un control negativo o Asumamos que el pocillo 7 es un control positivo que uno ya sabia que la rayita iba a dar en 574 pb. o De los pocillos 2 al 6 son muestras de paciente. Todas esas muestras tienen el gel que a uno le interesaba y se pudo evidenciar. o Si alguno de los pocillos de muestras hubiera estado negativo, hubiera dado como el pocillo 8. Dalit Schutz Lerner 7 Electroforesis capilar ® Para no tener que hacer todo lo del gel y eso ya que es un poco tedioso. ® Este equipo hace lo que haría un gel: corre por medio de un capilar muy delgado, va separando por peso molecular (tamaño de los amplicones) y hace un gel pero en una pantalla. ® Ventaja: No hay hacer el gel, no hay que ensuciarse, ni usar el bromuro de tidio que es cancerígeno ® Desventaja: alto costo y no se encuetra en todos los laboratorios ® Este equipo que se ve en la imagen se llama QAxcel, pero hay más modelos ® OJO: para revelar PCR punto final o PCR convencionales, en los cuales después de termociclar hay que hacer alguna de estas metodologías para poder ver que fue lo que se obtuvo. PCR en tiempo real Es un PCR en el que no hay que esperar hasta que termine el equipo los 50 ciclos de termociclador, sino que se ve la amplificación después de que cada uno de los 50 ciclos termina. ¿Cómo es posible hacer esto? ® NO se puede usar un termociclador porque no me evidencia de ninguna manera lo que quiero saber. ® Tampoco los reactivos me permiten revelar Dalit Schutz Lerner 8 El fundamento es el mismo en términos basales. ® Se parte de una hebra de ADN, se abre y con el primer se pega la polimerasa y ponen nucleótidos y estos nucleótidos extienden la cadena y forman una copia y luego pasa otra vez lo mismo para formar otra copia. ® Pero se necesita ir viendo en tiempo real, o sea, cuando cada ciclo termina, que esto se esta amplificando. ® A alguien se le ocurrió que cada uno de los nucleótidos que iba incorporando la polimerasa, no fuera un nucleótido común y corriente, sino que ese nucleótido este marcado con un fluoróforo, es decir, una molécula flourescente. ® Entonces, cada vez que uno incorpora en un PCR real un fluoróforo a la cadena que se va a sintetizando nueva, se van sintetizando también con ese nucleótido se va incorporando una molécula de un fluoróforo. ® Al principio se tiene una copia únicamente y el fluoróforo se va a pegas a esa copia y va a empezar a extenderse. En el segundo ciclo, cada nucleótido va a tener fluoróforos entonces ya no hay un fluoróforo sino que 20 o 30, depende de los nucleótidos que se incorporaron, por lo que la fluorescencia va ir aumentando. En el tercer ciclo ya no son 20 o 30 fluoróforos, van hacer 80-100. En el cuarto ciclo van a ser 400. En el quinto ciclo 1600 moléculos de fluoróforo. La cantidad de va ir creciendo de manera exponencial, tal como crece el número de copias de ADN en el PCR. Viendo la gráfica de arriba ® Las unidades de fluorescencia están en el eje “y” y en el eje “x” se encuentra el numero de ciclos que lleva la reacción. Dalit Schutz Lerner 9  ® En los primeros ciclos, la cantidad de fluorescencia es muy baja por lo que no se va a detectar y no se va a incorporar bien por que no hay un numero de copias adecuado para lograr verlo. ® Hay un momento (punto morado), maso menos en el ciclo 10, donde la fluorescencia empieza aumentar exponencialmente, y comienza hacerse tan grande de un ciclo a otro que cuando se grafica aumenta tanto que llega un momento donde llega a una fase exponencial, es decir, aumenta muy rápido y llega al final donde hay una meseta (donde dice Plateau) donde no hay más reactivo ni fluoróforo y ahí termino. ® En la fase exponencial, hay un momento donde se dispara. Ese momento en el cual se dispara, se va a fijar un umbral (línea punteada) y se ve que ahí es donde se disparo exponencialmente (matemáticamente hablando) o Matemáticamente hablandoà en una curva de este tipo donde se ve una recta tangente en ese punto, es la primera derivada de la curva, es decir, es la recta tangente a un punto específico. Entonces, donde tengo la primera derivada corresponde a un valor que corresponde a un número de ciclo. ® Entonces, en el ciclo cero no había fluorescencia, llego al ciclo 10 y la fluorescencia apareció. Aumento al ciclo 20 y llega un momento donde se disparó la fluorescencia y eso es en un ciclo determinado, puede ser en el ciclo 19, en ciclo 20, pero en este caso es en el ciclo 18,5 en el cual obtuve el valor de CT. ® El valor de CT es el cual se corta y empieza aumentar exponencialmente la fluorescencia, entonces a partir de ese valor se dice que la muestra esta positiva. ® Este es un concepto importante en virus porque entra más cantidad de ADN o ARN yo tenga en mi muestra, más temprano se alcanza la fase exponencial, es decir, si se tiene mucha cantidad de ADN o ARN no hay necesidad de llegar al ciclo 40 para que esa curva (la roja) se levante, sino que se va a levantar muy rápido ya que va haber mucho insumo para que se de la reacción de PCR y se amplifique exponencialmente y se desplace hacia la izquierda. ® Si la cantidad de antígenos o en este caso ADN o ARN es muy bajita va a costar más que la curva azul comience a levantarse y se desplace hacia la derecha y el valor de CT va a ser más alto. ® Cuando se ve un PCR para SARS-CoV-2 por ejemplo, y se ve que los laboratorios reportan valores de CT y ese CT fue muy bajito, quiere decir que fue muy fácil amplificar, pero si el CT es un valor muy alto quiere decir que costó más amplificarlo. ¿Por qué? Puede ser que el paciente tenga una carga viral muy baja, o que la muestra estaba muy diluida, muestra fue mal tomada Dalit Schutz Lerner 10 Para reforzar ® El valor de CT es el valor en el cual la curva levantó exponencialmente y se logra definir matemáticamente un punto de intrificación exponencial. ® Eso es lo que me dice que la muestra tiene un CT de 20 por ejemplo. Se reporta al pacienteà Gen RDRP (de la ARN Polimerasa ARN Dependiente) Gen N (de la nucleoproteína) Gen S (de la espícula). o Entonces, se detecto un gen que codifica por esa proteína y se amplificó en el momento en el que la curva llegó a una fase exponencial. ® Al paciente se reporta: CT del gen N en 20. o Del gen E en 21 o Del gen RDRP en 25 o 15à lo que le diga el equipo Pregunta de Andrey ® ¿No importa que tan elevado esté el CT? Con que uno tengo un número de CT ya sea alto o bajo, ¿eso significa quela prueba está positiva? Si se hace un PCR para SARS-Cov-2 y se hacen 50 ciclos. Se va a detectar el gen RDRP o Paciente 1: CT fue de 20. Un CT de 20 para 50 ciclos es bastante bueno y temprano. Con un CT de ese número, la carga viral estaba elevada porque se detectó muy temprano. o Pacientes con CT 15 pero muestra que amplifica en 45: ¿eso sería una muestra con carga viral tan baja porque amplifico hasta el final o muestra mal tomada o amplificación inespecífica? Para saber esto, el fabricante dice que por ejemplo, que si amplifica después de 40 o 45 ya es inespecífico porque ninguna muestra positiva que se uso para la validación amplificó después de 40. Entonces si el fabricante dice que cualquier muestra que sale después de 40 se reporta negativo, uno toma la palabra del fabricante. § Entonces si amplifica en 45 es negativo pero si amplifica en 38,9 es positivo pero si sale 40 es negativo. Esto no sucede así. § Lo que se puede hacer es repetir la muestra y hacer preguntas para recolectar información epidemiológica y con esta info se toma la decisión de cómo reportarlo. Dalit Schutz Lerner 11 Pregunta de Alejandra ® ¿El CT se relaciona de alguna manera con la severidad de los síntomas del paciente? Podría ser. Al principio de la pandemia, los doctores usaban este criterio para guiarse, aunque esto no necesariamente se cumplía ya que la muestra puede ser que fue mal tomada. o Ahora que las personas están vacunadas, los CT eran muy altos porque las cargas virales eran muy bajas, entonces se tenía un CT muy alto, como de 75-77 y se fijaban en la hoja de INCENSA y decía 2 dosis entonces se refleja que las vacunas si están funcionando. Pregunta de Anadilia ® ¿Sirve de algo cuando los CT dan así, decirle al paciente que se espere una x cantidad de tiempo antes de repetir la prueba? Eso depende de la fase en la que el paciente esté. Por ejemplo, si se le hace a un paciente que está empezando el cuadro y se la repite en 3 días, talvez en esos 3 días ya tiene más síntomas o su carga viral aumentó. Lo que es cuando se le hace una prueba a un paciente que esta en la etapa final de la infección y se le hace un PCR y sale indeterminada con un CT muy alto y se la vuelve hacer dentro de 3-5 días, esos es peor porque esta segunda muestra se va a tomas cuando haya menor expresión de virus. Dato extra: por la información que sabemos y que debemos saber y cosas que tenemos que hacer cuando no estamos seguros, como pedir la información epidemiológica o consultar con un médico, por ese tipo de cosas es que los microbiólogos nos diferenciamos de otras profesiones como técnicos, biólogos, biotecnólogos, que también son buenos y saben mucho, pero ese conocimiento es especializado de manera muy distinta de lo que hacemos nosotros. Nosotros mas bien, agarramos la información epidemiológica, montamos el ensayo y logramos integrar todo. Segunda pregunta de Alejandra ® Si llega un paciente incierto con síntomas y le montan un PCR ¿lo más lógico es que en el CT no haya elevación? O sea, no va a pasar porque no hay carga viral, por mínima que sea no va a pasar entonces, ¿reportan el antígeno COVID negativo cuando dan los resultado? Una cosa es el antígeno donde se hace ELISA y otra cosa es el PCR. Si un paciente llega con síntomas la probabilidad de encontrar virus es muy alta, es decir, la probabilidad de encontrar carga viral es casi 100%. Ahora, si un paciente llega sin síntomas y tiene una carga viral muy bajita probablemente va a dar Dalit Schutz Lerner 12  negativo y se reporta negativo porque no se amplifico nada y es porque la prueba no tiene un límite de detección tan baja para detectarlo. o ¿cuál es el problema de las prueba de antígeno? Tienen una sensibilidad igual a la del PCR, entonces cuando se corre el ELISA este detecta el antígeno por una inmunocromatografía, si es paciente con una carga viral baja, talvez no se vaya a detectar porque la sensibilidad no es tan alta, entonces por antígeno esta negativo. Pero si le hace PCR a ese mismo paciente, la sensibilidad del PCR es más alta, entonces aunque tenga carga viral baja, talvez el PCR si lo detecta sensibilidad y amplificar la curva, por lo que por PCR si esta positiva. Comparación de pasos ® En ambas técnicas hay que tomar muestra y extraer el ADN. ® En ambas se hace una amplificación en un termociclador, lo que pasa es que en punto final/PCR convencional el termociclador va ser simple en el cual yo obtengo un producto amplificado y después tengo que revelarlo en un sistema de agarosa, en una máquina de electroforesis capilar. Mientras que, en el PCR tiempo real, el equipo va cuantificando cada ciclo la cantidad de fluorescencia que va incorporando cuando se va amplificando la cadena naciente y el numeor de amplicones va creciendo. ® Los oligonucleótidos de un PCR tiene real tienen que venir marcados con fluoróforos, cada vez que se agrega un oligonucleótido, se agrega un fluoróforo. ® Después del primer ciclo va haber una cantidad de fluoróforos y esa cantidad se duplica en el siguiente ciclo y así sucesivamente va ir Dalit Schutz Lerner 13  aumentando exponencialmente. Y si se grafica, se obtiene una curva exponencial sigmoidal. ® En esa curva exponencial sigmoidal, al principio se tiene una fluorescencia muy basal y luego llega un momento que se empieza amplificar, sube exponencialmente y termina en una meseta. ® Acordarse de que hay un valor de threshold (umbral)que se fija en el eje “y”, entonces ese valor se puede subir o bajar y ese valor va a marcar el punto donde empieza a crecer exponencialmente. Si se traza una línea en ese punto y se tira al eje “x” se llega a un número de ciclo y ese número de ciclo es el CT de esa muestra ® Si uno sube el umbral, el CT cambia de lugar y por ende el numero de ciclos cambia. Es por esto que el umbral se pone justo donde empieza la amplificación exponencial porque ahí es donde se disparó. PCR punto final PCR tiempo real ® No tiene un sistema de revelado ® Sí hay un sistema de revelado de la ® Hay que revelarlo posteriormente en un reacción por medio de la cuantificación gel de agarosa o en una electroforesis la fluorescencia. capilar ® No tiene fluoróforos ® Los fluoróforos se van a ir incorporando se van a ir incorporando conforme se va sintetizando la cadena cada ciclo, entonces se va ir amplificando de manera exponencial. ® Hay que tomar la muestra ® Se tiene que extraer el ADN ® Se usa un termociclador Tarea ® Desarrollar un modelo diagnóstico de SARS-CoV-2 por medio de PCR ® Utilizar una metodología de PCR ya sea punto final o en tiempo real ® OJOà hay que estudiar el virus y saber que proteína queremos amplificar En el examen viene un ejemplo así, entonces: ® Estudiar cual proteína queremos determinar para irse al gen de esa proteína. ® Hay que irse al gen que queremos determinar, ® Hay que ver las secuencias de los primers que tenemos que diseñar, ® ver si usar PCR tiempo real (20 mil dólares) o PCR punto final (50 mil dólares) ® Averiguar detalles Dalit Schutz Lerner 14 Probablemente sea: si usted elige un PCR tiempo real ¿como tienen que ser los primers? a) Con fluoróforosà ya sabemos que son los oligonucleótidos y no los primers b) Sin fluoróforos c) Con una enzima d) Con un conjugado Ag-AC Pregunta de Jose ® En la parte de las curvas, un paciente tenga una carga viral baja que sea indetectable, en ese caso cuando es indetectable ¿al mismo tiempo se puede decir intrasmisible? Eso pasa. Hay laboratorios grandes de USA, Europa que dicen que después de un CT de 35 lo reportan negativo aunque de positivo de 36 y 37 porque se han hecho estudios con cultivo viral de que no es transmisible, a partir de CT muy altos no es transmisible. ® La respuesta es SI, a partir de cierto CT NO hay transmisibilidad. ® En algunos lugar ya han hecho estudios con cargar virales diferentes, CT diferentes en el cual se logran hacer modelos animales y de esa forma logra infectar ratones o algún otro animal y logra estudiar ese comportamiento. Dalit Schutz Lerner 15