Replicazione DNA PDF

REPLICAZIONE DNA Il DNA è un acido nucleico ed è un polimero costituito da monomeri che sono i nucleotidi. I nucleotidi consistono di: uno zucchero pentoso (5 atomi di carbonio) una base azotata: PURINE - PIRIMIDINE un grup...

REPLICAZIONE DNA Il DNA è un acido nucleico ed è un polimero costituito da monomeri che sono i nucleotidi. I nucleotidi consistono di: uno zucchero pentoso (5 atomi di carbonio) una base azotata: PURINE - PIRIMIDINE un gruppo fosfato (- H2PO4) Un nucleoside consiste di uno zucchero pentoso e di una base azotata 1 ANELLO 2 ANELLI  OH Gruppo fosfato condensazione GRUPPO FOSFATO LEGATO AL C5’ con legame fosfoestere OH BASE LEGATA AL C1’ con legame β-glicosidico  Legami covalenti Nucleotidi denominati: Zucchero Ribo-adenosin-monofosfato (rAMP) Base azotata Numero gruppi fosfato Legami covalenti Ribo-adenosin-trifosfato (rATP)  Un apporto cruciale nel determinare la struttura del DNA Evidenze venne dalla diffrazione dei raggi X. fisiche della struttura Una sostanza purificata può venire cristallizzata. Quando i raggi X la attraversano, la posizione degli atomi viene dedotta dal profilo di diffrazione. Rosalind Franklin preparò delle cristallografie da campioni di DNA. Le sue immagini suggerirono un’elica a doppio filament e che ogni giro fosse di 3.4 nm. Il diametro di 2 nm suggeriva che lo scheletro zucchero-fosfato di ciascun filamento fosse esterno.  Il biochimico Erwin Chargaff notò che nel DNA (anche di specie diverse) la quantità di purine è uguale alla Evidenze quantità di pirimidine chimiche L’abbondanza relativa di A + T rispetto a G + C varia tra le specie. Nell’uomo: A = T = 30% ; G = C = 20%. Per cui c’è un rapporto di 60 a 40 per A + T e G + C  Il modello Francis Crick (fisico) e James Watson (genetista) elaborarono un modello, con prove fisiche e chimiche, per risolvere la struttura del DNA. Essi pubblicarono i loro risultati nel 1953. Il modello aveva: le basi all’interno e i gruppi fosfato-zucchero all’esterno di ogni filamento I due filamenti di DNA erano orientati secondo direzioni opposte: erano antiparalleli.  Per soddisfare la regola di Chargaff, il modello appaiava una purina in un filamento con una pirimidina nell’altro filamento, ottenendo un’ampiezza uniforme. Quattro caratteristiche chiave della struttura del DNA: E’ un’elica a doppio filamento E’ destrorsa E’ antiparallela I bordi esterni delle basi sono esposti in solchi maggiori e minori.  Le due catene sono tenute insieme da: 1. Legami a idrogeno tra le basi. L’elica Una purina (A o G) con una pirimidina (T o C). Appaiamento complementare delle basi 2. Forze di Van der Waals tra basi adiacenti sullo stesso filamento  La direzione di un filamento è I filamenti determinata dai legami zucchero-fosfato. antiparalleli I gruppi fosfato collegano il carbonio 3′ di uno zucchero col carbonio 5′ di un altro zucchero Gli acidi nucleici crescono in direzione 5’- 3’ Di conseguenza: estremità iniziale In un’estremità della catena c’è un gruppo fosfato (-OPO3-) libero in 5′ : estremità 5’ Nell’altra estremità della catena c’è un gruppo ossidrilico (- OH) libero in 3′ : estremità 3’. estremità finale  estremità iniziale La catena cresce allungandosi sul terminale 3’, quindi in direzione 5’- 3’ estremità finale Nella doppia elica, l’estremità 5’ di un filamento si appaia all’estremità 3’ dell’altro filamento. Gli scheletri dei due filamenti di DNA sono più vicini tra loro in una parte della doppia elica (formando il solco minore) rispetto all’altra parte (rappresentante il solco maggiore). Ci sono quattro possibili configurazioni delle coppie di basi nei solchi della doppia elica I bordi esterni delle coppie di basi sono esposti ed accessibili per ulteriori legami a idrogeno. Le superfici delle coppie di basi A-T e C-G sono chimicamente distinte e possono legare altre molecole.  Il DNA immagazzina informazione genetica: con milioni di nucleotidi, le sequenze di basi immagazzinano un’enorme quantità di informazione. Il DNA è suscettibile alle mutazioni: alterazioni nella sequenza delle basi. Il materaile genetico è replicato con precisione nella divisione cellulare mediante appiamento complementare delle basi. Il materiale genetico (l’informazione codificata nel DNA) è espressa in un fenotipo Tre possibili modelli di replicazione (meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare): Semiconservativa: ogni filamento parentale fa da stampo. Le nuove molecole di DNA avranno un filamento vecchio ed uno nuovo. Conservativa: la molecola originale serve solo da stampo. Dispersiva: frammenti di DNA fanno da stampo; parti vecchie e nuove vengono assemblate casualmente in nuove molecole di DNA. Due fasi nella replicazione del DNA: Viene svolta la doppia elica, ottenendo due filamenti stampo. I nuovi nucleotidi formano appaiamenti complementari di basi col DNA stampo e vengono legati tra loro da legami fosfodiesterici tramite una reazione di condensazione.  I nucleotidi vengono aggiunti al nuovo filamento all’estremità 3’ (5’ 3’). I legami che collegano i gruppi fosfato dei nucleosidi trifosfati (dNTP) vengono rotti, liberando energia che alimenta la reazione. Si libera un pirofosfato (PPi) La replicazione del DNA inizia quando un grande complesso proteico (complesso di pre-replicazione) si lega ad una regione del DNA detta origine di replicazione (ori). In E. coli, che ha un solo cromosoma circolare, si ha un sito ori, il DNA viene svolto e la replicazione procede in entrambe le direzioni, formando due forcelle replicative. Replicazione in 40 min. I cromosomi eucariotici sono molto più lunghi, ed hanno numerose origini di replicazione. Diversamente, occorrerebbero settimane per replicare i cromosomi, i quali possono essere lunghi fino a milioni di coppie di basi (replicazione in poche ore). Un enzima, detto primasi (DNA polimerasi 𝛼 negli eucarioti), sintetizza un primer: un breve filamento innesco – solitamente RNA (decina nucleotidi RNA + aluncuni di DNA in eucarioti). Il primer è complementare al DNA stampo Un enzima, detto primasi (DNA polimerasi 𝛼 negli eucarioti), sintetizza un primer: un breve filamento innesco – solitamente RNA (decina nucleotidi RNA + aluncuni di DNA in eucarioti). Il primer è complementare al DNA stampo Successivamente, la DNA polimerasi (enzima) allunga il nuovo filamento aggiungendo nucleotidi a un filamento esistente. La DNA polimerasi III (procarioti) / DNA polimerasi 𝛿/𝜀 eucarioti) aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ fino a che la sezione è completa. Il primer viene degradato e sostituito con nuovo DNA. Le DNA polimerasi sono più ampie dei propri substrati, i dNTPs, e del DNA stampo L’enzima è conformato come una mano destra aperta – nel “palmo” c’è il sito attivo dell’enzima che unisce I dNTP (deossiribonucleosidi trifostafo: dATP, dTTP, dCTP, dGTP) al DNA stampo Le “dita” riconoscono le basi nucleotidiche. Altre proteine rivestono un ruolo nella replicazione: La DNA elicasi usa energia dall’idrolisi di ATP per svolgere il DNA. Le proteine leganti i singoli filamenti (SSB) impediscono ai filamenti di tornare appaiati tra loro. Alla forcella di replicazione il DNA si apre come una cerniera in una direzione. Il filamento guida (leading strand) cresce alla sua estremità 3′ all’aprirsi della forcella. Nel filamento copia o lento (lagging strand) l’estremità 3’ è lontana dalla forca e si forma un’interruzione non replicata. La sintesi del filamento lento (tardivo) avviene in brevi filamenti discontinui detti frammenti di Okazaki. Ogni frammento richiede il proprio primer, sintetizzato dalla primasi. La DNA polimerasi III aggiunge nucleotidi all’estremità 3′, fino a raggiungere il primer del frammento precedente. Negli eucarioti abbiamo: la DNA polimerasi 𝜀 per la sintesi del filamento guida) la DNA polimerasi 𝛿 per la sintesi del filamento ritardato. La DNA polimerasi I (in procarioti ma DNA polimerasi 𝛿 in eucarioti) sostituisce poi il primer con DNA. Il legame finale fosfodiestere tra i frammenti viene catalizzato dalla DNA ligasi FILAMENTO RITARDATO IL Primer è sintetizzato da DNA primasi La replicazione avviene in due direzioni DNA polimerasi allunga il filamento Filamento guida Ogni filamento ha una sua direzionalità, dovuta al modo in cui ogni residuo di zucchero si lega al successivo, e che nella doppia elica i due filamenti decorrono con polarità opposte Un filamento di DNA può essere sintetizzato sempre e solo in direzione 5’-3’e mai da 3’ a 5’. Il nucleotide aggiuntivo può essere aggiunto solamente all’estremità 3’, mai all’estremità 5’!  Le DNA polimerasi lavorano velocemente perchè: Esse sono processive: catalizzano molti legami ogni volta che si legano al DNA, anzichè un solo legame Il complesso DNA polimerasi-DNA è stabilizzato da una pinza scorrevole sul DNA, una proteina che mantiene l’’enzima e il DNA a stretto contatto. Negli eucarioti, il complesso di replicazione rimane stazionario mentre si muove il DNA. DNA polimerasi coinvolte nella replicazione del genomi procarotici ed eucariotici PROCARIOTI DNA polimerasi I Riempimento dei “gap” lasciati dalla rimozione dell’innesco (primer) Riparazione DNA DNA polimerasi III enzima principale della replicazione EUCARIOTI DNA polimerasi 𝛼 Innesco replicazione DNA (primasi) DNA polimerasi 𝛿 Enzima principale della replicazione per il filamento ritardato DNA polimerasi 𝜀 Enzima principale della replicazione per il filamento continuo  I telomeri I cromosomi eucariotici hanno sequenze ripetitive alle estremità, dette telomeri. Negli esseri umani la sequenza è TTAGGG, ripetuta circa 2500 volte. Essa impedisce al sistema di riparazione del DNA di interpretare l’estremità del cromosoma come una rottura ed eventualemente unire due cromosomi. Nei filamenti lenti, quando viene rimosso il primer di Okazaki terminale, non può essere sintetizzato DNA per rimpiazzarlo (non c’è un’estremità 3’ da allungare). La breve sequenza di DNA viene rimossa, ed il cromosoma diventa più corto ad ogni replicazione (perdita di 50/200 paia di basi a ogni replicazione). Dopo molte divisioni, i geni potrebbero essere persi e la cellula morire Cellule in continua divisione, come le cellule staminali del midollo osseo e le cellule germinali, hanno la telomerasi, che catalizza l’aggiunta di sequenze telomeriche perse. Nei procarioti il problema della replicazione alla fine dei cromosomi non esiste perchè la molecola di DNA è circolare.  Filamento ritardato di nuova sintesi Primer che si degrada DNA telomerico con estremità 3’ sporgente La telomerasi porta il proprio RNA stampo complementare alle sequenze ripetute del telomero  La telomerasi sintetizza DNA da uno stampo a RNA. Estremità 3’ del filamento stampo allungata di una unità ripetuta  Estensione del filamento ritardato da parte della DNA polimerasi 𝛼 (sintetizza il primer) 5’ Estensione del filamento ritardato da parte della DNA polimerasi 𝛿 5’  Primer che si degrada https://www.youtube.com/watch?v=2xMhfdeeU8Y https://www.youtube.com/watch?v=i6nE6gUp2cw  Le DNA polimerasi possono inizialmente fare errori, oppure il DNA può essere danneggiato da Riparazione sostanze chimiche, radiazione UV o altri agenti. Le cellule hanno tre meccanismi di riparazione: Correzione di bozze o “Proofreading” Riparazione di appaiamenti erronei (“mismatch”) Riparazione per escissione La correzione di bozze del DNA: Mentre la DNA polimerasi aggiunge un nucleotide ad un filamento in crescita, può riconoscere gli appaiamenti errati. Se le basi sono appaiate in modo errato, il nucleotide viene rimosso. Riparazione degli appaiamenti errati: Il DNA di nuova sintesi viene controllato da altre proteine, alla ricerca di errori; gli appaiamenti errati vengono corretti. Se il sistema di riparazione degli appaiamenti errati fallisce, il DNA sarà alterato. Riparazione per escissione: Degli enzimi controllano costantemente il DNA alla ricerca di basi danneggiate – queste vengono escisse e la DNA polimerasi I aggiunge quelle corrette.  Reazione a catena della polimerasI (PCR) I principi della replicazione del DNA sono stati usati per sviluppare la tecnica della reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction o PCR). Un processo automatizzato produce numerose copie di brevi sequenze di DNA, da utilizzare per la manipolazione genetica e la ricerca (amplificazione del DNA).  Una miscela di PCR contiene: Un campione di DNA a doppio filamento (lo stampo) Due primer sintetizzati artificialmente I quattro dNTPs DNA Una DNA polimerasi che possa tollerare le alte temperature Sali e tampone per mantenere un pH neutro. L’amplificazione PCR è un processo ciclico: I filamenti di DNA vengono separati (denaturazione) per riscaldamento a 95 °C (DNA polimerasi da un batterio delle acque termali, Thermus aquaticus che resiste ai 95 °C) L’amplificazione PCR è un processo ciclico: I filamenti di DNA vengono separati (denaturazione) per riscaldamento a 95 °C (DNA polimerasi da un batterio delle acque termali, Thermus aquaticus che resiste ai 95 °C) La reazione viene raffreddata per permettere ai primers di appaiarsi ai filamenti stampo (annealing) L’amplificazione PCR è un processo ciclico: I filamenti di DNA vengono separati (denaturazione) per riscaldamento a 95 °C (DNA polimerasi da un batterio delle acque termali, Thermus aquaticus che resiste ai 95 °C) La reazione viene raffreddata per permettere ai primers di appaiarsi ai filamenti stampo (annealing) La reazione viene scaldata alla temperature ideale alla quale la DNA polimerasi catalizza nuovi filamenti (allungamento). Le regione di DNA che viene amplificata è quella compresa tra i due oligonucleotidi Questa sequenza di passaggi viene ripetuta molte volte (25/30 volte) In questa fase si ha la formazione dei long products, ossia di frammenti di Ciclo 1 DNA delimitati solo dal lato in cui i primers si ibridano.  Ciclo 1 A partire dal secondo ciclo di amplificazione si Ciclo 2 formano gli short products  Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 https://www.youtube.com/watch?v=QPOMrRUOMaY  95° Primo ciclo Secondo ciclo Terzo ciclo 2 copie 4 copie 8 copie Dopo il primo ciclo da una singola molecola di DNA se ne originano 2, dopo il secondo ciclo da queste se ne originano 4, dopo il terzo da queste se ne originano 8 e così via, Dopo n cicli da una singola molecola di DNA si otterranno 2n frammenti di DNA