Tècniques de seqüenciació 2024 PDF

TEMA 6. Tècniques de seqüenciació Genòmica i millora genètica BIBLIOGRAFIA: DECODING GENOMES: From Sequences to Phylodynamics Tanja Stadler, Carsten Magnus, Timothy Vaughan, Joëlle Barido-Sottani, Veronika Bošková,Jana S. Huisman, Jūlija Pečerska. DOI: 10....

TEMA 6. Tècniques de seqüenciació Genòmica i millora genètica BIBLIOGRAFIA: DECODING GENOMES: From Sequences to Phylodynamics Tanja Stadler, Carsten Magnus, Timothy Vaughan, Joëlle Barido-Sottani, Veronika Bošková,Jana S. Huisman, Jūlija Pečerska. DOI: 10.3929/ethz-b-000664449 Genòmica i millora genètica Tema 6. Tècniques de seqüenciació SEQÜENCIACIÓ DEL CODI GENÈTIC Glossari de termes: Motlle (template): fragment de DNA de la mostra biològica que La informació genètica, es seqüenciarà; emmagatzemada en el Encebador, oligonucleòtid (primer): fragment de DNA curt DNA o el RNA com una complementari a (un dels extrems) del DNA motlle. Essencial per seqüència de iniciar la polimerització del DNA i, per tant, la seqüenciació; nucleòtids, actua com Biblioteca (library): una barreja de diferents DNA motlles un model universal per preparats per a la seqüenciació; a tots els organismes, Seqüència: l'ordre dels nucleòtids en un DNA motlle, o gen o codificant els seus trets genoma; Seqüenciació: l'acció de determinar l'ordre dels nucleòtids del únics. DNA motlle; Run: una ronda de funcionament de la màquina de seqüenciació; La seqüenciació el Lectura (read): resultat d’un únic run de seqüenciació: és una procés de lectura seqüència que representa parcial o totalment el DNA motlle, d'aquest codi genètic a sovint encara conté errors; partir de mostres Error de seqüenciació: la diferència entre la seqüència obtinguda biològiques. mitjançant la seqüenciació i la del DNA motlle; Muntatge, ensamblatge (Assembly): el procés de combinar la informació de lectures individuals en la seqüència de la genoma. Altres: amplicó, multiplexar, cluster. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tècniques de seqüenciació  PASSOS PER A LA SEQÜENCIACIÓ Obtenció Obtenció de Seqüenciació del Alineament/muntatge (extracció) fragments de DNA de les seqüències del DNA (o DNA motlle La seqüenciació Les eines RNA) de les petits comença separant i bioinformàtiques poden cèl·lules, Si el DNA o sovint amplificant el alinear les seqüències utilitzant cDNA és massa DNA motlle (per PCR) obtingudes amb la mètodes llarg per a la per reforçar el senyal seqüència completa químics per seqüenciació, per a la detecció, ja (genoma de referència) trencar les s'amplifica (per que els mètodes de de la nostra mostra membranes exemple, 1a i 2a generació biològica. Tots els cel·lulars i la mitjançant requereixen múltiples mètodes de seqüenciació centrifugació PCR) o es talla còpies de cada DNA cometen errors i les eines per separar en fragments motlle per a una bioinformàtiques el material més petits seqüenciació precisa. pretenen corregir-los. genètic. mitjançant Moltes de les Actualment, distingim El RNA sovint mètodes com tres generacions de tecnologies de ha de ser la sonicació o tècniques de seqüenciació només retrotranscrit els enzims de seqüenciació. Cadascun produeixen lectures a cDNA (més restricció, es basa en principis breus o fragments de estable). creant DNA lleugerament diferents les seqüències Ha de ser de motlles aptes biològiques. per detectar el senyal bona qualitat per a la dels nucleòtids seqüenciació. individuals. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació CONCEPTES A REPASSAR DE BMEBT - La tècnica de la PCR - La tecnologia del DNA recombinant - Les tècniques NGS (classe de Núria Escudero) Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació CONCEPTES A REPASSAR DE BMEBT - L’estructura i polimerització del DNA = unió de nucleòtids Enllaç fosfodièster, covalent Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació CONCEPTES A REPASSAR DE BMEBT - L’estructura i polimerització del DNA = unió de nucleòtids Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  HISTÒRIA DE LA SEQÜENCIACIÓ DEL DNA 1a generació Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació PRIMERA GENERACIÓ: SEQÜENCIACIÓ SANGER És la que té una menor taxa d’error. Seqüencia fragments (amplicons) de màxim 1000 nucleòtids (= parells de bases, bp). Encara s’utilitza, per: - Seqüenciar 1 o pocs gens - Confirmar seqüències obtingudes per alters mètodes Es necessita amplificar el DNA: - En bacteris - Per PCR Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació PRIMERA GENERACIÓ: SEQÜENCIACIÓ SANGER Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  HISTÒRIA DE LA SEQÜENCIACIÓ DEL DNA 1a generació 2a i 3a generació (Next Generation Sequencing, NGS) Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació SEGONA GENERACIÓ: NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS) També anomenats mètodes d’alt rendiment (high-throughput methods), comparat amb Sanger: Seqüencien més ràpid Menor cost per nuclèotid. Permet “multiplexar”: les mostres de DNA de diferents individus es poden barrejar durant una seqüenciació. Per distingir quina seqüència prové de quin individu, les mostres de DNA tenen un codi de barres amb un fragment de DNA curt i conegut que s’afegeix abans de barrejar-los. Comenten més errors (per això els amplicons han de ser més curts) S'han llançat al mercat quatre plataformes NGS: SOLiD (d’Applied Biosystems/Thermo Fisher, descatalogat), Ion Torrent de Thermo Fisher, 454 de Roche (descatalogat), i HiSeq/MiSeq/...d'Illumina, la tecnologia NGS més extesa. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació SEGONA GENERACIÓ (NGS): ILLUMINA (HiSeq/MiSeq…) La seqüenciació es realitza per síntesi (= amplificació per PCR) mitjançant nucleòtids marcats amb diferents fluoròfors (2 a 4) que inhibeixen temporalment la síntesi del DNA. Els fragments de DNA motlle es separen i s'amplifiquen utilitzant el suport sòlid d’un “xip” cobert amb primers. Seqüencia fragments (amplicons) curts, de màxim 300 nucleòtids (= parells de bases, bp). Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació SEGONA GENERACIÓ (NGS): ILLUMINA (HiSeq/MiSeq…) També anomenat “flow cell” https://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8E Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació SEGONA GENERACIÓ (NGS): ILLUMINA (HiSeq/MiSeq…) S’utilitza per: En un organisme: Seqüenciar genomes sencers (inclús de cèl.lules individuals) Seqüenciar exomes (únicament exons = regions codificants del DNA) Seqüenciar transcriptomes (RNA-Seq) Seqüenciar epigenomes En mostres complexes/conjunts d’organismes: Seqüenciar metagenomes ( la seqüenciació de l'ADN ambiental (mostres de sòl, aigua o intestí) permet identificar i quantificar espècies microbianes sense necessitat de cultiu En estudis de: - variabilitat genètica (detecció de SNPs, insercions i delecions i per tant identificació de marcadors genètics) associats a malalties, característiques fenotípiques... - transcriptòmica. - Aplicats a l’anàlisi de malalties (infecciones o no), estudis de selecció genètica i millora en agricultura. - modificacions epigenètiques, com la metilació del DNA, que afecta l'expressió gènica sense canviar la seqüència de nucleòtids Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació TERCERA GENERACIÓ (NGS): SEQÜENCIACIÓ D’UNA SOLA MOLÈCULA (SINGLE MOLECULE SEQUENCING) Tecnologia es coneix també com a Single Molecule Real-Time Sequencing (SMRT) o seqüenciació en temps real de molècula única. La seqüenciació no requereix amplificació Es poden seqüenciar molècules úniques La taxa d’error és més alta que la segona generació (està millorant) Seqüencia fragments llargs (30.000 pb = 30 kb) Pot requerir la preparació de llibreries Permet seqüenciar molts DNA motlles en paral.lel Són mètodes més cars que els de tercera generació (degut als sistemes de detecció d'alta resolució necessaris per aconseguir la resolució d'una molècula única) N’hi ha de dos tipus: Síntesi de cadena (PacBio RS/PacBio Sequel, de Pacific Biosciences) Basada en porus (MinION/GridION/PromethION, Oxford Nanopore) Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  TERCERA GENERACIÓ (NGS): PacBio Les molècules de DNA preparades es col·loquen en petites nanocavitats o pous. Cada pou conté una molècula de DNA i una DNA polimerasa que realitza la síntesi de DNA. Durant la síntesi de la nova cadena de DNA, nucleòtids marcats fluorescentment són incorporats un per un. Quan un nucleòtid s’incorpora a la cadena, la màquina detecta la fluorescència en temps real (diferent de la segona generació) Alta taxa d’error. Es resol circularitzant el DNA motlle →es seqüencia diverses vegades i s’arriba a una seqüència consens Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  TERCERA GENERACIÓ (NGS): PacBio S’utilitza per: Seqüenciar de genomes complexos: Les lectures llargues permeten seqüenciar genomes complexos o repetitius, com ara els genomes de plantes, animals o humans. Anàlisis estructurals de genomes: permet detectar insercions, delecions, inversions i duplicacions, difícils de detectar amb tecnologies de lectures curtes. Seqüenciar metagenomes: les lectures llargues permeten identificar genomes complets de bacteris i altres microorganismes en mostres complexes, Anàlisis d’haplotips i variabilitat al·lèlica: En individus heterozigots, pot diferenciar les dues còpies d’un mateix gen o regió. Seqüenciació de gens complexos i transcripció: És molt útil per seqüenciar gens amb moltes isoformes (splicing alternatiu), ja que permet obtenir la seqüència completa de dels mRNAs sense necessitat de muntatge. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  TERCERA GENERACIÓ (NGS): MinION Les molècules de DNA preparades es col·loquen en pors (biològics o sintètics) inserits en una membrana sintètica. El DNA passa a través del porus gràcies a un enzim ancorat a la membrana Aquests nanopors permeten mesurar els canvis de corrent elèctric quan els nucleòtids passen pel porus, i aquests patrons elèctrics són interpretats com a seqüències de DNA. Fa lectures ultrallargues i en temps real Es capaç de detectar modificacions epigenètiques Permet seqüenciar directament RNA És portàtil Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  TERCERA GENERACIÓ (NGS): MinION S’utilitza per: Seqüenciar de genomes complets Seqüenciar metagenomes Estudis d’epigenomes Anàlisis transcriptòmiques Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació RESUM i COMPARACIÓ DE LES DIFERENTS GENERACIONS Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  RESUM 1. Obtenció de DNA o RNA de bona qualitat. De vegades: retrotrascripció del RNA a cDNA 2. (la majoria de cops) Fragmentació del DNA/RNA 3. Seqüenciació NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) GENERACIÓ PRIMERA SEGONA TERCERA NOM DE LA TÈCNICA Sanger HiSeq, Miseq, d'Illumina PacBio, de Pacific Biosciences MinION/GridION/PromethION d'Oxford Nanopore MIDA AMPLICÓ màx. 1000 pb màx. 300 bp promig 30.000 pb TAXA D'ERROR baixa més alta que 1a generació més alta que 1a i 2a generació CAL AMPLIFICACIÓ sí, per PCR i de Pot ser que no*, però hi ha síntesi Pot ser que no*. No hi ha síntesi de DNA durant la PRÈVIA DEL MATERIAL A vegades en sí, per PCR de DNA durant la seqüenciació seqüenciació SEQÜENCIAR? bacteris ÀCID NUCLEIC DNA (cDNA) DNA (cDNA) DNA (cDNA) DNA, RNA COST/NUCLEÒTID $$ $ $$$ $$$$ sequenciar pocs APLICACIONS gens, confirmar veure ppt veure ppt veure ppt seqüències 4. Alinealment/ Muntatge de seqüències En negreta: nom amb el que es coneixen popularment * si hi ha poc material de partida, pot ser recomanable Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació DESPRÉS DE LA SEQÚENCIACIÓ… CAL ALINEAR LES SEQÜÈNCIES (Individu) o població d’individus que contenen moltes seqüències d’àcids nucleics Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  ALINEAMENT DE SEQÜÈNCIES Obtingudes almenys 2 seqüències volem comparar-les per trobar semblances i diferències. Per fer-ho, hem d'identificar les regions de les seqüències que corresponen a la mateixa posició en el genoma per a cada seqüència individual. El resultat d'aquest procés s'anomena alineament. REPÀS: Columnes: indiquen posició 123456… Files: indiquen les Seqüència 1 diferents seqüències Seqüència 2 Ø I - No coincidència Coincidència Manca de Tipus d’alineaments: (missmatch) (match) nucleòtid (gap) - Pairwise aligments (2 seqüències) - Multiple sequence aligments (més de dues seqüències) Podeu alinear seqüències de: - DNA - RNA (menys freqüent) - Proteïnes Recordeu: a BMEBT heu fet alineament de dues (o més) seqüències amb el programa Ape, però també heu “alineat” la vostra seqüència contra totes les existents a les bases de dades amb el programa BLAST. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació ALINEAMENT DE SEQÜÈNCIES Després d’un NGS per seqüenciar el genoma d’un o més individus, tenim moltes seqüències (lectures) curtes. Reconstruim la seqüència completa del genoma fent el muntatge (assembly) a partir de l’alineament de moltes seqüències. Podem: - No disposar d’un genoma de referència → l’hem de construir - Disposar d’un genoma de referència (alineem les seqüències amb ell) Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació ALINEAMENT DE SEQÜÈNCIES i MUNTATGE/ASSEMBLATGE DE (PARTS DE) GENOMES Muntatge del Genoma 1. Muntatge Inicial: tenim milers de fragments que hem de muntar formant la seqüència completa del genoma. Hi ha programes bioinformàtics que busquen coincidències entre fragments i tracten de reconstruir el genoma complet. 2. Contigs i Scaffolds: El programari genera contigs (= fragments de DNA assemblats en seqüències contínues). Diversos contigs s’uneixen en estructures més grans anomenades scaffolds, més properes a la seqüència completa. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  ALINEAMENT DE SEQÜÈNCIES I DESPRÉS… Anàlisi i Anotació del Genoma = Identificació de Gens: Un cop assemblat el genoma, necessitem saber quines parts del DNA per a proteïnes = anotar" el genoma, identificant possibles gens i assignant-los funcions basades en similituds amb bases de dades conegudes. En la realitat: Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 1. BASES DE DADES DE GENOMES (Genome browsers): Arabidopsis: https://www.arabidopsis.org/ Meló: https://www.melonomics.net/ Solanàcies: https://solgenomics.sgn.cornell.edu/ Humans: https://genome.ucsc.edu/ … Els podeu buscar a Google cercant: Nom de l’organisme genome browser Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES Mostres complexes amb diferents e`spècies de microorganismes. Objectiu: indetificar-los Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES 1st PCR: Amplicon PCR PCR que amplifica la regió V3 i V4 de cadascuna de les mostres que volem analitzar Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES PCR que marca amb un “codi de barres” únic cada mostra que volem analitzar. Un cop marcades, es poden barrejar 33 2nd PCR: Index PCR 34 25 35 26 36 17 27 37 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 4 14 24 5 15 6 16 7 8 Cleaning of the PCR products Validation by Bioanalyzer Quantification, normalization and pooling Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació  EXEMPLES 2. CONSTRUCCIÓ DE LLIBRERIES I ANÀLISIS METAGENÒMIQUES MiSeq 2x250 pair-end READS AMPLICON1 - 450 bp Anàlisi bioinformàtica: qualitat de les luctures o reads, reads alineats amb els genomes de referència/seqüencies 16S conegudes dels diferents tipus de bacteris (gènere, espècie) RESULTAT: identificació de les espècies de bacteris presents en la nostra mostra complexa. Aquest mateix protocol s’utilitza per analitzar diferents amplicons de diferents individus. Per exemple: amplicons relacionats amb malalties humanes analitzades en un grup de persones. Genòmica i millora genètica Tema 6. Tema 6. Tècniques Tècniques de de seqüenciació seqüenciació