PCR - Reazione a Catena della Polimerasi (PDF)

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento PCR – Reazione a catena della polimerasi  Maria Luisa Savo Sardaro Polimerase Chain Reaction (PCR) Reazione a catena della polimerasi P...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento PCR – Reazione a catena della polimerasi  Maria Luisa Savo Sardaro Polimerase Chain Reaction (PCR) Reazione a catena della polimerasi PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica atta ad amplificare in provetta frammenti di DNA di cui siano note le due estremità. Inventata da Kerry Mullis nel 1983 (premio Nobel nel 1993), fu resa efficiente nel 1988 grazie all’uso dell’enzima Taq DNA polymerase del batterio Thermus aquaticus, resistente ad alte temperature. Questa tecnica è diventata indispensabile per le tante applicazioni in tutti i possibili ambiti di applicazione della biologia molecolare. PCR - Reazione a catena della polimerasi 2 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Con la PCR è possibile amplificare ed isolare uno specifico segmento di DNA (amplicone) dal genoma di specie viventi o da un DNA artificiale o clonato. Le dimensioni dell’amplicone possono variare da poche decine di paia di basi fino ad un massimo di 15-20 mila paia di basi con polimerasi ad alta efficienza (un cromosoma ha una lunghezza di milioni di paia di basi). L’amplificazione avviene grazie a cicli successivi di sintesi del segmento di DNA, delimitato da due primers o inneschi sintetici (frammenti a singola elica di DNA lunghi ~15-25 basi) complementari alle sue estremità. PCR - Reazione a catena della polimerasi 3 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro La polimerasi Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognuna di esse, ma sempre 5’ 3’ Ricordare: Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’ 3’ a partire da un innesco 3’ libero su untemplato. La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrera’sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 4 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI E’ il mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso. Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE PCR Primer a RNA 5’ 3’ Nuovo filamento 5’ 3’ DNA stampo DNA polimerasi Primer DNA polimerasi oligonucleotidico termostabile Nuovo filamento DNA stampo 5’ 3’ 3’ 5’ Primers a RNA Nuovo filamento 3’ 5’ 3’ 5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 5 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Come funziona la PCR? La sintesi con la polimerasi avviene sulla singola elica tramite un innesco (“primer”) appaiato per complementarietà alla elica che funziona da templato I vari passaggi per sintetizzare in vitro il DNA: 1 passaggio: denaturazione della doppia elica di DNA 2 passaggio: appaiamento dei “primers” sul templato ssDNA 3 passaggio: sintesi ed estenzione della nuova elica a partire dal primer ad opera della Taq-polimerase il ciclo è terminato e ricomincia PCR - Reazione a catena della polimerasi 6 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Thermal cycler, Applied Biosystems PCR - Reazione a catena della polimerasi 7 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Le FASI della PCR Ž Œ Œ DENATURAZIONE: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in Allungamento Denaturazione (~ 95°C) provetta a ~ 92-95°C (~ 72°C)  ANNEALING: La miscela viene raffreddata fino a raggiungere la temperatura Annealing che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni (~ 60°C) dello stampo ad essi complementari Ž ALLUNGAMENTO: La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo alla DNA polimerasi  termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico PCR - Reazione a catena della polimerasi 8 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: – denaturazione (94-95° C), 10-40 sec – annealing (50–65°C), 30-120 sec – polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento PCR - Reazione a catena della polimerasi 9 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro COMPONENTI di una REAZIONE di PCR Mg2 Stampo DNA a doppio filamento + Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che Primers fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Tampone contenente Lo ione Mg2+ è essenziale per il cloruro di magnesio funzionamento dell’enzima Enzima Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus PCR - Reazione a catena della polimerasi 10 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PROGETTAZIONE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer: ü Lunghezza: 16 bp o più à Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano. ü Tm primer 1 ~ Tm primer 2 La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza delprimers Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C ü T annealing ~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usati Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. ü Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers PCR - Reazione a catena della polimerasi 11 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro...PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS 5’ CTTTTGGCATAGACCACATGCCA 5’ TGTTACAAGTGTGGATGGATGCC Tm = 58.6 Tm = 56.1 GGCCAGTGAATTCAGCTCACGCCCCAAATATGCAGCTTCCAGTCCAGTTTCATCCGGCG CGCTGAAGATTTTTTAGAGCATGCTCTATTATGCAGCGTCCGTTGGAATGCTCTTTTTAAC é TCCGCGCGCGCTAAACTTGCGATTTTTTGGGCGCGGCGCTGATATTGGGCGTCTGTTGA AGATGCTCTTAAGTGGCCACAAGGGAGATGGGTCGGGCTAAGGTTTCATATCTTACAATA TAAAGTTGAAGACGATTTGTGGCACCCAGGGGCGGGAGACGCATGCATGCAGCTGCATG ATTGCACCAAGATCCGAAGAGTGGTTTATGGTTTGAGCTTAATTACTGCATGCATGCAAC TTTTTGGTACAACTTTTGGCATAGACCACATGCCATCCCACCTCCCATGCTTTTCATTTTT ACTTGTAAATTTGGATCTATTATATCTTTTGAATCAAAAGTTCAATTTATATTTCGTTTGCGT ATTCTTGTCCCTTGTGTCGAGAGCTTTGAAACAAGCCCACTTTTGAATACGTTTTGACAAA TTCTAAAAACTTAAGTGAGTTTCAACTGCTAAAACTTGATAGAATGAATGAAAAATTTAGC AAGTTTCAAAGACTAAAACTGAAACCCTAAGCCCTTAGCCCTAGATCCTAAGCCCTAAGC CGGAAGTCCTAAACCGTATGCCCCTAACA è : Tm = 83.6 ? Clear Open file Calculate Minimum stem size: 4 Minimum 3’overlap: 2 Optimal annealing temperature is 56.7. 3’ end of oligo 1 pairs to positions 5 to 10 of itself. PCR - Reazione a catena della polimerasi 12 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) 5’ 3’ ATTCGACCT ------------ GCTACTGG 3’ 5’ Primers o innesco 5’ 3’ CGATGACC ATTCGACCT 3’ TAAGCTGGA----------- CGATGACC5’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 13 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS for rev 3314 re v 842 425 Primer FOR 5’- GGACACGTATGCCACAGCCC -3’ Primability of Match = 100% Stability of Match = 82% TGCTAAATTTTCCAGCTAGGTAGCAGGACACGTATGCCACAGCCCTTAAAAGCATATCTGCACATGTCTT 1442 1461 Primer REV 2264 2281 Primability of Match = 100% Stability of Match = 81% CATGCATGATGCTCAAATGCCGCATTGTTGCGCTGTACGCACACATGTATGAATGCATGGCACGGATCAA 3’-GTTGCGCTGTACGCACAC -5’ Primer REV Primability of Match = 71% 5’-GTGTGCGTACAGCGCAAC -3’ Stability of Match = 44% GGGTGGGACCTGGGCGCCCCCGCCGTGAGCGCCTACTGCTCCACCTGGGACGCCGGCAAGCCGTACTCG 1859 1876 PCR - Reazione a catena della polimerasi 14 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 1° ciclo di PCR DNA genomico 5’ 3’ 3’ 5’ Primer reverse Primer forward 5’ 3’ 3’ 5’ DNA genomico PCR - Reazione a catena della polimerasi 15 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 2° ciclo di PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3° ciclo di PCR PCR - Reazione a catena della polimerasi 16 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 5’ regione di interesse 3’ PCR i filamenti vengono separati I°step 3’ 5’ ed i primers si appaiano i filamenti vengono separati complementarietà ed i primers si appaiano III°step al primer 1 5’ 3’ primer 1 5’ 3’ primer 2 3’ 5’ i primers si estendono 3’ 5’ 5’ 3’ complementarietà complementarietà al primer 2 i primers si estendono complementarietà al primer 1 al primer 2 5’ 5’ 3’ 3’ II°step i filamenti vengono separati 3’ 5’ ed i primers si appaiano 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Frammenti desiderati i primers si estendono (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati) 3’ 5’ filamenti di lunghezza omogenea filamenti di E così via lunghezza variabile 5’ 3’ PCR - Reazione a catena della polimerasi 17 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro I primi 4 cicli della PCR in dettaglio Frammento desiderato 3° ciclo 4° ciclo 2° ciclo Amplificazione esponenziale 1° ciclo 35° ciclo DNA stampo Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato 21 =2 22 =4 23 =8 24 =16 235 Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato 0 0 2 8 PCR - Reazione a catena della polimerasi 18 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) [DNA] Log N° cicli Resa teorica: 2n P =(2)n T Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza PCR - Reazione a catena della polimerasi 19 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Schema della PCR Estrazione DNA cDNA Reverse del DNA transcription RNA o RNA dal Amplificazione campione DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi Rivelazione 20 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro 25 o 50 l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50 µl in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5 µl 1X 10 X dNTPs (2mM) 5 µl 200 µM Forward primer (5 pmols/µl) 5 µl 0.5 µM Reverse primer (5 pmols/µl) 5 µl 0.5 µM (25pmols/50µl) DNA genomico stampo 2 µl 1 µg 0.2 µl 1 unità Polimerasi termostabile (5U/µl) H2O (a 50 µl di volume finale) 27.8 µl PCR - Reazione a catena della polimerasi 21 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + PCR - Reazione a catena della polimerasi 22 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C PCR - Reazione a catena della polimerasi 23 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. PCR - Reazione a catena della polimerasi 24 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C PCR - Reazione a catena della polimerasi 25 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 26 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 27 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 28 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 29 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 30 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA PCR - Reazione a catena della polimerasi 31 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli PCR - Reazione a catena della polimerasi 32 di 33  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio PCR - Reazione a catena della polimerasi 33 di 33