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P C R & Sequenziamento MANIPOLAZIONE GENICA Formazione di nuove combinazioni di materiale ereditabile ottenute tramite manipolazione di molecole di acidi nucleici. Definiamo molecole ricombinanti ciò che otteniamo. Possono essere effettuate tra stessi organismi o div...

P C R & Sequenziamento MANIPOLAZIONE GENICA Formazione di nuove combinazioni di materiale ereditabile ottenute tramite manipolazione di molecole di acidi nucleici. Definiamo molecole ricombinanti ciò che otteniamo. Possono essere effettuate tra stessi organismi o diversi. Gli acidi nucleici vengono prodotti in vitro con varie metodologie al di fuori della cellula, inseriti all’interno di vettori come virus, plasmide batterico o altro sistema vettore, ciò ne permette l’incorporazione all’interno di un organismo ospite in cui non si trovano naturalmente e la loro propagazione stabile. Così si possono modificare i genomi di diversi organismi, ottenendo organismi geneticamente modificati. Si possono avere: Tecniche in vitro = ovvero in provetta. Tecniche in vivo Parleremo di TECNICHE IN VITRO che prevedono: Isolamento di frammenti di DNA Modificazione di frammenti di DNA Propagazione di frammenti di DNA mediante il CLONAGGIO, e ottenere cellule che abbiano il DNA che abbiamo coltivato in vitro. Produzione grandi di quantità di frammenti di DNA di interesse. Analisi mediante del sequenziamento del DNA per studiare la sequenza di basi azotate. APPLICAZIONI Queste tecniche sono alla base di molti lavori del biotecnologo. Per catalolgare un ereditabili In agricoltura permette di definire le e non denominazioni e sono depositate con la sequenza del loro genoma. In quanto l’inquinamento porta a variazioni sopratutto sulle cellule somatiche Medicina personalizzata Vedere differenze tra individui e vedere perchè rispondono diversamente a terapie. FATTORI CHE CONDIZIONANO L’ANALISI MOLECOLARE DNA che si desidera analizzare deve potere essere in grandi quantità. Si può prelevare un piccolo campione ma poi va prodotto altro DNA. Sono necessarie tecniche che permettano di purificare il DNA che si vuole analizzare dal DNA genomico dell’ospite. Ad esempio se si vuole analizzare solo un esone specifico, questo va isolato per poi essere analizzato. Sono necessarie tecniche che permettano di evidenziare il DNA che si è introdotto in una cellula procariotica o eucariotica. Sono necessarie tecniche che permettano di recuperare il DNA che si è introdotto in una cellula procariotica o eucariotica. Dunque recuperare un frammento di DNA ricombinante da dei batteri che lo esprimevano. OTTENERE DNA Problema = analizzare la sequenza di un frammento di DNA. Bisogna prima generare DNA, ottenerne grosse quantità di DNA e solo dopo leggerne la sequenza. DNA polimerasi non sono specifiche, replicano tutto. Hanno bisogno però in vitro di : - DNA stampo - Primer sintetico = piccolo frammento di DNA generato in vitro. - Deossiribonucleotidi dNTP= vanno forniti per produrre nuovo DNA grazie alla polimerasi. POLYMERASE CHAIN REACTION Problema = Devo analizzare DNA da un campione biologico di cui dispongo basse quantità. Come posso aumentare la quantità di DNA di mio interesse per procedere con le mie analisi? Bisogna prima separarlo dal genoma e poi generarne grandi quantità. Ciò può essere fatto grazie alla tecnica della PCR, introdotta da K.B. Mullis. La tecnica della PCR è utilizzata in numerose analisi diagnostiche, in quanto può essere anche quantitativa. Mullins comprese che in vivo, il DNA si replica grazie a polimerasi, primer e nucleotidi aggiunti uno dopo l’altro, e che se viene denaturato questa polimerasi continua a lavorare a un nuovo filamento. Questo gli permise di ottenere il Premio Nobel nel 1993. Sono necessari : PRIMERS: 2 oligonucleotidi di 17-30 bp. Ne servono due per riuscire a definire sia l’inizio che la fine della regione da amplificare. Vengono scelti con temperature di annealing simili, questo è il termine inglese per intendere l’appaiamento, ovvero la rinaturazione del DNA. Bisogna farlo riappaiare con i primer. Si intende dunque appaiamento tra primer e DNA stampo. DNA stampo dNTPs DNA polimerasi Mg2+ altrimenti non è favorito il legame fosfodiesterico nel sito catalitico della DNA polimerasi. CALCOLO DELLA TEMPERATURA DI ANNEALING I primer bisogna che vengano sintetizzati. Il filamento inferiore ha 5’ a destra e 3’ a sinistra. I primer devono appaiarsi e vanno da 5’ a 3’, dunque dalla punta della frecccia c’è l’-OH che potrà appaiarsi. Il primer inferiore sarà identico al filamento superiore, e quello superiore identico a quello inferiore. Per poter far lavorare insieme i due primer devono avere la temperatura di annealing simili, che deve essere dunque adatta per far appaiare entrambi i due frammenti di nucleotidi, permettendo di generare due nuove molecole di DNA. Questa temperatura si calcola grazie alla regola di Wallance. Questa regola si può applicare se si hanno pochi nucleotidi. Servono 4 gradi per ogni G e C, e 2 gradi per ogni A e T. Chiaramente per C-G servono più gradi in quanto c’è un legame a idrogeno in più rispetto ad A-T. Ea. La temperatura viene mantenuta grazie all’utilizzo di macchine detti cicloappaiatori. Si può utilizzare una temperatura leggermente inferiore a quella Tm (temperatura di melting, corrisponde alla temperatura in cui ho il 50% di filamenti attaccati allo stampo) per facilitare il distacco. POLIMERASI Mullins ha utilizzato la polimerasi dell’ E.coli ovvero il frammento di Klenow che ha attività esonucleasica, ovvero di correzione di bozza. Non è termostabile. Quando la temperatura viene alzata, l’enzima si denatura. Dunque andava riaggiunto ad ogni ciclo. Esistono organismi con polimerasi resistenti al calore, ad esempio la Taq della Thermus acq., che però non ha la proprietà di essere correttore di bozza, quindi non può essere usata per analisi molto fedeli.  Si può usare invece la Pfu dal Pyrococco Furiousu che vive solitamente in ambienti caldi, che garantisce velocità e percentuale di errori molto bassa. 1 unità: quantità di enzima che incorpora 10 nmoli di dNTPs in una catena di DNA in 30 minuti a 74 gradi. Le polimerasi che mancano dell’attività esonucleasica 3'->5' generalmente hanno maggiore potenzialità di errore delle polimerasi con attività esonucleasica. Il tasso di errore della polimerasi Taq è stato riportato tra 1 x 10^-4 e 2 x 10^-5 errori per paia di basi. La polimerasi Pfu polymerase ha il tasso di errore più basso di circa 1.5 x 10^-6 errori per paia di basi. La slinding clamp in vitro non serve in quanto i frammenti sono più corti e quindi la pol riesce a stare attaccata da sola. Manca anche l’RNA polimerasi per formare il primer, in quanto viene fatto sinteticamente. Inoltre non si replica tutto il replisoma. Le prime molecole prodotte sono leggermente più grandi del confine. Andando poi avanti si ottengono sempre più molecole della dimensione esatta: dal primer forward al primer reverse. Alla fine si ottengono numerose molecole con questo confine, che continuano ad essere denaturare e ricopiate.  Teoricamente la quantità di DNA da ottenere crescerebbe a livello esponenziale. In realtà dopo 30/40 cicli raggiunge un plateau in quanto possono finire i nucleotidi, la DNA polimerasi perde di efficienza, ecc. Posso osservare nella foto il frammento di DNA. Si osserva che alle diverse temperatura si appaia piú o meno il DNA. A 45 è la temperatura ottimale, a temperature diverse si arriva addirittura a non avere completamente appaiamento. - FIUTA ASPEN Alle temperature non ottimali in cui ottengo comunque appaiamento però, posso ottenere sequenze che possono avere alcuni nucleotidi diversi e dunque possono appaiarsi a sequenze non totalmente complementari. Ottengo DNA molto eterogeneo. ↳ APPAIAMENTO UTILIZZI: Ottenere grandi quantità di un frammento di DNA Analisi dell’mRNA Identificazione di mutazioni nei pazienti Diagnostica prenatale Diagnosi di infezioni da parte di virus o batteri Genotipi nella medicina forense Analisi paleontologiche SEQUENZIAMENTO DI DNA Serve a definire la sequenza nucleotidi a leggendo ogni base azotata. Gli esperimenti iniziano negli anni 70’ : Wu & Taylor, 1971 —> PRIMA sequenza di DNA delle estremità coesive dei fagi-lambda. Solo 12 basi. Maxam & Gilbert, 1977 —> sequenziamento del DNA che utilizza reattivi chimici per tagliare il DNA in punti specifici. Sanger, 1977 —> sequenziamento del DNA che si basa sulla terminazione con dideossinucleotidi SEQUENZIAMENTO CON IL METODO DI SANGER Viene utilizzato il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Ha attività polimerasica ma non esonucleasica 5’ 3’. Possiede l’abilità di sintetizzare una copia complementare di un DNA stampo a singolo filamento. Possiede la capacità di usare i dideossinucleotidi come substrati. Ora viene utilizzata la DNA polimerasi del fago T7 “Sequenase”. Che è molto efficace nel Sequenziamento. E’ in grado di polimerizzare un tratto di DNA più lungo rispetto a Klenow. Migliore capacità di incorporare i dideossinucleotidi come substrati. L’innesco della sintesi richiede 1 UNICO primer che solitamente è un oligonucleotide sintetico. Se usassi due inneschi avrei il doppio sequenziamento, e dunque due sequenze sovrapposte. DIDEOSSIRIBONUCLEOTIDI Mancano entrambi gli ossidrili. Questo fa si che non si possa formare un nuovo legame fosfodiesterico. Dunque la reazione inserendo un nucleotide di questo tipo viene interrotta.  Per l’analisi posso avere DNA circolare. Immaginiamo di voler sequenziale la parte verde, bisogna Calore conoscere una parte della sequenza per poter accoppiare il primer, che va a costruire nuove molecole. Può anche essere un DNA lineare. Non si analizza la sequenza di entrambi i filamenti. Disegno il primer del filamento di cui voglio al sequenza, che formerà il filamento complementare. Calore FUNZIONAMENTO Se si fornissero solo i dideossinucleotidi, la sintesi si fermerebbe subito e non si leggerebbe la sequenza. Si usa un mix di dNTP classici a cui sono aggiunti in concentrazioni molto basse, 100 volte meno, in quattro provette ognuna con un ddNTP diverso. Essendo rari ma presenti, a volte la polimerasi li utilizza. Ottengo così molecole che vengono sintetizzate con nucleotidi normali, ma poi a volte vengono aggiunti ddNTP e dunque si blocca la reazione perchè manca l’ossidrile in 3’. Ciò vale per ogni nucleotide. Possono quindi essere analizzati i frammenti di DNA. Si legge la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer, * indica il primer (lungo 15 nucleotidi) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo. Se si mettessero due primer quindi si capisce bene che ci sarebbero due sequenze diverse per entrambe le direzioni e non si capirebbe un cazzo.  ELETTROFEROGRAMMA Si utilizzano dei FLUOROCROMI oggi invece che dideossinucleotidi. I Fluorocromi devono: avere una elevata assorbanza alla frequenza della luce emessa dal laser utilizzato avere un picco di emissione a lunghezze d’onda diverse tra le diverse basi indurre la stessa variazione di mobilità elettroforetica Vengono dunque eccitate le molecole e lo strumento lo rileva. Leggo il DNA di nuova sintesi. Ogni picco rappresenta una base letta. PRIMER voglio leggere M- GGCATGACC (( GTA CTGG µ Regioni che non vengono lette PRIMER : Termina con GGC ↓ È sullo stesso filamento che ' leggo , fornisce l' - monte, prima OH libero, si trova a della sequenza da leggere. SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI È stato diviso il genoma in vari frammenti che sono stati uniti in DNA a sequenza nota. Questa corrisponderà agli inneschi di primer. Questa tecnica è detta SHOTGUN SEQUENCING. In base alla sequenza delle estremità si è cercato di capire come si potessero riallineare ricostruendo così il genoma andando a ricercare le sequenze identiche. Si inizia così a leggere la sequenza utilizzando i primer noti, e trovando una piccola sequenza alla volta, attraverso quello che è detto PRIMER WALKING. Conoscendo la terminazione di una sequenza posso generare l’innesco successivo.  Clonaggio del DNA Ricombinante VETTORI DI CLONAGGIO = molecole circolari con cui possiamo far entrare DNA all’interno dei batteri, i quali possono essere usati come bioreattori per produrre grande quantità di materiale genetico. Se c’è un’origine di replicazione infatti la molecola verrà clonata assieme a quella del batterio. Si dice clonaggio, perchè si producono cloni di batteri uguali per produrre grandi quantità di una specifica molecola. CARATTERISTICHE : Basso peso molecolare (3-5k bp) Possibilità di replicare nella cellula ospite Presenza di siti unici (tagliati una sola volta, per non generare molti frammenti che si uniscano casualemente) per un ampio numero di enzimi di restrizione possibilmente all’interno di un gene che conferisca un fenotipo facilmente identificabile Capacità di conferire all’ospite un fenotipo facilmente selezionabile BASSO PESO MOLECOLARE Il plasmide è più semplice da manipolare se a basso peso molecolare perché non va soggetto a frammentazione meccanica casuale durante la preparazione e facilmente estraibile dalla cellula ospite. Una volta assolto il suo compito infatti viene più facilmente purificato se piccolo rispetto al genoma batterico. Solitamente presente in copie multiple per ottenere grandi quantità da ogni preparazione. Riduce la probabilità che il plasmide presenti più di un sito di riconoscimento per un singolo enzima di restrizione. ORIGINE DI REPLICAZIONE Devono replicare all’interno della cellula ospite in quanto quest’ultima si deve comportare da bioreattore. Lo spettro d’ospite di un plasmide è determinato dalla sua regione ori (origine della replicazione). Nei plasmidi non si usa OriC, si usa Col E1, che può replicare solo in batteri enterici come appunto Escherichia Coli. I geni per le funzioni replicative codificate dal plasmide sono generalmente posti vicino alla sequenza ori con la quale le proteine codificate devono interagire, questa è una regione che non va modificata, se no non replica più il DNA. Come lavora Col E1? Il numero di copie di un plasmide per cellula è determinato dai meccanismi che regolano l’inizio della replicazione. Vi è specificità di specie, in questo caso i batteri enterici. 1. Regolazione tramite RNA antisenso I plasmidi in uso contengono una regione ori derivata dal plasmide Col E1 ed il loro numero di copie è regolato da un RNA antisenso. L’RNA polimerasi è in grado di copiare il DNA in un RNA, ovvero una molecola i cui nucleotidi sono ribonucleotidi e utilizza U al posto di T ed è in grado di copiare un singolo filamento senza l’uso di primer. La regione di Col E1 da mantenere è di circa 500 paia di basi. La trascrizione può avvenire in entrambe le direzioni, a differenza del filamento usato come stampo. Quindi RNA II sarà una copia del filamento superiore, dunque complementare al filamento inferiore. Quando l’RNA polimerasi poi fa il suo lavoro, otterrò RNA I, che sarà parzialmente complementare a RNA II. Inizia ad essere trascritto per primo RNA II, che si prepara a fare l’innesco per la DNA polimerasi, interviene prima però una RNAasi degradarlo in parte e generare un -OH 3’, per richiamare DNApolI e DNApolII. Si genera così una nuova molecola di DNA, vengono pian piano prodotte numerose molecole di episoma. Deve esserci un feedback negativo a un certo punto per evitare di ingolfare la cellula. Man mano che è prodotto l’RNA I, in parte complementare a RNA II, si accoppia a questo, viene richiamata una proteina Rop, che impedisce di continuare la replicazione. In OriC invece si bassa tutto sullo stato di metilazione. Quando si replica il filamento di nuova sintesi non è metilato, dunque viene sequestrata la molecola di DNA metilato, intanto si divide la cellula. I biotech invece usano questa Col E1 per ottenere varie copie e che si autoregoli. 2. Regolazione tramite interazione delle sequenze di inizio della replicazione con proteine specifiche Divisione Plasmidi durante il Ciclo Cellulare I plasmidi sono in grado di mantenersi stabilmente all’interno dei loro ospiti, grazie alla funzione par che permette la corretta distribuzione delle copie alle cellule figlie al momento della divisione cellulare. Ci sono queste regioni ParC che reclutano ParM. ParM- ATP poi segrega il genoma nelle sue cellule figlie grazie alla costituzioni di strutture allungate simili ai microtubuli. ParC aiuta il riconoscimento da parte di queste proteine per far segregare il DNA, assicurandoci che le cellule figlie abbiano entrambe almeno una copia del DNA ricombinante. SITI UNICI DI RESTRIZIONE Per inserire il gene di interesse è necessario aprire il plasmide. Se il vettore contiene più di un sito per un particolare enzima si otterranno vari frammenti non facilmente ricucibili. Se i siti unici sono all’interno di un gene che conferisce un fenotipo facilmente identificabile, il gene di interesse inserito all’interno lo spezzerà inibendo l’enzima e cambiando il fenotipo. Le cellule che contengono il plasmide con il gene di interesse possono venire individuate con una facile tecnica. Vengono usati degli enzimi di restrizione che taglino almeno ogni 6 nucleotidi, per evitare di ottenere frammenti eccessivamente piccoli che renderebbero complicato ricostruire il plasmide in maniera corretta. Secondo la probabilità ci dovrebbe essere un solo sito dalle 3 alle 5 kbp. SELEZIONE La trasformazione dei batteri con DNA esogeno non è mai al 100%. E’ necessario selezionare le cellule che si sono trasformate ed hanno all’interno il plasmide di interesse, questo è possibile grazie a un gene che permette il riconoscimento. Si possono fare morire tutte le cellule che non hanno il DNA, e far sopravvivere le altre. La resistenza ad un antibiotico è un fenotipo facilmente individuabile andando proprio ad uccidere le cellule senza DNA esogeno mettendole in presenza dell’antibiotico. Dunque ho il DNA da riprodurre. Attraverso taglio, legazione ecc. ottengo DNA ricombinante. Viene favorito l’ingresso all’interno dei batteri. Non ho efficienza del 100%, quindi ne ho con e senza. All’interno del plasmide c’è anche un piccolo gene che conferisce resistenza agli antibiotici. Mettendo i batteri dunque in presenza di antibiotici, rimarranno in vita solo quelli ricombinanti che hanno ottenuto la resistenza, mentre gli altri muoiono. GENI DI RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI Il capostipite per i batteri con resistenza agli antibiotici è il plasmide pBR322, che ottiene resistenza all’ampicillina e alla tetraciclina. Nei primi anni 80’ viene così studiato e usato questo plasmide. Vengono usati tre siti di restrizione in laboratorio. Viene così inserito un inserto. All’interno del gene della tetraciclina si ha BamHI mentre nell’ ampicillina PSTI. Per riconoscere i batteri posso ad esempio metterli in presenza di ampicillina, perchè ne ho conservato il gene per la resistenza. Si può fare anche in presenza di tetraciclina in base al taglio. In questi anni non era ancora utilizzata la PCR. Il pBluescript è oggi molto utilizzato. Ha una serie di siti differenti, viene infatti detto a siti multipli di clonaggio MCS o polylinker. È un vettore con 3000bp circa, in colE1 e con resistenza all’ampicillina. Si possono selezionare i batteri con DNA ricombinante grazie a un fenotipo facilmente riconoscibile nei batteri. I siti multipli di clonaggio si trovano all’interno del gene LacZ. Grazie a questo può dare fenotipo blu o bianco. Per facilitare il clonaggio è stata creata una regione specifica con molti siti unici di clonaggio detta Multiple Cloning Site (MCS) o polylinker. Viene inserito il Multiple Cloning Site (MCS) o polylinker all’interno della sequenza del gene LacZ’ che contiene il promotore e produce il peptide a della b-galattosidasi. La cellula ospite esprime l’altro peptide della b- galattosidasi. Pertanto con il vettore si genera una b- galattosidasi funzionale e i batteri sono in grado di metabolizzare X-Gal (5-bromo-4-cloro-3indolil-b-D- galattopiranoside) e produrre un derivato indolico di colore blu. Consideriamo un enzima intatto, se è in batteri che producono il peptidico e beta, in presenza di X-Gal le colonie sono blu. Se è stato fatto il clonaggio, si spezza il gene LacZ, ho DNA ricombinante e anche fornendo X-Gal otterrò colonie bianche.  Batteri modificati con plasmide ricombinante, efficienza di trasformazione bassa. Alcune cellule hanno plasmide ricombinato, altre non ricombinato, altre senza plasmide direttamente. Vengono messi in un terreno con ampicillina e X-Gal. La maggior parte dei batteri, i non trasformati, muoiono. Altri formano colonie blu, con il plasmide non ricombinato. Altri non possono metabolizzare X-Gal perchè si è spezzato il gene LacZ a causa della ricombinazione e dunque appaiono bianche. LIGAZIONE L’enzima DNA ligasi fa si di ricostruire il legame fosfodiesterico. In laboratorio si usano: DNA ligasi di E. coli richiede NAD+ come cofattore DNA ligasi del fago T4 richiede ATP come cofattore Uniscono 2 frammenti di cui 1 ha la terminazione 3’-OH mentre l’altro ha la terminazione 5’-fosfato. La reazione di legame avviene in 2 fasi successive ed é mediata da un complesso enzima-AMP, si forma un intermedio. Vi è una lisina nel sito catalitico dell’enzima in grado di legarsi ad AMP che viene donato da ATP/NAD. L’enzima genera il legame ad alta energia e trasferisce l’AMP sul fosfato, avviene uno spostamento delle cariche. È il fosfato che può così essere attaccato dall’ossigeno per ricostituire il legame fosfodiesterico. Esempio Si formano estremità protrudenti in 5’ come sticky ends. Le sticky ends delle due molecole in soluzione possono appaiarsi. Vengono messe in presenza di ligasi e ATP, così che si formi la molecola ricombinante. Non si possono mettere quantità casuali di inserto e di vettore, ma vanno messi per facilitare questa reazione. I ricercatori hanno scoperto che il rapporto molare è di 1:6 = Rapporto molare vettore:inserto di 1:6 Ogni nucleotide ha un peso molecolare medio di 330 dalton Plasmide PM= 3000*2*330 = 1980000 Dalton Inserto PM= 1500*2*330 = 990000 Dalton Moli plasmide in 100ng: 100/1980000 = 0.05pmoli Per avere un rapporto 1:6 mi servono 6*0,05 = 0.30 pmoli di frammento. Quanti ng di frammento userò per la ligazione? 0.30*990000 = 297ng T4 DNA LIGASI La temperatura ottimale per le reazioni con T4 DNA ligasi sarebbe 37°C, ma in tali condizioni l’appaiamento tra le basi delle estremità coesive (mediante legami idrogeno) può essere alquanto instabile. Si è pertanto trovato un compromesso tra il mantenimento dell’appaiamento tra le estremità coesive e la attività enzimatica, in cui l’enzima possa comunque lavorare bene dunque. Prove sperimentali lo hanno definito intorno ai 16°C. Si lavora poi per circa 24h. Si lavora sui 10/15µL. Il rapporto tra inserto e vettore deve favorire l’inserzione dei frammenti. A basse concentrazioni dell’inserto si favorisce la frequenza delle interazioni tra le estremità della stessa molecola con circolarizzazione. In laboratorio spesso si taglia con un unico enzima di restrizione, poi si fa il clonaggio. Ci sono molte molecole di DNA estraneo e molte molecole di plasmide che può ricircolarizzare. Per eliminare questi geni posso usare ampicillina e pBluescript.  Se si taglia con un unico enzima, il plasmide può ricircolarizzare. Senza il fosfato la ligasi non riesce a cedere AMP. Dunque se tolgo i fosfati tramite fosfatasi alcalina, il vettore non si può richiudere, perchè non c’è un fosfato a cui cedere l’AMP. Solo le molecole in cui è appaiato il frammento di DNA ricombinante al plasmide può richiudersi. Le doppie eliche del DNA ricombinante saranno saldate solo su un filamento, ma ciò non è un problema perché i nick (punti di rottura) verranno richiusi dai sistemi di riparazione della cellula ospite dopo la trasformazione. In questo modo si riduce notevolmente la quantità di molecole che ricircolarizzano. UNIONE FRAMMENTI 5’ O 3’ Con estremità piatte la ligasi ha il fosfato e può richiudere. Solo T4 DNA ligasi è in grado di catalizzare questa reazione non la ligasi di E. coli. Se non ci sono frammenti con terminazioni compatibili perchè si taglia con enzimi diversi si possono ottenere comunque delle estremità piatte, grazie al fatto che se il 5’ è protrudente avrò uno stampo che può essere usato. Se si ha il 3’ protrudente l’estremità non ha uno stampo e la polimerasi non può agire. Bisogna così usare un’attività esonucleasica per eliminare i nucleotidi di troppo. Si mette una polimerasi che elimina per correggere, va così ad eliminare i nucleotidi che protrudono e anche in questo modo ottengo delle estremità piatte. CLONAGGIO DI PRODOTTI DI PCR La Taq polimersi non ad alta fedeltà ha anche un’attività di terminal trasferasi ed aggiunge un singolo dATP all’estremità 3’ dei DNA amplificati. Non produce duque dei filamenti perfettamente piatti. Si può quindi o eliminare le A, oppure usare un T-Vector, ovvero un vettore con una T protrudente che facilita il clonaggio. Si può facilitare il clonaggio inserendo siti di trascrizione. Servono una ventina di nucleotidi per appaiare primer e DNA. Il primer si appaia, riconosce la sequenza se ci si trova alla temperatura di melting. L’importante è che sia ben legato il 3’-OH per l’attacco. La porzione 5’ può essere molto più lunga, anche se non si appaia ed è più lunga. Una strategia usata è fare PCR aggiungendo sequenze in modo che il prodotto abbia queste sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione. TRASFORMAZIONE Si fa entrare DNA esogeno nel batterio, mettendo in condizioni favorevoli. In laboratorio si usano E.Coli gram-, batteri enterici non patogeni. Sono ceppi modificati che possano favorire le reazioni di clonaggio. Se si introduce in E. coli DNA esogeno, questo può venire attaccato dai sistemi di restrizione attivi nella cellula ospite. La modificazione mediante metilazione di specifiche C ed A protegge dall’attacco delle endonucleasi che fanno parte dello stesso sistema R-M. Il DNA di mammifero e di molte specie batteriche è ricco di basi metilate, viceversa il DNA estratto da lievito e Drosophila ha un grado di metilazione molto basso. F’=contengono l’episoma che fornisce pili per infezione con M13, mutazione lacIqZDM15 che fornisce la complementazione del gene della b-galattosidasi gyrA= mutazione alla DNA girasi che rende resistente all’acido nalidixico hsdR= deficienti per la EcoK endonucleasi pertanto il DNA clonato non viene digerito da endonucleasi endogene recA= difettivo alla ricombinazione lacIq= espressione del repressore Lac 10 volte superiore permette una più stretta repressione delle proteine tossiche traD =mutazione impedisce che F venga trasferito o che mobilizzi altri plasmidi dam-, dcm-=mutanti negli enzimi della metilazione  In natura la trasformazione avviene ad esempio: muore un batterio, si formano frammenti e questi entrano in una cellula ospite. Mande & Higa 1970: trattamento con CaCl2 di cellule di E. coli le rende in grado di assorbire il DNA estratto dal batteriofago lambda. Cohen 1972: trattamento con CaCl2 di cellule di E. coli permette l’ingresso di DNA plasmidico. Trova concentrazioni di Calcio che favoriscano effettivamente. Tali studi hanno dimostrato che l’interazione tra DNA plasmidico e cellule batteriche permette la trasformazione se sono presenti ioni calcio a temperature comprese tra 0 e 5°C e se seguita da uno shock termico a 37-45°C che non uccida i batteri, per pochi secondi. Si aprono momentaneamente dei pori nella parete che permettono al DNA di entrare. E’ importante fare crescere le cellule di E.coli e raccoglierle quando sono in crescita logaritmica. Si rendono competenti a ricevere DNA plasmidico esogeno risospendendole in una soluzione 50mM di CaCl2 a 0°C ed ad una densità di 10^10 cellule per millilitro, dunque tenute molto concentrate. Vengono poi versate su agar e antibiotico. Essendo carico negativamente il DNA, il calcio neutralizza le cariche e permette di avvicinarsi alla parete dei batteri. Col cambio di temperatura si aprono dei micro pori e il DNA entra. Le cellule trasformate vengono selezionate in una piastra contenente l’opportuno antibiotico che permette la crescita solo delle cellule che si sono trasformate con il plasmide per esprime il gene di resistenza all’antibiotico. ELETTROPORAZIONE Una seconda tecnica semplice e rapida per inserire plasmidi all’interno di batteri. Zimmerman & Vienken 1983: impulsi elettrici ad alto voltaggio inducono la fusione tra membrane plasmatiche. Cellule sottoposte a tale stimolazione elettrica possono internalizzare DNA. Parametri importanti, un po’ “extreme”: le cellule vengono tenute a 0°C prima dell’impulso voltaggio alto (2500V) resistenza 200W capacitanza 25µF Mentre con CaCl2 l’efficienza cala con l’aumentare delle dimensioni del DNA (non superiore a 50kb), con l’elettroporazione si possono introdurre fino a dimesioni dell’ordine delle megabasi. Ciò è importante per gli approcci genomici. Cellule con inserto bianche