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Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento PCR – Reazione a catena della polimerasi  Maria Luisa Savo Sardaro Polimerase Chain Reaction (PCR) Reazione a catena della polimerasi P...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento PCR – Reazione a catena della polimerasi  Maria Luisa Savo Sardaro Polimerase Chain Reaction (PCR) Reazione a catena della polimerasi PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica atta ad amplificare in provetta frammenti di DNA di cui siano note le due estremità. Inventata da Kerry Mullis nel 1983 (premio Nobel nel 1993), fu resa efficiente nel 1988 grazie all’uso dell’enzima Taq DNA polymerase del batterio Thermus aquaticus, resistente ad alte temperature. Questa tecnica è diventata indispensabile per le tante applicazioni in tutti i possibili ambiti di applicazione della biologia molecolare. PCR - Reazione a catena della polimerasi 2 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Con la PCR è possibile amplificare ed isolare uno specifico segmento di DNA (amplicone) dal genoma di specie viventi o da un DNA artificiale o clonato. Le dimensioni dell’amplicone possono variare da poche decine di paia di basi fino ad un massimo di 15-20 mila paia di basi con polimerasi ad alta efficienza (un cromosoma ha una lunghezza di milioni di paia di basi). L’amplificazione avviene grazie a cicli successivi di sintesi del segmento di DNA, delimitato da due primers o inneschi sintetici (frammenti a singola elica di DNA lunghi ~15-25 basi) complementari alle sue estremità. PCR - Reazione a catena della polimerasi 3 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro La polimerasi Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognuna di esse, ma sempre 5’ 3’ Ricordare: Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’ 3’ a partire da un innesco 3’ libero su untemplato. La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrera’sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 4 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI E’ il mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso. Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE PCR Primer a RNA 5’ 3’ Nuovo filamento 5’ 3’ DNA stampo DNA polimerasi Primer DNA polimerasi oligonucleotidico termostabile Nuovo filamento DNA stampo 5’ 3’ 3’ 5’ Primers a RNA Nuovo filamento 3’ 5’ 3’ 5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 5 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Come funziona la PCR? La sintesi con la polimerasi avviene sulla singola elica tramite un innesco (“primer”) appaiato per complementarietà alla elica che funziona da templato I vari passaggi per sintetizzare in vitro il DNA: 1 passaggio: denaturazione della doppia elica di DNA 2 passaggio: appaiamento dei “primers” sul templato ssDNA 3 passaggio: sintesi ed estenzione della nuova elica a partire dal primer ad opera della Taq-polimerase il ciclo è terminato e ricomincia PCR - Reazione a catena della polimerasi 6 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Thermal cycler, Applied Biosystems PCR - Reazione a catena della polimerasi 7 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Le FASI della PCR Ž Œ Œ DENATURAZIONE: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in Allungamento Denaturazione (~ 95°C) provetta a ~ 92-95°C (~ 72°C)  ANNEALING: La miscela viene raffreddata fino a raggiungere la temperatura Annealing che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni (~ 60°C) dello stampo ad essi complementari Ž ALLUNGAMENTO: La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo alla DNA polimerasi  termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico PCR - Reazione a catena della polimerasi 8 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: – denaturazione (94-95° C), 10-40 sec – annealing (50–65°C), 30-120 sec – polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento PCR - Reazione a catena della polimerasi 9 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro COMPONENTI di una REAZIONE di PCR Mg2 Stampo DNA a doppio filamento + Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che Primers fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Tampone contenente Lo ione Mg2+ è essenziale per il cloruro di magnesio funzionamento dell’enzima Enzima Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus PCR - Reazione a catena della polimerasi 10 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PROGETTAZIONE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer: ü Lunghezza: 16 bp o più à Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano. ü Tm primer 1 ~ Tm primer 2 La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza delprimers Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C ü T annealing ~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usati Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. ü Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers PCR - Reazione a catena della polimerasi 11 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro...PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS 5’ CTTTTGGCATAGACCACATGCCA 5’ TGTTACAAGTGTGGATGGATGCC Tm = 58.6 Tm = 56.1 GGCCAGTGAATTCAGCTCACGCCCCAAATATGCAGCTTCCAGTCCAGTTTCATCCGGCG CGCTGAAGATTTTTTAGAGCATGCTCTATTATGCAGCGTCCGTTGGAATGCTCTTTTTAAC é TCCGCGCGCGCTAAACTTGCGATTTTTTGGGCGCGGCGCTGATATTGGGCGTCTGTTGA AGATGCTCTTAAGTGGCCACAAGGGAGATGGGTCGGGCTAAGGTTTCATATCTTACAATA TAAAGTTGAAGACGATTTGTGGCACCCAGGGGCGGGAGACGCATGCATGCAGCTGCATG ATTGCACCAAGATCCGAAGAGTGGTTTATGGTTTGAGCTTAATTACTGCATGCATGCAAC TTTTTGGTACAACTTTTGGCATAGACCACATGCCATCCCACCTCCCATGCTTTTCATTTTT ACTTGTAAATTTGGATCTATTATATCTTTTGAATCAAAAGTTCAATTTATATTTCGTTTGCGT ATTCTTGTCCCTTGTGTCGAGAGCTTTGAAACAAGCCCACTTTTGAATACGTTTTGACAAA TTCTAAAAACTTAAGTGAGTTTCAACTGCTAAAACTTGATAGAATGAATGAAAAATTTAGC AAGTTTCAAAGACTAAAACTGAAACCCTAAGCCCTTAGCCCTAGATCCTAAGCCCTAAGC CGGAAGTCCTAAACCGTATGCCCCTAACA è : Tm = 83.6 ? Clear Open file Calculate Minimum stem size: 4 Minimum 3’overlap: 2 Optimal annealing temperature is 56.7. 3’ end of oligo 1 pairs to positions 5 to 10 of itself. PCR - Reazione a catena della polimerasi 12 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) 5’ 3’ ATTCGACCT ------------ GCTACTGG 3’ 5’ Primers o innesco 5’ 3’ CGATGACC ATTCGACCT 3’ TAAGCTGGA----------- CGATGACC5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 13 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS for rev 3314 re v 842 425 Primer FOR 5’- GGACACGTATGCCACAGCCC -3’ Primability of Match = 100% Stability of Match = 82% TGCTAAATTTTCCAGCTAGGTAGCAGGACACGTATGCCACAGCCCTTAAAAGCATATCTGCACATGTCTT 1442 1461 Primer REV 2264 2281 Primability of Match = 100% Stability of Match = 81% CATGCATGATGCTCAAATGCCGCATTGTTGCGCTGTACGCACACATGTATGAATGCATGGCACGGATCAA 3’-GTTGCGCTGTACGCACAC -5’ Primer REV Primability of Match = 71% 5’-GTGTGCGTACAGCGCAAC -3’ Stability of Match = 44% GGGTGGGACCTGGGCGCCCCCGCCGTGAGCGCCTACTGCTCCACCTGGGACGCCGGCAAGCCGTACTCG 1859 1876 PCR - Reazione a catena della polimerasi 14 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 1° ciclo di PCR DNA genomico 5’ 3’ 3’ 5’ Primer reverse Primer forward 5’ 3’ 3’ 5’ DNA genomico PCR - Reazione a catena della polimerasi 15 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 2° ciclo di PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3° ciclo di PCR PCR - Reazione a catena della polimerasi 16 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 5’ regione di interesse 3’ PCR i filamenti vengono separati I°step 3’ 5’ ed i primers si appaiano i filamenti vengono separati complementarietà ed i primers si appaiano III°step al primer 1 5’ 3’ primer 1 5’ 3’ primer 2 3’ 5’ i primers si estendono 3’ 5’ 5’ 3’ complementarietà complementarietà al primer 2 i primers si estendono complementarietà al primer 1 al primer 2 5’ 5’ 3’ 3’ II°step i filamenti vengono separati 3’ 5’ ed i primers si appaiano 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Frammenti desiderati i primers si estendono (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati) 3’ 5’ filamenti di lunghezza omogenea filamenti di E così via lunghezza variabile 5’ 3’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 17 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro I primi 4 cicli della PCR in dettaglio Frammento desiderato 3° ciclo 4° ciclo 2° ciclo Amplificazione esponenziale 1° ciclo 35° ciclo DNA stampo Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato 21 =2 22 =4 23 =8 24 =16 235 Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato 0 0 2 8 PCR - Reazione a catena della polimerasi 18 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) [DNA] Log N° cicli Resa teorica: 2n P =(2)n T Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza PCR - Reazione a catena della polimerasi 19 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Schema della PCR Estrazione DNA cDNA Reverse del DNA transcription RNA o RNA dal Amplificazione campione DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi Rivelazione 20 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 25 o 50 l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50 µl in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5 µl 1X 10 X dNTPs (2mM) 5 µl 200 µM Forward primer (5 pmols/µl) 5 µl 0.5 µM Reverse primer (5 pmols/µl) 5 µl 0.5 µM (25pmols/50µl) DNA genomico stampo 2 µl 1 µg 0.2 µl 1 unità Polimerasi termostabile (5U/µl) H2O (a 50 µl di volume finale) 27.8 µl PCR - Reazione a catena della polimerasi 21 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + PCR - Reazione a catena della polimerasi 22 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C PCR - Reazione a catena della polimerasi 23 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. PCR - Reazione a catena della polimerasi 24 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C PCR - Reazione a catena della polimerasi 25 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 26 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 27 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 28 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 29 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 30 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 31 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli PCR - Reazione a catena della polimerasi 32 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio PCR - Reazione a catena della polimerasi 33 di 33 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR  Maria Luisa Savo Sardaro Elettroforesi di DNA su gel di agarosio Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 2 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Principio: Consentedi separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campoelettrico Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo (anodo) (CATODO) (ANODO) Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 3 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Da cosa dipende la velocità di migrazione ❑DIMENSIONE DEL DNA ❑CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL ❑CONFORMAZIONE DEL DNA ❑VOLTAGGIO APPLICATO circa 5 Volt/cm (distanzaanodo- catodo) ❑PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO ❑COMPOSIZIONE (FORZA IONICA) DEL BUFFER Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 4 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ DIMENSIONEDELDNA K relazione di proporzionalità diretta tra pb e PM: V= - molecole grandi migrano lentamente Log10 bp - molecole piccole migrano velocemente (K varia al variare della concentrazione di agarosio nel gel) Direzione migrazione Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 5 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ CONCENTRAZIONE DI AGAROSIONELGEL D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattoso L’agarosio è un polimero lineare che forma una matrice semisolida avente pori di dimensione diversa in funzionedella concentrazione utilizzata Lasuaconcentrazione determina il potere risolutivo delgel Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 6 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ CONFORMAZIONE DEL DNA DNA superavvolto, lineare e circolare hanno velocità di migrazione diversa anche se di dimensione uguale: - La forma SUPERAVVOLTAcorre più Superavvolto tà Veloci veloce perché è più compatta; - La forma CIRCOLAREcorre più lenta perché è la più “ingombrante” e fa più fatica a muoversi all’interno dei pori del gel; Lineare - La forma LINEARE si colloca a metà (la forma lineare è, ad esempio, quella che si ritrova come prodotto nellaPCR). Circolare Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 7 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del gel diagarosio Pesare la quantità desiderata di Bollire, aggiungere etidio agarosio e bromuro o Sybr green e scioglierla in un versare nell’apposito volume adatto di apparato per la corsa tampone elettroforetica Caricare la reazione alla quale Avvenuta la sia stato aggiunto un colorante, corsa, illuminare il in uno dei pozzetti del gel gel con raggi UV d’agarosio o e far avvenire la per rendere corsa elettroforetica fornendo visibile il DNA energia elettrica. Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 8 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro ❑ PRESENZADI BROMURO DI ETIDIO Colorante fluorescente (intercalante) che consente di visualizzare il DNA Assorbimento a 254 nm (U.V.) ed emissione nel visibile (590 nm) Riduce la velocità di migrazione di circa il 15% Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 9 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del gel diagarosio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 10 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Caricamento del gel I campioni di DNA vengono miscelati ad un colorante (orange) con funzione di addensante ed indicatore del fronte elettroforetico Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 11 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Caricamento del gel Marcatore di dimensioni: È costituito da frammenti di DNA aventi dimensioni note e consente di determinare la dimensione del DNA campione Viene fatto migrare insieme ai campioni di DNA come riferimento dimensionale Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 12 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Il risultato Risultato della PCR dellaPCR 612bp 692bp 612 501bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 c Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 13 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time Analisi PCR quantitativa PCR Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 14 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time Analisi PCR quantitativa PCR impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo reale la quantità dello specifico prodotto di PCR Termociclatore con detector per fluorocromi e software per analisi dati Linea di base (baseline): valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato Linea soglia (Threshold): scelta dall’operatore in modo da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Ciclo soglia: E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 15 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Li ne a s o g l i a s c e l ta da l l ’o pe rato re In maniera da intersecare le curve di tutti i c a m p i o n i n e l l a fa s e e s p o n e n z i a l e Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 16 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 17 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Real time PCR Sistemi di rilevamento 1. Coloranti che si intercalano nella doppia elica SYBR Green La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente Tm Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 18 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Durante l’allungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 19 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro SYBR Green metodica semplice, non costosa, aspecifica Analisi della curva di melting 82.6 88.1 Tm melting peak Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 20 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro 2. Sonde specifiche marcate con molecole fluorescenti Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCR R Q 3’ 5’ Primer 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 5’ 3’ R REPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza Q fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter 3’ 5’ 3’ 5’ Si libera 1 molecola di reporter per ogni copia di DNA duplicata 3’ 5’ 5’ Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 21 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Probe Forward primer Reverse primer Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 22 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto vNecessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) vPer tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT vNecessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) vGli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro DCT con quello del controllo endogeno Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 23 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALL’INTERNO DI UNA MATRICE 1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica in grado di amplificare una regione specifica del genoma del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra 100-700 bp Ø verifica in PCR (specificità e curva di melting) 2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto da cui estrarre e dosare il DNA totale Ø 108 cellule 125 ng Ø 10 cellule 6 10 ng Ø 10 cellule 4 0.9 pg 3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il range di linearità e la corrispondenza tra: CT : quantità di DNA : quantità di cellule Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 24 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA MATRICE IN ESAME q Estraggo il DNA totale dalla matrice ed eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i dati ottenuti in fase di messa a punto del metodo: v primers specifici v curva di calibrazione Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 25 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantitativa relativa Plot di amplificazione Control Sample Numero di cicli DCT Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 26 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Studio dell’espressione genica 1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse 2. Estrazione dell’RNA e Real-time PCR per valutare se il gene viene trascritto L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 27 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro =REVERSE TRANSCRIPTASE PCR La RT-PCR amplifica un RNA convertendolo prima in DNA (o DNA omplementare all’RNA) tramite l’enzima trascrittasi inversa, e poi amplificandolo tramite PCR con primers specifici per la sequenza di interesse. Estrarre l’RNA totale dal campione biologico che si vuole esaminare Trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l’mRNA trascritto dal gene di interesse) in cDNA tramite la reazione di trascrizione inversa Evidenziare il cDNA di interesse tramite la reazione di PCR Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 28 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Quantitativa relativa: analisi dei dati Ø Normalizzare il gene target con un controllo endogeno (ref) espresso costitutivamente (DCT) in una condizione di controllo Ø Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed eseguire l’analisi. Il controllo endogeno non dovrebbe variare. La variazione di espressione del gene in studio va valutata in riferimento all’espressione dello stesso gene nelle condizioni di controllo Ø Comparare ciascun DCT così ottenuto con il DCT del controllo ratio = ( Etarget)ΔCt target (control-treated) (Eref)ΔCt ref (control-treated) E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 29 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 30 di 31  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Rilevazione DNA con gel di agarosio e Real time PCR 31 di 31 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Prodotti vegetali fermentati  Maria Luisa Savo Sardaro Principali specie, nei principaliprodotti Prodotti vegetali fermentati 2 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Prodotto Principali ingredienti Specie microbiche Paese Crauti Cavolo, sale Leuconostoc Internazionale Esempi di prodotti mesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum vegetali fermentati Cetrioli Cetrioli, aceto o sale, Pediococcus pentosaceus, Stati Uniti,Filippine distribuiti a livello Capperi, acqua di L. plantarum Paesi dell’area Capperi L. plantarum, mondiale fonte, sale Lactobacillus pentosus, Lactobacillus fermentum, Mediterranea (Grecia, Italia, Spagna, L. brevis, Lactobacillus Turchia, Marocco) paraplantarum, Enterococcus faecium, P. pentosaceus Leuc. mesenteroides, Cavolo cinese, Kimchii Leuc. Corea ravanelli, sale, spezie pseudomesenteroides, L. (zenzero, peperone plantarum, L. brevis, piccante, aglio, Lactobacillus curvatus, cipolla) Lactobacillus sakei Dhamuoi Cavolo e altri vegetali Leuc. mesenteroides, L. plantarum Burong mustala Senape L. brevis, Pediococcus sp. Filippine Prodotti vegetali fermentati 3 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Principali caratteristiche delle olive damensa Prodotti vegetali fermentati 4 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Attitudine alla trasformazione e indici qualitativi applicabili alle olive damensa Prodotti vegetali fermentati 5 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Amaro delle olive L’integrità del legame estere che permette l’attacco dell’idrossitirosolo al resto della molecola di oleuropeina è essenziale per il sapore amaro del glucoside; Prodotti vegetali fermentati 6 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Chimismo della deamarizzazione dei frutti Tutte quelle reazioni che portano alla modificazione dell’idrossitirosolo mediante – ossidazione, – separazione per l’idrolisi porta alla scomparsadel sapore amaro. Il chimismo della deamarizzazione avvieneper: – idrolisi alcalina o acida della oleuropeina, – ossidazione chimica – idrolisi enzimatica. Prodotti vegetali fermentati 7 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Idrolisi alcalina o acida dell’oleuropeina Prodotti vegetali fermentati 8 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Ossidazione chimica dell’oleuropeina Prodotti vegetali fermentati 9 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Idrolisi enzimatica dell’oleuropeina Prodotti vegetali fermentati 10 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro ESISTONO DIVERSI METODI PER DEAMARIZZARE Metodo CHIMICO o SPAGNOLO o SIVIGLIANO – Attraverso soluzioni alcaline – Poi idrolisi enzimatica Metodo BIOLOGICO o NATURALE – Attraverso l’idrolisi enzimatica Metodo GRECO – Attraverso l’idrolisi enzimatica Prodotti vegetali fermentati 11 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Prodotti vegetali fermentati 12 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODOSPAGNOLO o SIVIGLIANO Prodotti vegetali fermentati 13 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODO SPAGNOLOo SIVIGLIANO Preparazione alla fermentazione Prodotti vegetali fermentati 14 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro fermentazione Prodotti vegetali fermentati 15 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODO SPAGNOLOo SIVIGLIANO fermentazione Prodotti vegetali fermentati 16 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODONATURALEoBIOLOGICO Risultati apprezzabili sono stati ottenuti in diverse realtà operative dove vengono impiegati come starter dei ceppi selezionati di Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus oppure alcune specie di lieviti a seconda della varietà di oliva da trasformare Prodotti vegetali fermentati 17 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODO GRECO Il sistema di trasformazione delle olive nere in salamoia secondo il metodo Greco è simile alla trasformazione al naturale delle olive verdi o invaiate, con l'unica differenzache in questo caso la concentrazione di sale nelle salamoie varia intorno al 9-10% e normalmente non è previsto l'uso dello starter costituito da batteri lattici Le olive vengono collocate in recipienti di varia grandezza e arricchite con salamoia provvista del 9--10 %di sale echiuse ermeticamente. Prodotti vegetali fermentati 18 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro METODO GRECO I lieviti che costituiscono la popolazione microbica predominante per questo habitat sono appartenenti aigeneri – Trichosporon, – Candida, – Pichia, – Kloechera, – Torulopsis, – Debariomyces – Saccharomyces. Molte specie di lieviti isolati dalle salamoie delle olive trasformate con il sistema Greco in vitro, producono sia laß- glucosidasi che l’esterasi. Prodotti vegetali fermentati 19 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Difetti e alterazioni delle olive Prodotti vegetali fermentati 20 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro I CRAUTI Prodotti vegetali fermentati 21 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Processo produttivo Prodotti vegetali fermentati 22 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro fermentazione Prodotti vegetali fermentati 23 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Prodotti vegetali fermentati 24 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Difetti e alterazioni Prodotti vegetali fermentati 25 di 26  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Prodotti vegetali fermentati 26 di 26 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Il vino  Maria Luisa Savo Sardaro Il Vino Il vino 2 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro La vite…origini molto antiche Probabile comparsa della famiglia delle Vitacee circa 10 milioni di anni fa – Molte specie poi estinte per le glaciazioni – Sopravvissute circa 60 specie tra America del Nord e Asia – In particolare: Vitis vinifera tra caucaso, Mar Caspio e Mar Nero (nonostante si chiami “vite Europea”) Esisteva prima dell’uomo – L’uso del frutto risale all’era neolitica, quando l’uva veniva pigiata insieme a bacche di rovo, lampone e sambuco in fosse scavate nella terra e rivestite di argilla – Numerosi affreschi in tombe egizie raffigurano pratiche di vinificazione – Origini viticoltura datate attorno 9000 a.C in Mesopotamia – Dal III millennio a.C diffusione del consumo di vino e della coltivazione della vite nel bacino mediterraneo tra Grecia e Italia (Enotria Tellus - Terra del vino) – La viticoltura fiorì in epoca Romana – Nel medioevo sopravvisse solo grazie ai monasteri – Poi sviluppo in tutta Europa e successivamente in America – Avvento delle “esposizioni Universali (1862) e diffusione malattie (oidio) Il vino 3 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Il vino è un alimento fermentato “Il vino è un prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione totale o parziale di uve fresche, pigiate e non, o di mosti d’uva” Materia prima Prodotto modificazioni biochimiche e reologiche associate all’attività metabolica dei microrganismi selezionate dalla tecnologia Il vino 4 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Materia prima: L’uva Morfologicamente è una bacca e si possono distinguere le diverse porzioni Buccia o pericarpo (15-20%) Polpa o mesocarpo (75-85%) Semi o vinaccioli (3-6%) Il vino 5 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Composizione del raspo Povero di zuccheri, ricco di acidi, soprattutto salificati, molto ricco di ceneri. Il pH è superiore a 4 a causa dell’alto contenuto in sali: – vinificazione in presenza di raspi: aumento del pH con un abbassamento dell’acidità dei mosti. Il raspo è molto ricco di sostanze fenoliche – acidi organici 2-3% – Ceneri 5-6% – Polifenoli (tannini) 2-4% Il vino 6 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Composizione dei vinaccioli Rappresentano dallo 0 al 6% del peso degli acini – Acqua 25-45% – Zuccheri 35% – Sost. Azotate 6% – Sost. Minerali 4% – Polifenoli 4-6% (dal 20 al 55% dell’acino) Il vino 7 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Rappresenta dall’8 ad oltre il 20% del peso dell’acino Composizione della buccia Non contiene zuccheri (solo tracce) Contiene polifenoli Contiene acidi organici (generalmente salificati, il pH è più alto) – soprattutto acido citrico – Malico diminuisce con la maturazione – Tartarico esterificato Rivestita da pruina cerosa (pectine e cellulosa) Prodotti secondari con ruolo enologico importante – Sostanze odorose Terpeniche (linfanolo, neroli, geraniolo nelle uve mature) – Sostanze fenoliche Vasta gamma, uve rosse antociani Rilevanti x colore e astringenza del vino Sensibili all’ossidazione determinano la stabilità o l’instabilità del vino – Sostanze azotate Forma ammoniacale, aminoacidica, peptidica Il vino 8 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro La polpa rappresenta in peso la parte più importante dell’acino (75-85%) Composizione della Zuccheri: – glucosio e fruttosio (rapporto 0.92). Il saccarosio solo in tracce. polpa Il contenuto globale è di circa 150-240 g/l. tale valore è più elevato per i vitigni particolari, ad es. moscato, o per uve affette da marciume. – Altri zuccheri: arabinosio, ramnosio, maltosio, raffinosio… Acidi organici: l’acidità dell’uva è costituita prevalentemente da tre acidi. Nei climi freddi prevalenza di acido malico, nei climi caldi prevale l’acido tartarico (pH da 2,8 a 3,5) – Acido tartarico (da 3 a 15 g/l) – Acido malico ( da 0.8 a 8 g/l) – Acido citrico (da 0.1 a 0.3 g/l) Sostanze minerali: Il potassio costituisce il 50% delle ceneri, quindi seguono il calcio e il magnesio. Da notare che nel vino finito si osserva una prevalenza del magnesio sul calcio a seguito delle precipitazione del tartrato di calcio insolubile. Non sono presenti tannini e quindi i vini bianchi non sono tannici Sostanze azotate: la polpa contiene soltanto il 20 - 25% dell’azoto totale dell’acino Il vino 9 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Densità elevata (da 1,065 a 1,100) La composizione chimica e le proprietà fisiche del mosto variano Il mosto – varietà dell’uva, – influenza climatica, d’uva – pratiche di viticoltura, – maturazione – raccolta. Le proprietà più importanti comprendono – concentrazione zuccherina, – la quantità di sostanze azotate (dal 40 a 220 mM/l) di azoto ammoniacale, AA (da 2 a 8 g/l) (principalmente: prolina, arginina, treonina e ac. Glutammico) – concentrazione di vitamine, – contenuto di ossigeno dissolto, – quantità di solidi solubili (debole tenore in pectine), residui di fungicidi e pesticidi, – pH, – presenza di sostanze inibitrici o stimolanti prodotte sia da parte dei lieviti che dei batteri lattici Il vino 10 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Composizione generica del mosto H2O= tra 70 e 85% Zuccheri = tra 12 e 27% Acidi totali = circa 0.2% Azoto = 0.01 – 0,2% Il vino 11 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro glucosio e il fruttosio presenti in quantità non uguali, spesso prevale il fruttosio. Zuccheri del – Entrambi sono fermentati da tutti i lieviti e dai batteri lattici. mosto I pentosi La loro concentrazione è di circa 1-2 g/l: forme levo dell'arabinosio, dello xilosio e quella destro del ribosio – non sono fermentati dai lieviti ma lo sono dai batteri che seguono la fermentazione malolattica. Il saccarosio (glu-fru) non fa parte dei componenti del mosto, esso tuttavia, in alcuni casi, può essere aggiunto. La concentrazione di esosi fermentescibili tra 150 e 300 mg/ml Il vino 12 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro l’acido tartarico – Nel mosto d’uva matura da 3,8 a 11,3 g/l Acidi organici – Meno nel mosto d’uva all’invaiatura – Può essere prodotto in piccole quantità dal metabolismo dei lieviti (da acido ascorbico) – di norma non è utilizzato dai lieviti e dai batteri e perciò permane nel vino – instabile dal punto di vista chimico-fisico, precipita sotto forma di tartrato l’acido malico: – è instabile dal punto di vista microbiologico perché subisce la fermentazione malo-alcolica dai lieviti e malo-lattica dai batteri lattici – Più elevato all’invaiatura (2-3 mg/l), diminuisce con la maturazione (ruolo di trasportatore di energia x la pianta) l’acido citrico è stabile chimicamente, non è fermentato dai lieviti ma può essere utilizzato dai LAB. La presenza di questi acidi conferisce al mosto un pH molto basso, quasi sempre compreso tra 2.7 e 3.6. Il vino 13 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Acidità del vino Responsabili dell'acidità di un vino sono: gli acidi naturali contenuti nell'uva gli acidi di origine fermentativa Il vino 14 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Dipende dallo stato di maturazione della pianta sali d’ammonio (3-10% dell’azoto totale) Composti azotati aminoacidi (20-30%) polipeptidi (25-40%) proteine (chitine..) (5-10%) – Le proteine non sono utilizzate ne da lieviti ne da batteri, – i peptidi e gli aminoacidi sono utilizzati sia da lieviti che dai LAB, – i composti ammoniacali sono utilizzati solo da lieviti. Le principali fonti di azoto utilizzate dai lieviti durante la fermentazione sono aminoacidi liberi e ioni ammonio ma in alcuni succhi essi non sono presenti in concentrazioni sufficienti a consentire il massimo sviluppo. Poiché la mancanza di azoto è una delle cause più frequenti di arresto della fermentazione alcolica, in molti casi i composti ammoniacali vengono aggiunti ai mosti come integratori. L’utilizzo di fertilizzanti, nelle vigne, a base di azoto può cambiarne il contenuto nell’uva e condizionare lo sviluppo cellulare dei lieviti. Il vino 15 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Altri composti POSITIVI. composti necessari per lo sviluppo microbico: presenti in eccesso sia vitamine quali la biotina, acido pantotenico, tiamina, piridossina etc., necessarie ai lieviti ma soprattutto ai LAB che sono molto esigenti nutrizionalmente. In quantità sempre sufficienti sono presenti anche fosforo, zolfo, potassio, magnesio, calcio, etc. Sostanze aromatiche Centinaia di sostanze chimiche determinano l’aroma varietale delle diverse uve in equilibrio tra – Sostanze aromatiche libere e volatili – Precursori non volatili e non aromatici – Sostanze aromatiche volatili instabili Importanti i composti terpenici e i carotenoidi Regolate da – condizioni ambientali (terroir) che incidono sulla maturazione – condizioni meteorologiche (luce, calore e umidità) che incidono sull’annata Il vino 16 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro I microrganismi in vinificazione I lieviti – (positivi o negativi f(x) specie) I batteri lattici – (positivi o negativi f(x ) specie e tecnologia) I batteri acetici – (negativi) Le muffe – (negative tranne eccezioni) Il vino 17 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Diverso trattamento materia prima - Fermentazioni spontanee -(nessuno o blando trattamento materia prima) - Fermentazioni guidate -(possibile trattamento materia prima e utilizzo innesto) Il vino 18 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Tipologie di starter Naturali: più simili alla pratica più antica che si base sul reinoculo: Una parte di prodotto ben riuscito viene utilizzato come inoculo per un nuovo batch di materia prima. Non è nota né controllabile la microflora del materiale utilizzato nel reinoculo Selezionati: a partire dal 1890 circa: uso di colture miste e colture pure selezionate, dal 1960 a oggi: importanza sempre maggiore dell’uso di colture a composizione definita Il vino 19 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Il mosto d’uva è un substrato estremamente selettivo. Tale selettività è da attribuirsi a due fattori principali: Un fattore intrinseco dovuto alla forte acidità e ai bassi valori di pH Un fattore estrinseco dovuto alle condizioni di anossia in cui si viene a trovare e che la tecnologia favorisce. In queste condizioni I batteri sono inibiti, fanno eccezione alcuni batteri lattici, temporaneamente bloccati Tutte le muffe ed i lieviti con solo metabolismo aerobico (non fermentanti) sono bloccati per mancanza d’ossigeno. I lieviti dotati di attività fermentativa (i fermenti alcolici) sono quelli che si sviluppano e prendono il sopravvento Il vino 20 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Il metabolismo dei lieviti Le vie di degradazione degli zuccheri: – La respirazione – La fermentazione alcolica – La regolazione delle vie metaboliche degli zuccheri Il metabolismo dei costituenti azotati Il vino 21 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Il vino 22 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Metabolismo degli zuccheri In presenza di ossigeno C6H12O6 + 6O2 ® 6H2O + 6 CO2 – 688 kcal/mole. In condizioni di anossia invece il lievito si moltiplica pochissimo tanto che occorrono 176 grammi di zucchero per produrre 1 grammo di cellule di lievito (secco). L’energia potenziale dello zucchero è sfruttata solo parzialmente per via fermentativa C6H12O6 ® (fermentazione alcolica) 2C2H5OH + 2 CO2 – composto ancora ricco di energia quale l’alcol etilico e svolgimento di 56 kcal/mole Il vino 23 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Fermentazione Fermentazione alcolica: – Potere riduttore di NADH trasferito ad accettore di elettroni (rigenera NAD+): è l’acetaldeide Þ etanolo (ma la via è più complessa) Fermentazione gliceropiruvica – In presenza di solfito l’acetaldeide non può esser ridotta ad etanolo, l’accettore è allora il diidrossiacetone fosfato Þ glicerolo 3 fosfato Þ glicerolo Il vino 24 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Il vino contiene circa 80 g/l di glicerolo (8%) fermentazione – Quindi l’8% di zucchero diventa glicerolo (via gliceropiruvica) gliceropiruvica – Il 92% fermentazione alcolica Le due Fermentazioni sono legate durante tutta la vinificazione La gliceropiruvica più veloce all’inizio Alla produzione di glicerolo associati anche i prodotti secondari (acido α- chetoglutarico, acido succinico, butandiolo, diacetile…ma anche acido acetico, danno per il vino) – Per questo motivo il ruolo del glicerolo dibattuto Aspetto positivo = Sapore dolce, rotondità Aspetto negativo = Possibilità presenza acido acetico Il vino 25 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Fattori stimolanti la fermentazione gliceropiruvica (glicerolo+ac. acetico) Concentrazione iniziale di zuccheri (maggiore è la concentrazione maggiore è la produzione) – Meccanismo di difesa della cellula che produce glicerolo per aumentare l’osmofilia x contrastare la concentrazione esterna A parità di alta concentrazione di zuccheri, la produzione di glicerolo diminuisce all’aumentare della concentrazione di azoto (deve essere almeno 190 mg/l) – Effetto negativo della chiarificazione – Per evitare acido acetico in mosti ricchi di zucchero (vedi marciume nobile) si può contrastare con aggiunta di sali di NH4. Attenzione: aggiunti all’inizio della fermentazione quando la reazione è più veloce A parità di alta concentrazione di zuccheri, la produzione di glicerolo aumenta all’aumentare della temperatura all’inizio della fermentazione (in questa fase stare < 20°C) Il vino 26 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Quali zuccheri vengono degradati Zuccheri degradati per via fermentativa Zuccheri degradati per via respirativa Il vino 27 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro 1. solo i monosaccaridi a 6 atomi di carbonio 2. Tutti i lieviti: glucosio, fruttosio e mannosio. glucosio e fruttosio uguale rapidità, il mannosio più lentamente 3. il galattosio solo da alcuni lieviti e, molto lenta. La capacità di fermentazione del galattosio può essere acquisita 4. i disaccaridi: saccarosio, maltosio, lattosio e melibiosio sono fermentati da quei lieviti che Via fermentativa sintetizzano i corrispondenti enzimi idrolitici (saccarasi e invertasi, maltasi, lattasi o b- galattosidasi, melibiasi). Le specie in grado di fermentare il lattosio sono poche e senza importanza enologica, hanno invece importanza casearia 5. il raffinosio, trisaccaride composto da una molecola di fruttosio e due di melibiosio, può essere fermentato dai lieviti che sintetizzano la raffinasi; in questo caso viene fermentato solo il fruttosio perciò 1/3 del raffinosio oppure la totalità se il lievito possiede anche una melibiasi (3/3) 6. I polisaccaridi in genere non sono fermentati. Fanno eccezione: alcuni ceppi di Sacch. cerevisiae in grado di fermentare le destrine, Schwanniomyces occidentalis in grado di fermentare l’amido e alcune specie del genere Kluyveromyces in grado di fermentare l’inulina. 7. Nessun lievito fermenta i pentosi: quelli presenti nei mosti (xilosio e arabinosio). Il vino 28 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Via respirativa Oltre a quelli utilizzabili per via fermentativa 1. pentosi, 2. l’acido acetico, 3. l’acido lattico, 4. il metanolo, 5. l’etanolo, 6. il diidrossiacetone, 7. l’acido chetoglucarico, 8. l’acido ossalacetico Il vino 29 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Regolazione delle vie metaboliche di utilizzazione degli zuccheri Scoperta di Pasteur: – Quando il lievito potrebbe utilizzare sia la fermentazione che la respirazione, l’aerazione (O2) induce: aumento di quantità di biomassa diminuzione di consumo di zuccheri – La respirazione inibisce la fermentazione Chiamato effetto Pasteur: – Per S. cerevisiae inibizione della fermentazione da parte della respirazione Competizione dei due enzimi che catalizzano sia la respirazione che la fermentazione del piruvato: – piruvato decarbossilasi (fermentazione) – piruvato deidrogenasi (respirazione) Il vino 30 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Regolazione delle vie metaboliche di utilizzazione degli zuccheri Cosa succede quando esiste un eccesso di glucosio? (condizione possibile nel mosto d’uva) – S. cerevisiae metabolizza gli zuccheri solo per via fermentativa anche in presenza di ossigeno Fenomeno scoperto da biochimico inglese Erbert Grace Crabtree (1928) [Biochem. J. (1928) 22 (1289–1298)] (sulle cellule tumorali) e definito Effetto Crabtree o contro-effetto Pasteur – Degenerazione dei mitocontri – Diminuzione di steroli e acidi grassi – Repressione della sintesi degli enzimi mitocondriali del ciclo TCA Si manifesta a partire da concentrazione di 9 g/l di glucosio Il vino 31 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Regolazione delle vie metaboliche di utilizzazione degli zuccheri La repressione catabolica esercitata dal glucosio in vinificazione è molto forte. Nel mosto d’uva qualunque siano le condizioni di aerazione, la concentrazione di glucosio e fruttosio sono tale che, per effetto Crabtree, S. cerevisiae è costretto a fermentare Però! – Tecnologicamente si sa che l’aerazione favorisce la respirazione (all’inizio della fermentazione si deve aerare…) Perché? – Non a causa della respirazione dei lieviti (aumenterebbe biomassa) – Ma per favorire la sintesi di acidi grassi e steroli che aumentano la permeabilità dei glucidi all’interno della cellula Il vino 32 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro La fermentazione malo-lattica Dopo la fermentazione tumultuosa la fermentazione alcolica riprende in modo lento, seguita da quella malo-lattica, fondamentale per la qualità del vino. Il passaggio da acido malico ad acido lattico ingentilisce il vino che perde il sapore di agro, acerbo, duro. La diminuzione dell’acidità è anche dovuta alla precipitazione dell’acido tartarico come cremor tartaro. La fermentazione malo-lattica è poco opportuna nei vini bianchi. Il vino 33 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro batteri lattici appartenenti ai generi Leuconostoc e Lactobacillus. Il vino 34 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Metabolismo delle sostanze azotate Sostanze azotate si trovano localizzate soprattutto nella buccia mentre la polpa dell’acino ne è relativamente povera, quindi le tecnologie di vinificazione che prevedono il contatto prolungato o meno con le vinacce, possono influire significativamente sulla loro concentrazione nel mosto capacità di utilizzare molti composti azotati di differente complessità con l’esclusione degli estremi, cioè azoto elementare e proteine – fosfati mono-, di e tri-ammonici, – Il solfato, il carbonato, il bicarbonato, l’acetato, il lattato e il tartrato ammonico. – singoli aminoacidi – i peptidi, polipeptidi La capacità di svilupparsi con ammoniaca come fonte di azoto indica che i lieviti sono in grado di sintetizzarsi tutti gli aminoacidi, le purine e le pirimidine che sono alla base della costituzione delle proteine e degli acidi nucleici Il vino 35 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Vie generali della biosintesi degli aminoacidi Il vino 36 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro I batteri lattici caratterizzati da capacità di tollerare le condizioni di stress ambientali quali basso pH (< 3) presenza di etanolo (< 12%) SO2 (< 50 µg/ml) bassa temperatura diluizione dei nutrienti L’origine dall’uva e dall’ambiente della cantine o l’inoculo di starter Sono presenti i tutti i mosti d’uva e nei vini Se si sviluppano nel mosto mediante metabolismo fermentativo a carico degli zuccheri Þ causano difetti Se si sviluppano al termine della fermentazione alcolica mediante metabolismo a carico dell’acido malico Þ desiderati o non desiderati in funzione della tipologia di vino Il vino 37 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro FIORETTA (LIEVITI AEROBI) Si manifesta per l'azione di lieviti con la formazione di uno velo biancastro sulla superficie del vino soprattutto se il recipiente viene mantenuto scolmo. Il velo si rompe in tanti piccoli fiorellini e col passare del tempo il vino potrebbe intorbidirsi e divenire piatto se non addirittura acetico. SPUNTO E ACESCENZA (BATTERI ACETICIAEROBI) Lo spunto è la fase iniziale di questa malattia, dovuta ai batteri acetici. Si trasforma in acescenza quando la quantità di acido acetico aumenta notevolmente. Il colore è inalterato, ma l'odore è pungente ed il sapore aspro (acetato di etile e acido acetico). Si evita tenendo le botti ben colme. SPUNTO LATTICO (AGRODOLCE o FERMENTAZIONE MANNITICA) (BATTERI LATTICI ANAEROBI) Si verifica quando si sviluppano batteri lattici mentre è ancora troppo presente il fruttosio. Il fruttosio viene attaccato dai batteri che lo trasformano in acido acetico e lattico. Il sapore è dolce e allo stesso tempo aspro. L'odore ricorda quello di frutta troppo matura. GIRATO (FERMENTAZIONE TARTARICA o SOBBOLLIMENTO) (BATTERI LATTICI ANAEROBI) Si verifica quando i batteri lattici attaccano l'acido tartarico e sviluppano acido lattico e acetico con liberazione di anidride carbonica che determina un po' di effervescenza. L'aspetto è torbido, l'odore pungente ed il sapore è piatto prima e ripugnante poi. AMARORE (BATTERI LATTICI ANAEROBI) Si manifesta quando i batteri lattici attaccano la glicerina e si formano sostanze amare (acroleina) e impartendo un colore giallastro o aranciato. FILANTE (GRASSUME) (BATTERI LATTICI) E' una deviazione della fermentazione malolattica quando batteri lattici e zuccheri residui formano una sostanza vischiosa e filante (destrani). L'aspetto è simile a quello dell'olio mentre il sapore è piuttosto fiacco. Se si agita la bottiglia il fenomeno scompare. Il vino 38 di 39  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Il vino 39 di 39