Metodi di analisi del DNA mediante elettroforesi e PCR PDF

VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ E QUANT ITÀ DEL DNA CORSA ELETTROFORETICA È possibile effettuare una valutazione della quantità e della qualità del DNA mediante CORSA ELETTROFORETICA. Infatti gli acidi nucleici sono carichi e possono essere separati in un campo elettrico in presenza di u...

VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ E QUANT ITÀ DEL DNA CORSA ELETTROFORETICA È possibile effettuare una valutazione della quantità e della qualità del DNA mediante CORSA ELETTROFORETICA. Infatti gli acidi nucleici sono carichi e possono essere separati in un campo elettrico in presenza di una matrice porosa in una cameretta con 2 elettrodi ed in presenza di un tampone (TAE 1X o TBE1 o 0,5X) con EDTA (per evitare degradazione). La velocità di migrazione dipende dalla dimensione e in parte anche dalla forma. Le matrici possono essere di diverso tipi: - AGAROSIO: polisaccaride che crea una matrice porosa con pori di dimensione variabile in base alla quantità presente. Consente di separare frammenti che differiscono di almeno 20/30 bp e non di pochi nucleotidi. È utilizzato per separare frammenti di dimensioni comprese tra 50bp fino a 25kbp andando a variare la concentrazione di agarosio → + agarosio per frammenti piccoli, - per frammenti grandi. La corsa viene effettuata a a voltaggio costante e 3 V/cm. ! Esistono versioni di agarosio modificate per lavorare con frammenti più grandi o per taglie più piccole. - ACRILAMMIDE: ha una maggiore risoluzione e consente la separazione frammenti molto simili tra di loro. La concentrazione minima utilizzata è il 3% ed è utilizzata per frammenti che hanno un massimo di 500bp. ‼ Risulta quindi importante effettuare una scelta corretta e adeguata in base a quello che vogliamo separare. Per la separazione di frammenti molto grandi di DNA si utilizza l’elettroforesi in campo pulsato. Gli elettrodi sono posti a 45 gradi e il campo elettrico varia continuamente. Questo consente a frammenti più grandi di passare attraverso le maglie della matrice più facilmente. Viene solitamente utilizzato ad esempio per i cromosomi di lievito. Per la separazione elettroforetica i campioni vengo caricati in pozzetti assieme a colorate, loading buffer e glicerolo che consente di aumentarne la densità. La corsa viene effettuata in presenza di coloranti: storicamente veniva utilizzato l’etidio bromuro che è però un mutageno. Oggi vengono utilizzate altre sostanze, intercalanti del DNA che danno un segnale visivo che può essere fluorescente in seguito ad eccitazione con UV oppure con luce blu. La visualizzazione avviene grazie a un transluminatore o gelDOC. SYBYR GREEN In alternativa possono essere utilizzati metodi radioattivi come il silver staining. Alla fine della corsa elettroforetica sul gel sarà possibile osservare le diverse bande di DNA: in alto troveremo sempre il DNA genomico mentre i prodotti di PCRT si troveranno nella parte bassa del gel. 48 È possibile STIMARE LA DIMENSIONE DEI FRAMMENTI utilizzando un marcatore di pesi molecolari che viene caricato e fatto correre insieme al nostro campione. Sono una collezione di frammenti di peso molecolare noto che consente di stimare il peso dei nostri frammenti in base alla loro migrazione. È possibile anche STIMARE LA CONCENTRAZIONE DEL DNA a livello occhiometrico in gel. Si procede mediante l’utilizzo di DNA genomico ad esempio di fago lambda a concentrazioni note e si produce una scala di diverse concentrazioni. Tale scala viene confrontata con il nostro campione → si osserva a quale intensità di banda in nostro campione assomiglia maggiormente o dove si colloca. Si ottiene anche un’informazione sulla QUALITÀ: se il DNA è integro osservo un’unica banda altrimenti uno smear ovvero una strisciata di diversi pesi molecolari. Dal gel è inoltre possibile recuperare un particolare frammento frammento di interesse → altro metodo per purificare il DNA. Per visualizzare il DNA esistono inoltre sistemi di microfluidica →si basa sulla presenza di chip con diversi pozzetti dove caricare i campioni e dei canali con una matrice dove i campioni corrono. Al di sotto del chip si trova un sistema di detezione che visualizza grazie a coloranti la corsa del DNA dando un’immagine digitale. 49 ANALISI SPETTROFOTOMETRICA Il DNA in soluzione acquosa ha un picco assorbanza a 260nm. Tale assonanza può essere utilizzata per dedurne la concentrazione. Affinché si ottengano risultati attendibili il DNA deve essere in soluzione con assorbanza compresa tra 0,1 ed 1 OD. La misurazione va effettuata allo spettrofotometro dopo averlo azzerato con il bianco e si utilizzano cuvette trasparenti a UV di quarzo. Per ottenere dall’assorbanza un valore di concentrazione si utilizza tale trasformazione → 1OD = 50ng/𝛃L. ‼ Questo vale per dsDNA mentre per ssDNA è pari a 40ng/𝛃L. In un campione di DNA si misurano altri valori di assorbanza: - a 280nm: assorbanza delle proteine. Rapporto OD260/OD280 deve essere compreso tra 1,8 e 2 - a 230nm: dovuta a contaminazione da guanidinio, fenolo o polisaccaridi 2 0/1 1.. - a 320nm dovrebbe esserci assorbanza molto bassa → controllo che tutto sia corretto NANODROP È uno spettrofotometro che consente di lavorare con volumi molto ridotti in modo da evitare uno spreco di campione. Viene caricata una goccia di DNA, solitamente 1,5-2𝛃L, si abbassa il braccio e si crea una colonna di liquido dove passa il raggio UV e avviene la misurazione dell’assorbanza. 50  MANIPOLAZIONE ENZIMAT ICA DEL DNA PURIFICATO È possibile manipolare il DNA utilizzando enzimi tipicamente purificati o prodotti in maniera ricombinante che sono disponibili in commercio. Sono enzimi che tipicamente troviamo all’interno della cellula e svolgono ruoli importante per le sue diverse funzioni. NUCLEASI Le nucleasi tagliano il DNA tipicamente nel legame fosfodiesterico. Possono essere classificate come: - esonucleasi: accorciano e degradano gli acidi nucleici a partire dalle estremità. Possono agire su una sola estremità (5’ o 3’) o su entrambe a seconda dell’enzima specifico usato - endonucleasi: rompono il legame fosfodiesterico tra nucleotidi posizionati internamente. Possono agire su filamento singolo o doppio o entrambi - endonucleasi di restrizione: il taglio del DNA avviene in corrispondenza di sequenze specifiche. Sono diverse tra di loro, possono riconoscere sequenze di 4-6 bp o anche più lunghe, possono tagliare più a monte o più a valle. Possono produrre estremità piatte oppure coesive. Vengono utilizzate per il clonaggio classico ! È possibile fare una stima di quante volte taglia l’enzima di restrizione andando a vedere quante volte ricorre il sito di restrizione nel genoma o nel frammento. Come si allestisce una reazione di restrizione→ DNA e poi si aggiunge il buffer tipico per ogni enzima di restrizione. Si aggiunge l’enzima di restrizione, si fa l’incubazione a 37℃ per un determinato numero di ore (in base a digestione analitica o preparativa): per un clonaggio durata di 3 ore affinché tutto sia digerito, se invece vogliamo solamente vedere se c’è un sito di restrizione è necessaria un’ora. Se vogliamo solo vedere la presenza di un sito si carica in gel senza purificare mentre se si deve fare un clonaggio è necessario fare una purificazione per togliere l’enzima di restrizione. Se si utilizzano più enzimi di restrizione contemporaneamente si devono controllare le specifiche dei buffer. LIGASI Le ligasi consento di unire molecole di acidi nucleici riparando la discontinuità tra nucleotidi dovute ad assenza di legame fosfodiesterico, sia su singola che su doppia elica. Può funzionare sia con estremità piatta che con estremità coesive. L’efficienza è maggiore per le estremità coesive. Viene usato l’enzima T4 DNA ligasi di E.coli. È possibile fare una PCR utilizzando primer a cui vengono aggiunti siti di restrizione, al 5’, nel momento in cui, dopo una amplificazione, il nostro obiettivo è quello di inserire il frammento all’intento di un vettore. POLIMERASI Le polimerasi sono enzimi che copiano gli acidi nucleici usando uno stampo. Necessitano di un innesco a doppio filamento per l’inizio della reazione ovvero di un primer. 51 DNA polimerasi I ha sia attività polimerasica che esonucleasica in direzione 5’-3’. Ovvero nel momento in cui ripara un nick il filamento integro presente accanto, anche se corretto e integro viene sostituito. Sostituisce anche i nucletidi che sono vicini al nick in quanto ha anche abilità esonucleasica. Porzione della DNA polimerasi di E. Coli che è stato ottenuto per mantenere solo l’attività polimerasica della pol 1 senza mantenere l’attività esonucleasica. Frammento di Klenow: deriva dalla DNA polimerasi I ma ha sola attività di sintesi. I nucleotidi esistenti non vengono quindi sostituiti. Taq DNA polimerasi I di Thermus aquaticus, un batterio che vive ad alte temperature. Viene usata per la PCR in quanto termostabile. Trascrittasi inversa: deriva dal virus e utilizza come stampo l’RNA per sintetizzare un cDNA. ENZIMI DI MODIFICAZIONE Sono enzimi che rimuovono o aggiungono gruppi chimici. Fosfatasi alcalina: rimuove il fosfato in 5’ dalle molecole di DNA. Polinucleotide kinasi (PNK): aggiunge il gruppo fosfato in posizione 5’ terminale. Viene usata per le ligazione che necessitano il fosfato. Questi due enzimi risultano utili per sostituire il fosfato presente con un fosfato radioattivo o marcato. 52  IBRIDAZIONE MOLECOLARE Il processo di ibridazione molecolare si basa sulla denaturazione e rinaturazione del DNA. Un amento della temperatura causa la denaturazione del DNA, ovvero da ds passa a ss. Questo processo è però reversibile: in seguito a raffreddamento può avvenire la rinaturazione. Il processo è strettamente dipendente dalla composizione del DNA → maggiore è il numero di GC maggiore è il calore necessario per la denaturazione. Data la sequenza è possibile stimare la temperatura di Melting ovvero la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate. Processo Due filamenti di DNA a singolo filamento, abbassando la temperatura, tendono a ibridarsi. Inizialmente si ha la formazione di un ibrido instabile perché i legami idrogeno che tengono uniti i filamenti devono competere con le forze che tendono a staccare i due filamenti. Solo quando l’ibridazione è sufficientemente completare da avere un determinato numero di legami a idrogeno l’ibrido è stabile. Maggiore è la complementarietà tra le basi maggiore è la stabilità dell’ibrido. Di conseguenza il processo dipende sia dalla sequenza che dalla temperatura. L’ibridazione DNA/DNA consente di studiare l’organizzazione dei geni nel genoma, ad esempio mediante Southern blotting oppure consente di effettuare screening di librerie genomiche o di cDNA. Le diverse applicazioni dell’ibridazione molecolare: - Definire quanti membri di una famiglia genica si possono trovare in un genoma (Southern blotting) - Verificare in organismi transgenici quante copie di transgene sono state inserite (Southern blotting) - Arricchire in geni presenti solo in determinati tessuti - Isolare cloni genomici che portano il gene di interesse in librerie genomiche o di cDNA - Analisi microarray 53  Serve per identificare in che punto di un dna è presente un gene di interesse SOUTHERN BLOTTING Il Southern blotting rappresenta il primo protocollo che ha sfruttato l’ibridazione molecolare del DNA. Sfrutta l’utilizzo del DNA genomico trasferito su di una membrana che può poi essere testata con delle sonde1 per l’ibridazione. RADIOAMVE Il DNA genomico deve essere digerito e ne servono almeno 10𝛃g. La separazione viene effettuata in gel e successivamente il gel viene poi usato per il trasferimento su membrana. Per il trasferimento si ha la costruzione del castelletto. In una vaschetta si trova il tampone di trasferimento e un supporto di vetro. Si immerge della carta assorbente nel tampone, si posiziona sopra il gel poi la membrana di nitrocellulosa e al di sopra la carta assorbente che farà da driving force per il trasferimento. Il liquido risale per capillarità e dal passaggio dal gel alla membrana si porta dietro il DNA. Il tutto agisce overnight. ! In alcuni casi il DNA può essere trattato con HCl per indurre la depurinazione che facilita il trasferimento alla membrana e con una soluzione denaturante. Segue poi un trattamento con soluzione neutralizzante. Nadt Il giorni successivo si recupera la membrana e il DNA viene saldato con UV o cottura a 80℃. La membrana può essere ora ibridata con sonde marcate per i geni che si stanno studiando. L’ibridazione della sonda ai siti complementari sul genoma digerito della membrana è effettuata, dopo aver saturato la membrana, in tubo da ibridazione/vaschette e lasciata overnight alla temperatura di ibridazione. La membrana viene quindi lavata ed esposta per rilevare l’appaiamento della sonda → se la sonda è marcata ad esempio con radioattivo uso l’autoradiografia. 1. Dna viene digerito con enzimi di restrizione 2. Si effettua elettroforesi su gel per separare i vari frammenti di dimensioni diverse che si sono ottenuti. 3. si immerge il gel in una soluzione denaturante. Si può anche aggiungere HCl per indurre depurinazione che facilita trasferiemnto su membrana. Metti su piatto rotante. 4. Si neutralizza on soluzione neutralizzante 5. Si prepara il castelletto : vaschetta ricca di transfer buffer il wick (Blotting paper) viene appoggiata su un supporto che sta sopra la vascehtta con le estremità che sono immerse nle buffer. Si ricopre il wick con soluzione. pezzi di blotting paper sopra wicha anch’essi bagnati da buffer Sopra la blotting paper appena aggiunta si mette il gel ( ormai denaturato e neutralizzato) Sopra il gel si mette la membrana di nitrocellulosa o nylon il quale è stato già trattato con soluzioni che bloccano altri siti di legame sulla membrana per le sonde. sopra la nitrocell si mettono altri pezzi di carta blot + vetro + pesi che tangano fermo Lascio overnight.—>per azione capillarità e carica positiva membrana il dna si trasferisce da gel a membrana. 6. Tolgo la membrana 7.. fisso il dna in mmebrana. Tramite trattamento uv o cottura 80° 8. Metto la membrana in incubazione con soluzione contenente i probe radioattivi specifici per il mio gene di interesse. 9.. i probe raioattivi si legano e tramite autoradiazione posso vedere dove il mio gene è presente. MEMBRANE UTILIZZATE Nitrocellulosa - bassa capacità di legame (specie per frammenti piccoli) - legame del DNA idrofobico e non covalente - poco robusta (tende a sbriciolarsi) e quindi difficilmente riutilizzabile problemi di conservazione - basso background (bassa presenza di legami aspecifici) 54 Nylon - maggior capacità di legame - legame covalente del DNA - più robusta e riutilizzabile più volte - diverse tipologie: neutre o cariche positivamente (cariche hanno ancor maggior capacità di legame ma danno background aspecifico; richiedono specifici protocolli di trasferimento e blocking) CONDIZIONI DI IBRIDAZIONE ✷ Prima dell’ibridazione la membrana viene preibridata con la stessa soluzione di ibridazione e saturata per evitare legami aspecifici e background nelle stesse condizioni per l’ibridazione in tubi in rotazione in fornetti, bustine di plastica o vaschette. ✷L’ibridazione è condotta in tubi in rotazione in fornetti, bustine di plastica o vaschette a 65°C o 42°C a seconda della tipologia di buffer di ibridazione (NB: la presenza di formammide consente di abbassare la temperatura di ibridazione). ✷Dopo l’ibridazione le membrane vengono lavate con buffer che contengono concentrazioni decrescenti di sali per favorire solo il legame dell’ibridazione specifica. ✷Dopo la rilevazione autoradiografica la sonda ibridata può essere rimossa e la membrana eventualmente usata per altre ibridazioni. OLIGONUCLEOTIDI DA USARE COME SONDE Si sceglie il gene di interessa da studiare. Si amplificano e purificano oligo con temperatura di Melting almeno 10℃ superiore a quella dell’ibridazione. Maggiore è la lunghezza maggiore sarà la specificità. Posso utilizzare sonde eterologhe: voglio vedere geni condivisi in due organismi diversi. Le vensono or ALTRI ORCANISITI Posso inoltre creare sonde degenerate ovvero con nucleotidi che possono essere variabili tra di loro. Si ha ibridazione fino a un 70% di complementarietà ma poi dipende dalle condizioni. La sonda deve essere resa visibile ovvero marcarla incorporando un nucleotide tracciabile, per radioattività o non. Sono presenti diversi metodi di incorporazione. Dopo la marcatura è importante purificare la sonda per rimuovere i nucleotidi marcati non incorporati con l’utilizzo di una colonna cromatografica. METODI DI MARCATURA DELLE SONDE Aggiunge fosfato S' Marcatura terminale F Marcatura della sonda in posizione terminale con l’uso della polinucleotide chinasi. Si verifica la sostituzione del gruppo OH con un fosfato marcato in posizione 5’ terminale. Produce bassi livelli di marcatura. 55 Marcatura interna Con l’utilizzo di DNA polimerasi I o frammenti di Klenow. Posso utilizzare ATP con un fosfato marcato radioattivo. Questa verrà inserita al posto delle A. Marcatura mediante nick translation → si crea un nick con la DNasi I e si ripara con DNA polimerasi I che consente di incorporate ATP marcata. Marcatura mediante end filling → estremità a singolo filamento riparate con frammento di Klenow che inserisce ATP marcata. Marcatura mediante random priming → vengono utilizzati oligonucleotidi randomici di 6-7bp per dare origine a un ds a cui si legherà frammento di Klenow e darà poi origine al DNA marcato. Marcature non radioattive - meno pericolose - no problemi di smaltimento di radioattivo - più veloce - meno costosa - molti kit disponibili - sistema di rilevazione indiretto: minor sensibilità a alti background (in particolare per biotina) ANALISI MICROARRAY Si bassa sulla presenza di un supporto solido su cui si trovano gli oligonucleotidi complementari a tutti i geni del genoma che andiamo a inserire nei pozzetti. Viene utilizzato il cDNA ottenuto da un organismo in una determinata condizione per vedere i geni espressi in quel momento. Il cDNA viene marcato e poi ibridato al supporto solido. 56  ANALISI DEL DNA MEDIANTE PCR La PCR si compone di tre step: - denaturazione - annealing - extension Disegno di primer Il processo si basa sul disegno di primer per creare un innesto di dsDNA. I primer presentano una sequenza da 20-25 paia di basi con una temperatura di melting e annealing definita dall’operatore. → T di melting: temperatura a cui metà del primer è dissociato dal templato. Tm = (4 x GC) + (2 x AT) ! La MELO Ol ArmaLing del: Esseri inciuc nitoso solo clicha el T CHE Altaltino Sh evettore →T di annealing: deve essere il più vicino possibile alla temperatura di melting, per favorire la specificità, ma non troppo alta per garantire un buon appaiamento e una certa efficienza. ⚠ È importante che la sequenza del primer dia una Tm compresa tra 50℃ e 60℃. La temperatura di annealing invece viene definita dall’operatore ed è minore di 5 ℃ rispetto alla Tm affinché i primer siano ibridati. Il primer forward corrisponde alla sequenza 5’→3 mentre il primer reverse è il reverse complement letto dalla fine. È possibile modificare il 5’ del primer senza problemi mentre il 3’ non deve essere modificato e inoltre deve essere arricchito da sequenze con alto contenuto di GC per favorire l’appaiamento specifico. L Hanno + recAlti It Al 5’ sono invece consentite diverse modifiche: - siti di restrizione per il clonaggio - aggiunta di gruppi fluorescenti ovvero fluorofori che sono molecole stericamente ingombranti. In questo modo is ha un tag e l’amplicone può essere rilevato Sono presenti dei software che si occupano del disegno dei primer e consentono di ottimizzare la sequenza affinché non ci siano ripiegamenti all’interno del primer. 57  Taq hot start è una tq polimerasi che non funziona a temp ambiente e quindi è possibile preparare allestimento della reazione fuori dal ghiaccio senza che vada in azione. Allestimento della reazione e componenti Nel momento in cui si allestisce la reazione si parte sempre dai volumi più grandi fino ad arrivare ai volumi più piccoli in modo da lavare i volumi. X ~ ENE ✶ Buffer 10X (o 5X): serve per mantenere le condizioni di pH idonee per la reazione. Può contenere altre componenti tipo il buffer per il caricamento su gel se il prodotto di PCR non serve per altre reazioni enzimatiche. In alcuni casi può contenere già MgCl₂ che influisce sulla specificità della PCR in quanto gli ioni magnesio fungono da cofattori per l’attività della polimerasi. 10X o 5X indica la concentrazione del buffer fornita dalla casa madre. Ad esempio se è 5X allora 1𝛃L ogni 5 𝛃L deve essere di buffer e deve essere quindi diluito 5 volte tanto. In alcuni il buffer può già contenere il loading buffer → in questo modo non sarà poi necessario dover preparare il campione per caricare il gel. Se invece vogliamo effettuare un clonaggio il loading buffer non sarà presente. ✶MgCl₂ (da 1,25 mM a 2,5 mM): serve a modulare la specificità della reazione. Alte concentrazioni favoriscono l’appaiamento aspecifico dei primers. ✷dNTPs (concentrazione finale 200uM per ciascun dNTP): vanno in limitazione si va a saturazione e si ferma la PCR. ✶Primers (0,4 𝛃M): vengono forniti liofilizzati. Devono quindi essere risospesi e si ottiene una ottiene la working solution a 20 𝛃M e queste vengono poi ulteriormente diluite alla concentrazione finale risospensione a una concentrazione più elevata chiamata madre e dopo si procede con la diluizione e si di 0,4 𝛃M. ✶Templato: in caso di DNA plasmidico servono piccole quantità intorno a qualche pg mentre per il DNA ausercit, genomico da 250ng a 1𝛃g TARCET E POCCO RAPPRESENTAT ! Nel DNA genomico che si estrae è possibile avere degli inibitori di diverse proteine, inclusa la Taq. NunimEro JendTa QUINEI SERVE Se la PCR non viene potrebbe essere il caso di diminuire il quantitativo di DNA in modo da diminuire la Quantità Itaggioni quantità di inibitori presenti. In altri casi invece la PCR potrebbe non venire perché il templato è troppo poco → sta all’operatore valutare e procedere di conseguenza. ✶Taq DNA Polimerasi: viene quantificata in attività ovvero in unità in quanto mi interessa sapere quello che funziona e non la sua concentrazione. Solitamente si utilizzano da 0,5 a 1U o 2,5U per reazione (da - 0,5 a 0,25 per risparmiare). Viene fornita come 5U/𝛃L e poi deve essere calcolata facendo la proporzione. L perimetrare Le Stock socrion 1V = Quanta di enzcha Necessarla Si porta poi tutto a volume come H₂O 10hmal el INTOS NEL Ora o 30 mmaz2 ‼ Allestimento in ghiaccio per Taq normali perché a temperatura ambiente quando mettiamo insieme genomico e primers questi tenderanno a ibridarsi e si formano degli aspecifici TAQ POLIMERASI Alcune caratteristiche della Taq polimerasi: 58  ‣Processività: può allungare 1000 bp al minuto. Alcune Taq presentano attività di proofreading ovvero attività esonulcasica 3’→5’. Queste sono più precise ma diminuisce la processività a 500bp/min → l’extension viene quindi calcolata diversamente durante la PCR ovvero il ciclo termico deve essere aggiusta in base alla tag che si utilizza. ! Se vogliamo fare un clonaggio di un gene per avere una proteina specifica usiamo una taq proofreading. La taq proof reading riesce a correggere questi errori in modo da non ottenere una copia errata. Che porterebbe a proteina non corretta. # ‣Errore: 1 ogni 9000 bp Alcune taq riescono a legare al 3’ delle A senza che esse abbiano T complementari. ‣A-tailing: consiste nell’aggiunta di A al 3’ terminate senza bisogno di avere T complementari alla fine dell’estensione. Non è una caratteristica condivisa da tutte le Taq. Questo è utile in caso di clonaggi che sfruttano la A protruding terminale per favorire la ligazione con il vettore con T protruding. LITT/A LCIONS sco dopo 10 stes denaturazione nume ‣Taq hot start: sono Taq che hanno un anticorpo complessato all’enzima nel sito attivo che viene rimosso durante la prima denaturazione. Impedisce che l’enzima inizi la sua azione prima che le condizioni ottimali di annealing siano raggiunte, quindi durante l’assemblaggio della reazione. CICLO UNIVERSALE imm[ 1. DENATURAZIONE INIZIALE (93°C) 2. DENATURAZIONE (93°C): si separano i filamenti del DNA stampo 1mir [ 3. ANNEALING (Tm-5): i primers si appaiano al DNA stampo 4. ESTENSIONE (72°C): L’enzima Taq polimerasi riconosce i siti di innesco / e inizia a polimerizzare il filamento complementare a partire dai primers. La processività di Taq normali è di 1000bp al minuto, per cui il tempo dipende dalla lunghezza del frammento da amplificare 5. ESTENSIONE FINALE (72°C): per completare i filamenti non terminati ‼ L’operatore sceglie sia la temperatura di melting che la durata dell’estensione che dipende dalla lunghezza del frammento. Come è possibile ottimizzare la reazione di PCR? Ossia quando ottengo su eletroforesi anche dei prodotti che non sono quello target. Si agisce inizialmente sulla temperatura. Abbassando la temperatura favorisco l’ibridazione aspecifica affinché i primer si leghino più facilmente se non ho ottenuto prodotto. Se la temperatura è troppo alta i primer non si legano e restano dissociati. Se ottengo aspecifici alzo la temperatura perché voglio amplificare solamente la regione target. ↑ aspecifici - if alto resp OLITINE. per 59  ↑ con Fisedazione aspecifica Se ho aspecifici posso abbassare i magnesio cloruro in quanto si avrebbe una minore schermatura degli ioni che permtte solo alle regioni più * Lanc = Fibrazione special complementari di legarsi. Si può poi agire sul MgCl₂: aumento la quantità se non ottengo nulla in modo da favorire la reazione aspecifica. Se ottengo aspecifici allora diminuisco la quantità. se ho aspecifici diminuisco Anche dNTPs e Taq possono favorire e forzare la reazione in quanto la Taq si scassa e i dNTPs finiscono. 60  APPLICAZIONI DELLA PCR Multiplex PCR Consente di amplificare diverse regioni da un unico campione contemporaneamente. Si utilizzano più coppie di primer che lavorano alla stessa temperatura. È utilizzata per la genotipizzazione high- throughput → per seguire e mappare malattie genetiche, SNP… Si effettua pcr su più regioni contemporaneamente. Sul gel si avranno più bande che rappresentano i vari ampliconi. NESTED PCR Include due amplificazioni successive lavorando con due diverse coppie di primer. La prima coppia è più esterna rispetto al target e avviene una prima reazione. La seconda reazione utilizza come templato il prodotto della prima reazione di PCR e si avvale di una seconda coppia di primer più interna e specifica per l’amplificazione del target. La tecnica consente di arricchire in target di interesse come quando si ha a che fare con DNA degradato o DNA antico che deriva da siti archeologici. Questo serve quando il target è rappresentata molto molto poco nel genoma.utilizzando due coppie di primer una sequenziale all’altra si rimane specifici ma si aumentano il numero di copie. TOUCHDOWN PCR È una strategia che è stata inizialmente introdotta per ottimizzare la PCR e identificare la T a cui funziona in maniera ottimale. È una modificazione del programma pCR in cui la temperatura parte più alta e viene lentamente abbassata. Questo aumenta la specificità andando a determinare minore smear in elettroforesi. Se non sappiamo la giusta Ta per lavorare possiamo partire a una Ta pari alla Tm + 10℃. CPesiTi 10 Cicli) Ad ogni ciclo abbassiamo di un grado la temperatura. Nei primi cicli si è molto specifici e si sfavorisce la formazione di ibridi aspecifici. I Abbassando la temperatura si verifica la formazione degli ibridi più specifici che si possono formare. In questo modo si arricchisce nei cicli a più alta temperatura la presenza del target specifico e si elimina il background degli aspecifici. Ci saranno poi 20 cicli finali alla Tm. => PCR inversa Viene effettuata quando vogliamo togliere gli aspecifici. Scendendo di temperatura di annealing partendo da temp di annealing che sia +10 e mano mano che faccio scendere la temp ottengo pcr sempre più 61 specifiche fino a quando ottengo solo il target di interesse.  SERCE PER DISEGNARE Rispetto a una PCR classica mundisegna i primer verso l’esterno invece che verso l’interno della sequenza nota. Ha l’obiettivo di caratterizzare e dedurre informazioni sulle sequenze fiancheggianti di una sequenza di interesse. Supponiamo di avere un clona Bac che contiene un gene di nostro interesse che non sappiamo dove si trova nel genoma, cosa si trova affianco al gene. Si prende quindi il genoma del Bac si digerisce con un enzima di restrizione e si favorisce la self ligation dei frammenti ottenuti dalla digestione. Sfruttando la sequenza nota del gene di interesse disegno dei primer rivolti verso l’esterno e ottengono degli amplificare che posso sequenziare dai cui dedurre le regioni fiancheggianti al gene di interesse. Esenzialmente si sta cercando di dedurre le regioni che fiancheggiano un gene, quindi si ha che si circolarizza si fa poi la inverse PCR sul plasmide, si crwano dei primer che permettano di replicare una sequenza avente parti del gene all’estremità e cioò che lo fiancheggia all’interno ( il contrario di prima) e quindi posso sequenziare e ottenere cio cioò che fiancheggia il gene per ottenere un primer. PCR allele specifica Si basa sulla possibilità di selezionare mediante PCR l’amplificazione di una certa variante ovvero di diversi alleli presenti a livello di sequenza. È importante conoscere i loci in cui sono presenti le varianti. Studi di sequenziamento hanno identificato regioni ipervariabili noti come SNP ovvero variazioni di singolo nucleotide che si sono poi fissate a livello di popolazione. Questa tecnica consente di caratterizzare e sapere dove si trovano queste posizioni. Si utilizzano dei primer dove al 3’ si aggiunge un nucleotide specifico per solo una delle due varianti. Si verificherà quindi l’estensione solamente se lavoro con un genoma che presenta quella variante. Posso capire se una persona ha allele malato o sano creando un primer che leghi l’allelele sano e non l’allele avente SNP e quindi solo l’allele delle persone sane verrà amplificato e allungato in quanto possono legare il primer e le persone non presentaranno allungamento e amplificazione. Quindi questo è uno strumento diagnostico non per ottenere aplificato. Funziona solo per mutazioni puntiformi. PCR quantitativa REAL THE PCR = GPCR Lo scopo della PCR quantitativa è quella di quantificare il target e questo implica quindi applicazioni nell’ambito della diagnostica molecolare. 62 È importante comprendere bene il funzionamento di una reazione di PCR: il DNA che otteniamo come target presenta un particolare andando lungo i cicli. Nei primi cicli si ha un quantitativo di target molto basso, segue poi una fase lineare, una fase esponenziale e poi la PCR declina nella sua efficienza, diventa nuovamente lineare e va a plateau intorno ai cicli 35-40 in quanto terminano i dNTPs e la Taq si scassa. e Finiscono I PRIITee Principio base dalla PCR quantitativa: la quantità di prodotto amplificato è proporzionale al numero di molecole di DNA stampo presenti nel campione. Questo è vero solamente nella fase esponenziale ed è qui che è possibile quindi essere quantitativi e risalire alla concentrazione di DNA incognita. Per fare questo è necessaria la PCR REAL TIME che consente di vedere non solo il prodotto a 35 cicli caricandolo su gel ma di vederlo progressivamente durante l’amplificazione nei vari cicli. ‼ Nella fase di plateau ottengo invece lo stesso numero di molecole a prescindere al numero di molecole di DNA stampo presenti nel mio campione. ITETTO A Confront # 221TO e LECNICO ANALISI SEMI QUANTITATIVA L'MENUSITA AN di. DECCE BANE CU oreSi La prima applicazione che è stata introdotta era di tipo semi-quantitativo → seguo la reazione di PCR da un determinato numero di cicli e osservo sul gel quando inizia a formarsi il prodotto il base alla presenza o meno della banda di DNA sul gel. Risulta necessario caricare diverse PCR con un un numero di cicli diversi e caricare il prodotto sul a cicli diversi. In alternativa si può fare una PCR con molto volume e dopo ogni tot cicli si estrae una parte e si fa correre su gel. È possibile quindi comprendere che nei diversi campioni la quantità di templato non era uguale. Se si hanno più molecole e quindi più templati da cui fare pcr si ha che anche con un minore numero di cicli durante la fase esponenziale si ha => maggiore quantità di amplificato. REAL TIME PCR Per essere più precisi viene utilizzata la real time PCR che consente di seguire l’evoluzione dell’amplicone in tempo reale direttamente in provetta. È necessaria una strumentazione ottica adeguata che consente di verificare all’interno dei pozzetti la fluorescenza che è proporzionale alla quantità di amplicone che viene prodotto. La fluorescenza viene misurata a ogni ciclo di amplificazione. 63  In questo modo otteniamo per ciascuna reazione, ovvero per ciascun pozzetto, il valore della fluorescenza che presenterà il classico andamento di una reazione di PCR. Il valore viene posto in un grafico come valore di Y rispetto ai diversi cicli e si ottiene un plot per ogni singolo campione. Il Caltre MÚCOMEntro -T Anse a PlareAl a un ritro ITHerE 0)