Biotecnologia - Técnicas de Engenharia Genética PDF

Biologia Biotecnologi a  Biologia Orgâ Biotecnologi o nic a É a área do conh...

Biologia Biotecnologi a  Biologia Orgâ Biotecnologi o nic a É a área do conhecimento que utiliza os processos celulares e biomoleculares presentes nos seres vivos para desenvolver produtos à escala industrial. A maioria dos processos biotecnológicos atuais envolve a utilização de seres vivos obtidos com recurso à engenharia genética.  Biologia Técnicas de engenharia genética Técnica de DNA recombinante Local de restrição da enzima Hind III Recorre a enzimas de restrição para isolar e combinar segmentos de DNA de diferentes origens. As enzimas cortam as cadeias da molécula em locais específicos. São originados fragmentos que possuem extremidades de cadeia simples – extremidades coesivas. Extremida de coesiva  Biologia Técnicas de engenharia genética Etapas da técnica de DNA recombinante 1 Uso da mesma enzima de restrição para: Gene de 1 interesse – isolar o gene de interesse; – clivar DNA a usar como DN vetor A do gene de interesse. 1 Vetor Corte com (plasmídeo) enzima de restrição  Biologia Técnicas de engenharia genética Etapas da técnica de DNA recombinante 1 Uso da mesma enzima de restrição para: Gene de 1 interesse – isolar o gene de interesse; – clivar DNA a usar como 2 DN vetor A 2 Inserção do gene isolado 1 do gene de interesse. no vetor (que pode ser um Plasmídeo recombinante plasmídeo); atuam as DNA ligases, Vetor Corte com que unem as extremidades (plasmídeo) enzima de coesivas. restrição  Biologia Técnicas de engenharia genética Etapas da técnica de DNA recombinante 1 Uso da mesma enzima de restrição para: Gene de 1 interesse - Isolar o gene de 3 interesse; Inserção na - Clivar DNA a usar como 2 bactéria DN vetor A 2 Inserção do gene isolado 1 do gene de interesse. no vetor (que pode ser um Plasmídeo Bactéria com o recombinante gene de plasmídeo); atuam as DNA interesse ligases Vetor Corte com que unem as extremidades (plasmídeo) enzima de 3 Introdução do plasmídeo de coesivas. restrição rDNA na célula hospedeira.  Biologia Técnicas de engenharia genética Etapas da técnica de DNA recombinante 4 Seleção das células nas quais o gene de interesse se expressa.  Biologia Técnicas de engenharia genética Eletroforese Técnica que utiliza um gel de Fonte agarose ou de poliacrilamida. elétric a O gel atua como uma peneira, para separar moléculas de DNA. Solução- À medida que se movem do tampão polo negativo para o positivo, as moléculas vão sendo separadas ét rod El por tamanho. o As moléculas mais pequenas avançam mais no gel. Poços (amostras) étrod El o  Biologia Técnicas de engenharia genética Eletroforese As moléculas são separadas em Fonte bandas, cada uma com vários elétric a milhares de moléculas de DNA com o mesmo tamanho. Esta técnica permite separar de Solução- forma rápida os fragmentos de tampão restrição de uma molécula de t rod Elé DNA clivada. o Poços (amostras) étrod El o  Biologia Técnicas de engenharia genética Técnica do DNA complementar (cDNA) Transcript Consiste na produção de cDNA a partir ase de mRNA processado. reversa É catalisado pelas enzimas transcriptases reversas. São obtidos genes eucarióticos apenas com exões. A DNA polimerase produz a cadeia complementar em falta. DNA polimeras e  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – PCR Técnica de polimerização de DNA in vitro que permite a obtenção rápida de milhões de cópias de um dado segmento. Após o processo de amplificação, o produto é sujeito a eletroforese para determinar se um dado fragmento de DNA foi amplificado.  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – PCR Material necessário: Amostra de DNA DNA primers Amostra de DNA nucleótidos livres (dNTPs) DNA polimerase DNA dNT Solução-tampão primers Ps DNA polimerase Solução- tampão  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – PCR As amostras são colocadas num termociclador. Amostra de DNA dNTPs DNA DNA polimerase prime rs Solução- tampão  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – PCR No termociclador, a amplificação ocorre graças à variação cíclica da temperatura das amostras. 1 Desnaturaç 2 Ligação dos 3 Alongamen ão primers to DNA polimerase DNA-molde  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – PCR A repetição do ciclo permite a obtenção de milhões de cópias do DNA. 1 Desnatura 2 Ligação dos 3 Alongame ção primers nto DNA polimerase DNA- molde Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4  Biologia Técnicas de engenharia genética Reação em cadeia da polimerase – Desnaturaçã PCR o A técnica PCR ocupa uma posição nuclear Termocicla em engenharia genética. dor Ligação dos primers Amostra de 25-40 ciclos DNA Alongament o dNTPs DNA DNA polimerase prime rs Solução- tampão Cópias de Ciclo DNA 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo  Biologia Técnicas de engenharia genética Edição genética 3 Esta técnica baseia-se na utilização de sistemas enzimáticos designados por CRISPR-Cas, sendo o 2 Enzima mais utilizado o sistema CRISPR-Cas9, do tipo II. Cas9 O sistema CRISPR-Cas9 envolve dois componentes 1 CRISPR RNA- essenciais: guia 1 as CRISPR RNA, específicas da sequência-alvo do 2 DNA; 4 A molécula de RNA possui duas partes: a Cas9, uma endonuclease de restrição. 3 uma liga-se à sequência CRISP; 4 outra localiza a sequência de DNA.  Biologia Técnicas de engenharia genética Edição genética A enzima Cas9 reconhece uma sequência Sequência- Enzima Cas9 RNA- guia alvo de alguns nucleótidos, adjacente à Clivage sequência-guia (PAM), cortando a cadeia DNA-alvo m dupla. Das junções das extremidades pode resultar Clivage m PAM a inativação dos genes ou a sua substituição. Reparaç ão Inserção (novo gene)  Biologia Técnicas de engenharia genética Impressão digital genética Em regiões não codificantes do =7 =6 genoma, ocorrem repetições repetições repetições em cadeia de dois a seis pares de bases, os microssatélites ou STR. =4 = 19 As repetições são herdadas de repetições repetições ambos os progenitores. Cada indivíduo possui um padrão único de STR, que é utilizado como uma marca = 12 = 14 repetições repetições genética do indivíduo, ou seja, como uma impressão digital genética (genetic STR – local STR – local fingerprint). 1 2  Biologia Técnicas de engenharia genética Impressão digital genética Os STR são amplificados com recurso a PCR. Os fragmentos obtidos são sujeitos a eletroforese.  Biologia Técnicas de engenharia genética Impressão digital genética É obtido um padrão único de STR, usado como impressão digital genética (genetic fingerprint).  Biologia Transformação genética de organismos A modificação de organismos pela adição ou remoção de sequências de DNA estranhas ao seu genoma cria organismos transgénicos, ou organismos geneticamente modificados (OGM). Estes organismos são usados para aumentar a produção vegetal ou animal, para a produção de vacinas ou para a resolução de problemas ambientais.  Biologia Transformação genética de organismos A transformação dos organismos assenta, essencialmente, no uso da tecnologia do DNA recombinante. Os genes com as sequências estranhas ao genoma do organismo são designados por transgenes.  Biologia Transformação genética de organismos Microrganismos geneticamente modificados Extração do Muitos microrganismos, plasmídeo da bactéria como bactérias, leveduras ou vírus, são facilmente modificados Isolamento do gene da insulina geneticamente. Reintrodução do A elevada taxa de plasmídeo na Plasmíde bactéria reprodução destes o de rDNA microrganismos transgénicos permite produzir grandes Purificação e quantidades de diferentes embalagem Multiplicação das bactérias moléculas úteis, como da insulina para transgénicas e produção de enzimas e hormonas; é o tratamento dos insulina diabetes  Biologia Transformação genética de organismos Plantas geneticamente modificadas A transformação genética das plantas permite: modificar a proporção de lípidos, de amido ou de proteínas nas sementes; conferir resistência a pragas e a vírus; aumentar a tolerância a ambientes extremos.  Biologia Transformação genética de organismos Plantas geneticamente modificadas A transferência de vetores para células totipotentes do calo permite a sua modificação genética eo desenvolvimento de plantas que expressam os genes introduzidos.  Biologia Transformação genética de organismos Animais geneticamente modificados A transformação genética dos animais permite alterar características específicas, como, por exemplo: a resistência a doenças; o aumento de crescimento; a produção de determinados produtos.  Biologia Transformação genética de Animais geneticamente modificados – processos de organismos transferência de genes Microinjeç Células Retrovír Transferênci ão pró- estaminais us a nuclear nuclear embrionárias  Biologia Diagnóstico e terapêutica de doenças Microarrays de DNA É uma ferramenta usada para identificar a expressão de milhares de genes ao mesmo tempo. Consiste numa placa microscópica com pontos predefinidos onde são colocadas amostras de DNA em contacto com sondas polinucleotídicas.  Biologia Diagnóstico e terapêutica de doenças Microarrays de DNA – exemplo de uso Hibridação do DNA com a 1 O mRNA é extraído de 1 sonda de 2 diversas células. prova 3 Suport 2É produzido cDNA a partir do mRN e de A cDN mRNA. Células sondas 3 normais A Resulta As diferentes amostras de dos 4 cDNA são colocadas em 2 contacto com as sondas de 1 cada ponto (previamente 4 colocadas). cDN Ausente Em mRN em células A Células A ambas tumorais Diferentes processos de tumorais Em Em células ambas normais hibridização produzem um padrão de cores característico,  Biologia Terapia genética Envolve alterações no genoma dos indivíduos. A terapia génica de células está limitada às células somáticas de determinados tecidos. Esta terapia génica recorre a vetores virais seguros, sendo feita inserindo o gene funcional numa célula e deixando presente o gene original não funcional.  Biologia Terapia A manipulação genética dos genes pode ser realizada:  in vivo;  ex vivo.