Tema 6. Técnicas de detección de la variación genética PDF

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Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián Tema 6. Técnicas de detección de la variación genética Recordar que en el tema 6 describimos diversas alternativas para poder detectar variaciones genéticas. Comenzamos con hibridaciones citofluorescentes, donde, mediante el uso de sondas específicas, era posible identificar en el núcleo la presencia de aneuploidías o reorganizaciones cromosómicas. Luego avanzamos hacia la genómica comparativa, utilizando técnicas como el microarray, en las que se mezclaba ADN del paciente con ADN de referencia para detectar pérdidas o ganancias de bloques de ADN. También discutimos sobre la PCR, empezando por su forma convencional y abordando modificaciones como la PCR en tiempo real o cuantitativa, que permiten una detección más precisa y cuantificación de los resultados. Finalmente, pasamos a la secuenciación, comenzando con la técnica de Sanger, desarrollada hace algunos años por un investigador. La clave de esta se basa en modificar algunos nucleótidos en la posición 3', que carecen de un grupo hidroxilo. Si estos nucleótidos se incorporan durante la síntesis del ADN, esta se detiene. Actualmente, estos nucleótidos modificados llevan fluoróforos que emiten un color determinado según la base: adenina, guanina, citosina o timina, lo que permite identificar la secuencia de ADN de manera precisa. En la imagen podemos ver el Instituto Sanger, conocido por desarrollar la tecnología que lleva su nombre y que fue fundamental en el Proyecto Genoma Humano. Este proyecto, que involucró a múltiples países y requirió una enorme inversión de tiempo y recursos, marcó un hito en la ciencia. Hoy en día, las plataformas de secuenciación han avanzado significativamente, ocupando mucho menos espacio y permitiendo secuenciar varios genomas en paralelo. Esto contrasta con el pasado, cuando era necesario usar numerosas plataformas para secuenciar un único genoma. La clave de este avance radica en la paralelización, es decir, la capacidad de leer múltiples secuencias de ADN simultáneamente (en paralelo). Este progreso ha sido posible gracias a la nanotecnología, que ha transformado la eficiencia de estos procesos. Además, los costos han disminuido considerablemente, ya no son 1000 euros por genoma. Actualmente, secuenciar un genoma humano cuesta entre 600 y 800 euros, lo que lo hace mucho más accesible. En algunos casos, esta tecnología ya tiene aplicaciones en biomedicina, un tema que abordaremos más adelante (en el tema siguiente). El gran salto tecnológico, como mencionamos, se basa en la paralelización. Este proceso comienza con reacciones de extensión de ADN en el laboratorio, seguidas de la purificación de los productos de extensión y su posterior carga en sistemas de electroforesis capilar para realizar la secuenciación. 1 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián En estos equipos, los procesos se realizan de manera simultánea, lo que no solo permite incrementar la cantidad de lecturas en paralelo, sino que también agiliza el procedimiento al requerir menos intervención manual de los técnicos, ya que está altamente automatizado. 1. Proceso de secuenciación masiva de 2ª generación ¿Cómo funcionan estos equipos? Para secuenciar un genoma, supongamos un genoma humano, hay que llevar a cabo una serie de pasos, preparar el ADN para secuenciar en nuestra plataforma. El primer punto de partida sería construir la librería (para obtener ADN genómico), donde normalmente se usa una muestra de sangre periférica para obtener ADN lo más puro posible, de cara a determinar variantes en línea germinal. Si quisiéramos secuenciar un genoma de un tejido concreto, para llegar a variantes a nivel somático, se tendría que aislar ADN a partir de células de ese tejido concretamente y posteriormente secuenciar. 2 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián A partir de la muestra de ADN, el primer paso técnico es el fragmentado. Este proceso consiste en dividir las largas moléculas de ADN, que representan los cromosomas, en fragmentos más pequeños de manera controlada. Esto se debe a limitaciones técnicas de los equipos actuales. En teoría, lo ideal sería poder aplicar una tecnología, que nos permitiera leer una molécula de ADN completa, desde un extremo del cromosoma (el telómero) hasta el otro extremo. Recordemos que los cromosomas nucleares son estructuras lineales con extremos llamados telómeros, mientras que el ADN mitocondrial es circular y bicatenario. Si fuera posible leer un cromosoma completo de extremo a extremo, podríamos identificar con precisión las combinaciones de variantes genéticas heredadas de cada progenitor, un proceso conocido como faseado. Sin embargo, debido a las limitaciones actuales, se trabaja con fragmentos que posteriormente se ensamblan para obtener la secuencia completa. *Faseado= Cómo están localizadas esas variantes en un cromosoma y en el otro cromosoma y qué combinación a nivel genotipo tiene ese individuo. Sin embargo, debido a las limitaciones técnicas actuales, los equipos no pueden leer un cromosoma completo de extremo a extremo. En el futuro, esto será posible, pero por ahora es necesario fragmentar el ADN. Ejemplo del profesor (comparación con lo explicado anteriormente): si no soy capaz de leer un libro entero en un día, puedo repartir los capítulos entre varias personas para que lo completen en el mismo tiempo. De manera similar, aunque lo ideal sería leer el ADN completo, actualmente lo dividimos en fragmentos y estos se fusionan a unos adaptadores de ADN bicatenario por cada uno de los extremos de los fragmentos. Si yo conozco la secuencia de esos adaptadores, ¿qué podemos hacer? algo que ya aplicamos en la práctica del laboratorio. ¿Cómo se maneja el ADN fragmentado? Primero, se generan fragmentos de ADN a partir de las moléculas completas. A cada extremo de estos fragmentos se les fusionan adaptadores de ADN bicatenario, como cebadores de PCR, pero en este caso no son monocatenarios, sino fragmentos de ADN bicatenario, mediante el uso de ligasas en reacciones in vitro. Estos adaptadores actúan como etiquetas conocidas y permiten manipular los fragmentos en pasos posteriores. ¿Qué podemos hacer con esas secuencias del genoma que hemos fragmentado y ligado con adaptadores? Tengo todo el genoma unido a los mismos adaptadores de manera que con una sola combinación de cebadores podemos amplificar todo el genoma. Esos fragmentos los tengo unidos a ambos lados con secuencias conocidas. Esos adaptadores están prediseñados, sabemos que secuencia tienen, por lo tanto yo puedo pegar cebadores y amplificar todo el genoma con una sola combinación, una pareja única de cebador. En este paso, los fragmentos unidos a adaptadores (representados en color violeta) corresponden a secuencias de ADN conocidas artificiales que hemos añadido a cada fragmento del genoma. Luego, se realiza una PCR en la que los cebadores 3 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián no están en solución, como ocurre en la PCR convencional que usamos en el laboratorio, sino que están físicamente anclados a un soporte de secuenciación. En este caso, son dos cebadores que están pegados a un soporte de secuenciación. ¿Qué ocurrirá si amplificamos con esos cebadores poniendo ADN molde de esta librería? Que se forman estas especies de “puentes”, y todos los fragmentos que hemos amplificado, que representan a todas las secciones del genoma estarán finalmente fijadas covalentemente a una plataforma de secuenciación. A posteriori llevo esa plataforma al secuenciador, y en el secuenciador se van incorporando nucleótidos por parte de las polimerasas que además están marcados con fluoróforos. Usamos nucleótidos marcados con fluoróforos, y obtendremos finalmente la secuencia que corresponden a cada uno de esos fragmentos del genoma, de manera que ahora las podemos alinear, buscar secuencias idénticas, hacemos un apilamiento o alineamiento de secuencias y obtenemos un consenso (es lo que vemos en la imagen). Tendremos secuencias reales que obtenemos del secuenciador. Algunas de las secciones de esas secuencias se solapan, y de alguna manera tendremos el genoma completo. Obtendremos, a partir del alineamiento de esas secuencias individuales, un consenso de la secuencia del genoma del individuo que estamos secuenciando. La terminología que se emplea es muy interesante, de cara a la resolución que obtenemos cuando secuenciamos un genoma. Por ejemplo, para yo decir que una guanina es una guanina, me estoy basando en diez lecturas que me dicen que ahí hay guaninas. Llevándonos esta idea al símil de leer un libro, no es lo mismo leer un libro una vez que diez veces. La fiabilidad en cuanto a la información que voy a interpretar de ese libro, va a ser mayor si leo el libro diez veces, que si me lo leo solo una vez. En cuanto más leo y repaso esta asignatura (genética humana) y cuanto más leo las diapositivas que suben el profe con más fiabilidad llegaremos al examen. Esta es la misma idea: cuanto más veces leamos una misma posición en las distintas regiones del genoma, mayor será la profundidad de lectura y, por tanto, más fiable será el resultado. Así, podremos confirmar con mayor certeza que, por ejemplo, una guanina efectivamente corresponde a una guanina. Si estoy analizando una muestra de ADN obtenida de sangre periférica para buscar variantes en la línea germinal, y observamos que, siendo organismos diploides, aproximadamente la mitad de las lecturas indican la presencia de una adenina (A) y la otra mitad una guanina (G), podemos concluir que somos heterocigotos en esa posición. NOTA: Recordar que cuando hablamos de líneas germinales nos referimos a lo que hemos heredado de nuestros progenitores. Por ejemplo, si tenemos diez lecturas y somos heterocigotos, esperaríamos que, en promedio, cinco de ellas muestran una base y las otras cinco la base complementaria, siempre que las librerías de ADN se hayan preparado de manera óptima. Este balance refleja la proporción esperada en condiciones ideales para heterocigotos. 4 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián ¿Cuál es la recomendación para fiarnos si es heterocigótico o no un individuo a nivel de línea germinal? Para obtener resultados confiables, es ideal realizar lecturas con una profundidad de al menos 30x (30 veces). De esta manera, podríamos esperar observar un promedio de quince lecturas para una base y quince para la otra. ¿Qué ocurre en el caso de líneas somáticas? Consideremos un ejemplo con una biopsia de un tumor. Imaginemos que estamos analizando ADN extraído de cien células tumorales. Una de esas células, a medida que el tumor ha progresado, ha acumulado una nueva variante genética. Esta variante, que podría haber surgido debido a un error en la replicación por parte de la polimerasa, resulta clave: confiere resistencia a la terapia que el paciente está recibiendo en ese momento. ¿Qué va a ocurrir ahora si el fármaco no es eficaz y no reduce o inhibe el crecimiento de esa única célula, pero de las 99 restantes sí, que antes todas eran iguales, pero a esa ha acumulado una variante que le permite resistir? La terapia inhibirá la proliferación de las 99 células restantes, que siguen siendo sensibles al tratamiento. Sin embargo, la célula que ha acumulado la variante resistente, probablemente en una región clave para la acción del fármaco, comenzará a proliferar sin ser afectada por el tratamiento. En el contexto del cáncer, esto da lugar a lo que se conoce como sublinajes o subclones dentro de la masa tumoral. No todas las células tumorales son idénticas; debido a la rápida división celular, acumulan variantes genéticas, algunas de las cuales pueden conferirles ventajas selectivas (al azar), como la resistencia a la terapia. Esto es similar a lo que ocurre con las bacterias multirresistentes, donde pueden transferir genes de resistencia de manera horizontal, lo que les permite evolucionar mucho más rápidamente sin necesidad de esperar a que se acumulen variantes por replicación. En el cáncer, mientras que algunas células son sensibles a la terapia, otras, que son resistentes, sobreviven y proliferan. Aunque las células sensibles dejan de crecer bajo el tratamiento, las resistentes, inicialmente minoritarias, eventualmente dominarán el tumor. La terapia nos ayuda a reducir esa masa, si algunas de ellas resisten vuelven a proliferar. En términos de tratamiento, esto puede visualizarse como un acordeón: la masa tumoral se reduce cuando las células sensibles mueren, pero las células resistentes, al sobrevivir, aumentan su proliferación con el tiempo. Si quisiéramos detectar esa única célula resistente en un tumor, sabiendo que tiene una mutación que la hace resistente a la terapia, necesitaríamos una estrategia más precisa. Con una profundidad de lectura de 10x o 30x no sería suficiente, porque estamos analizando 100 células, y cada una contiene dos copias de cada cromosoma. Es necesario aumentar la profundidad de lectura para identificar con precisión las variantes minoritarias que confieren resistencia, de modo que podamos adaptar el tratamiento y prevenir la proliferación de células resistentes. Si estamos analizando una muestra de 100 células, con dos copias de cada cromosoma (200 cromosomas en total), y realizamos solo 10 lecturas, la probabilidad de detectar una variante en una célula minoritaria es muy baja. Si el 99% de las lecturas corresponden a células con la variante "sensible" a la terapia y solo una célula tiene la variante resistente, esa variante resistente 5 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián probablemente no se detectará. Las 10 lecturas se distribuirán aleatoriamente entre las 99 células sensibles, y es probable que ninguna de ellas corresponda a la célula resistente. Por lo tanto, para detectar variantes somáticas, no basta con hacer lecturas a la misma profundidad que en la línea germinal. Si estamos buscando una variante en una célula que representa solo el 1% de la población celular (es decir, una de 100), necesitamos aumentar la profundidad de lectura. En lugar de leer el genoma solo 10 o 30 veces, tendríamos que leerlo, por ejemplo, 1000 veces. Esto aumentaría las probabilidades de detectar las variantes en las células minoritarias. Si leemos el genoma 1000 veces, esperamos que al menos 10 de esas lecturas representen la variante de la célula resistente, mientras que las 990 lecturas restantes corresponden a las células sensibles. Cuanto mayor sea la profundidad de lectura, mayor será nuestra capacidad para detectar variantes (resolución) en células minoritarias, lo que equivale a encontrar "una aguja en un pajar". Posible contenido para preguntar en examen: En términos prácticos, si estamos analizando variantes a nivel germinal, con una profundidad de lectura de 30x podemos obtener resultados satisfactorios. Sin embargo, cuando se trata de biopsias tumorales, donde las variantes de interés pueden estar presentes en una proporción muy baja de células, necesitamos una mayor resolución. En estos casos, es fundamental realizar lecturas con mayor profundidad para poder identificar variantes somáticas clave para guiar el tratamiento. Este proceso involucra una amplificación clonal del ADN, seguida de su secuenciación y la interpretación de los datos para identificar variantes relevantes. 6 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián 2. Secuenciación masiva de 2ª generación (Illumina) ¿Cómo ocurre esta secuenciación en equipos de segunda generación? ¿Y por qué se habla en términos de segunda generación? La secuenciación de segunda generación hace referencia a tecnologías que permiten la secuenciación masiva y paralela de ADN, en contraste con la secuenciación Sanger, que se considera de primera generación. En la secuenciación Sanger, el proceso es secuencial y se realiza de forma más individualizada. Por otro lado, en los equipos de segunda generación, la secuenciación se lleva a cabo en paralelo, lo que significa que múltiples fragmentos de ADN se pueden secuenciar simultáneamente. En resumen: - Sanger: 1ª generación. - Secuenciación masiva de ADN: 2ª generación. ¿Cuál es el equipo o la plataforma que principalmente se usan en secuenciación masiva de ADN de segunda generación? Las plataformas más utilizadas en la secuenciación masiva de ADN de segunda generación son las comercializadas por la compañía Illumina, que sigue siendo líder en el mercado, aunque la competencia está comenzando a aumentar, como veremos más adelante. En estos equipos, el proceso de secuenciación ocurre sobre una superficie que contiene cebadores anclados y ADN amplificado. En la imagen que se muestra, se ilustran tres fragmentos diferentes del genoma, cada uno con un adaptador (rojo y azul) en sus extremos. La secuencia de interés (en gris) forma parte de regiones específicas del genoma, como cromosomas 1, 7 y 21. Aunque la imagen muestra solo tres regiones, en la práctica, todo el genoma estará representado, y estas secuencias serán amplificadas y secuenciadas para obtener una cobertura completa. ¿Cómo funciona el equipo de Ilumina? En los equipos de Illumina, el proceso comienza con el anclaje de un cebador específico. Dado que ya conocemos las secuencias de los adaptadores, podemos diseñar un cebador que hibridice con estas secuencias adaptadoras, formando puentes de hidrógeno. Este cebador tiene un extremo 3'OH libre, lo que permite que se inicie la síntesis de ADN. Para ello, se utiliza ADN monocatenario, junto con una cantidad controlada de polimerasa y nucleótidos. De este modo, se logra una síntesis eficiente y controlada, generando las secuencias necesarias para la lectura del genoma. En este proceso, los nucleótidos utilizados están marcados con fluoróforos, pero están bloqueados en el extremo 3’ de manera reversible. Esto significa que, aunque todos los nucleótidos están disponibles, solo se incorpora un nucleótido en cada ciclo de secuenciación. A diferencia de la 7 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián tecnología de Sanger, donde el bloqueo del extremo 3' es permanente debido a la eliminación del grupo hidroxilo, en Illumina el bloqueo es reversible. Cada nucleótido disponible tiene un extremo 3'OH bloqueado, y cuando se incorporan nucleótidos en la secuencia, emite una señal fluorescente que se detecta por una cámara de alta resolución. Esta cámara captura los colores emitidos por cada nucleótido, permitiendo determinar qué base se ha incorporado en cada fragmento amplificado durante la PCR. Este proceso emplea nanotecnología y cámaras altamente calibradas, que permiten leer las señales fluorescentes con precisión. Una vez que se ha leído la fluorescencia y se ha identificado la base incorporada (C, G o T), el siguiente paso es eliminar los fluoróforos. Esto es necesario porque si no se eliminan, los fluoróforos de los nucleótidos que se incorporen posteriormente interferirían con la señal del primer nucleótido. En este proceso, los nucleótidos se incorporan uno por uno, y una vez que se ha detectado la señal de fluorescencia correspondiente a cada base, se elimina la fluorescencia y se desbloquea el extremo 3'OH. A nivel químico, este desbloqueo se logra alterando el pH del tampón, lo que provoca un cambio en los enlaces químicos y hace que el 3'OH se vuelva disponible nuevamente. Cuando el 3'OH está libre, se puede incorporar otro nucleótido y continuar el proceso. Este ciclo se repite: incorporamos un nucleótido, leemos la fluorescencia, eliminamos los fluoróforos y desbloqueamos el extremo 3’OH para permitir la incorporación de un nuevo nucleótido. Una de las razones por las que las plataformas de Illumina siguen siendo líderes en el mercado es su alta fiabilidad en la lectura de datos. Son lecturas de alta fiabilidad porque se va secuenciando despacito (uno a uno), lo que permite asegurar que cada señal de fluorescencia leída sea precisa. Aunque este enfoque requiere más tiempo, la fiabilidad de los resultados obtenidos es muy alta. En el contexto de investigación o diagnóstico, la fiabilidad puede ser más importante que la rapidez. Por ejemplo, en un hospital, los resultados rápidos pueden ser cruciales, lo que podría implicar el uso de tecnologías más rápidas, aunque menos precisas. Sin embargo, en proyectos de investigación, donde la calidad de los datos es fundamental, puede ser más conveniente esperar varios días para obtener resultados más confiables. Entonces a veces en la balanza, el diagnóstico o la investigación, es importante investigar para generar información de cara que luego pueda aplicarse. De forma resumida: - Las librerías se inmovilizan en una superficie sólida y son sometidas a amplificación clonal. - Secuenciación basada en síntesis de ADN. - Requiere ADN molde, ADN polimerasa y nucleótidos marcados con un fluoróforo. - La secuenciación ocurre en millones de pocillos de manera simultánea, obteniendo lecturas cortas (300 pb) pero de muy alta calidad (>99,9% fiabilidad). Son de alta fiabilidad porque leen despacito. - Múltiples plataformas y capacidades de lectura (desde 15 hasta 6.000 Gb por carrera). - Es la compañía de referencia en el mercado actual. 8 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián En conclusión, el genoma humano se publicó en 2003 a raíz de esos resultados la comunidad científica planteó a raíz de ya tener el genoma de referencia secuenciado, acelerar el proceso. Iluminá entonces empezó a trabajar en ello en torno al 2007-2008 y esto supuso tener miles de genomas en base de datos (Ej: GenoMap con miles de genomas a diferencia del único genoma de 2003 que venía de 4 personas solo). Problemas de 2º generación: Fragmentos muy cortos, no llega a más de 100-150 pb en cada evento de lectura (300 pb como mucho) Recordatorio: Sanger, el de 1º generación permitía 1000 pb, por lo que el de 2º generación son lecturas más cortas. Por ejemplo: crear un genoma de 3Gb a base de lecturas pequeñas es como un puzzle de 10.000 piezas en el que puede que te equivoques y tardes mucho. Ya no se trata de obtener la secuencia si no de agilizar, ensamblarlas para montar el mapa, ahí hay un problema de análisis de datos. Ya no es como en Sanger, que obtener la lectura era lo que era complicado, pero ya con secuenciadores de alta potencia se tienen muchas lecturas. Obtener la información no es difícil si no ensamblar. Ejemplo comparativo: antes para ver películas había que ir a buscarlas a tiendas de alquiler con tiempo limitado. Ahora se puede decidir en una gran oferta desde casa. Antes obtener los datos era lo mismo que ver una película; planificarse para sacarla… y ahora hay tanta información, que el problema es seleccionar. PREGUNTA DE CLASE: ¿Todas estas técnicas se usan para analizar variaciones tanto en línea somática como germinal? Con esto ya no hay límites. Se puede aplicar en ambas. Reiteramos que la clave es analizar los datos para no obtenerlos y esto se hace en supercomputadores. Se quiso a partir de aquí obtener lecturas mayores en un solo evento, empezar en un extremo del cromosoma y acabar en el otro (en 1 lectura, obtener todo el cromosoma). No estamos ahí todavía en humanos pero sí en bacterias, la siguiente técnica permite obtener lecturas muy grandes (de varias centenas de Kb). 9 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián 3. Secuenciación masiva de 3ª generación (Oxford Nanopore). - Tecnología basada en el uso de nanoporos anclados a una membrana, a través de los cuales pasa el ADN en estado monocatenario. - La lectura de la secuencia se obtiene directamente de la cadena original de ADN por medición de cambios de voltaje. - Permite leer decenas/centenas de kb en una sola lectura, pero la calidad aún es reducida (99% fiabilidad). - Varias escalas: equipos portátiles (MinION) o equipos de mayor tamaño con los que se pueden secuenciar varios genomas humanos completos (PromethION). Mirar en fotos. - Versatilidad: ADN, ADN metilado, ARN, … - Hay genomas bacterianos de Gram + que son de 2Mb por lo que con esta tecnología en un solo evento de lectura tienen el genoma. - Esta idea en el futuro se llegará a optimizar para cromosomas humanos. PREGUNTA DE CLASE: ¿Esta tecnología está asociada con la IA? Sí, principalmente para agilizar los procesos. Ya no se utiliza para ensamblar (porque hay otras herramientas más potentes), sino para que una vez tengamos el genoma; identificar variantes que predigan, por ejemplo, la respuesta de un paciente ante el tratamiento de un determinado fármaco. Se encarga, por tanto, de la interpretación a posteriori, una vez tengamos el genoma. Funcionamiento de esta 3º generación que surgió en 2016, hay varias plataformas y esta es una de ellas (acompañar explicación de esquema). - Proteína transmembrana (en amarillo), es un canal celular como el que hemos estudiado en prácticas de laboratorio, en la que un gen que codifica un canal hepático que internaliza las estatinas, una proteína que funciona como un canal para transferir de un lado a otro de la membrana. - Hay ciertos poros en bacterias, en los que realmente no es una proteína, sino complejos de múltiples proteínas que actúan como un canal a partir del cual el ADN se transfiere de una célula a otra por conjugación bacteriana (transferir material genético entre bacterias muy resistentes). A esta compañía inglesa se le ocurrió emplear estos poros en membrana, usando complejos proteicos que son capaces de transferir el ADN monocatenario de un extremo a otro de una membrana sintética, no se usan membranas celulares. - Los poros son proteínas que se han modificado, para que la técnica tengo mejor resolución. IMPORTANTE: para que la molécula de ADN pase por el poro este tiene que sufrir cambios conformacionales. 10 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián ¿De qué va a depender el cambio conformacional del poro? Recordamos que la estructura del ADN es Fosfato y desoxirribosa y ahí no hay diferencias. La diferencia se encuentra en las bases nitrogenadas, ACGT (Colores en el esquema) tienen estructuras diferentes y cuando estas moléculas vean las cadenas o esqueleto fosfato desoxirribosa (violeta) - Cuando pasa una A el cambio conformacional es diferente a si pasa cualquier otra base. Estos cambios se ven porque el equipo está conectado a un chip que detecta estos cambios conformacionales en forma de voltaje y va diciendo las bases en tiempo real. Este equipo permite leer moléculas individuales, no se requiere de esa amplificación clonal en 2º generación, que a su vez también era una limitación, porque cuando utilizamos polimerasa para sintetizar ADN estas se confunden. Además, si se confunden y luego se secuencian esas moléculas, los errores técnicos se interpretarán como variante real en el paciente, cuando en realidad es por dicho error. Se lee molécula directamente, no son múltiples copias, es una molécula que atraviesa el poro. Pese a todo lo anteriormente expuesto, Illumina sigue siendo referente en el mercado, porque esta técnica los cambios conformacionales en el poro todavía están mejorando. 99% (una de cada 100 puede estar mal) fiabilidad mientras que Illumina 99,99% (una de cada mil e incluso de 10.000 bases puede estar mal). Estamos en orden de magnitudes distintas que van cambiando. Illumina aunque sean lecturas más cortas, son más fiables. Dependiendo de qué se quiera estudiar se usa una técnica y otra: - Secuenciar genoma bacteriano: usar nanopore porque no se busca variantes puntuales, sino el esqueleto del genoma, por ejemplo. - Buscar variante somática: no usar nanopore, sino Illumina. Porque esta es más resolutiva. PREGUNTA DE CLASE: ¿En cuestión de tiempo, cuál tarda más? Esta última técnica que hemos visto va mucho más rápido. Volvemos a recalcar los dispositivos utilizados: Son portátiles, mientras que los de Illumina deben estar muy bien calibrados en cuanto a temperatura, vibración… Por lo tanto, grandes ventajas respecto a Illumina: lecturas largas y portabilidad hasta en estaciones espaciales. Equipos de 512 poros en los más pequeños, y más poros en los mayores pero mismo funcionamiento, poros que secuencian. 11 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián Destacar que el SmidgION se puede conectar a un iPhone y secuenciar a tiempo real. El CEO de esta empresa puso una gota de sangre y en tiempo real, se fue secuenciado su genoma. Con equipos muy básicos como secuenciador, termociclador, termobloque, vortex, centrifugadora… Se puede secuenciar en cualquier lugar y con un ordenador, los datos se vuelcan en tiempo real. Se comenta que hay empresas que analizan la procedencia del ADN como por ejemplo 23andMe o MyHeritage DNA que mediante frotis bucal dicen de dónde provienen tus genes. El profesor aclara que no sabe exactamente si analizan ADN mitocondrial para ver línea materna y cromosoma Y o van a una array de genotipado (Ej: GSA en el que se analizan 800.000 variantes que son frecuentes y luego se pueden generar arrays, pero con variantes más frecuentes según se trate de población europea, africanos…). Para saber de dónde vienes, no es necesario relacionarlo con la patología, sino con determinados genes que predominan en ciertas poblaciones. Debemos recordar que la población canaria se relaciona mucho con los pueblos del norte de África y eso también se estudia desde el área de genética. Nuestra historia define la frecuencia de nuestros alelos. Nuestros cromosomas están fragmentados porque hay recombinación homóloga. El Cromosoma 1 no puede ser europeo y el 2 africano sino que en cada uno hay bloques con ascendencia local. Recordamos: el cambio de estrategia fue secuenciar ADN sin que fuera necesario sintetizar la cadena complementaria con una polimerasa. Sanger (1ª generación) sí usaba dicha polimerasa, con ADN monocatenario se sintetiza cadena complementaria poniendo fluoróforos. Illumina también hacía lo mismo (ADN monocatenario y polimerasa) mientras que Oxford Nanopore cambia radicalmente eliminando polimerasa e introduciendo los poros. 4. Secuenciación masiva de 3ª generación (PacBio). - Nuevas plataformas de secuenciación mediante unión (Sequencing-by-binding, SBB). - Permite obtener lecturas largas (decenas de kb) y de muy calidad (>99,9%). Al igual que Oxford Nanopore pero calidades incluso peores y las plataformas eran muy grandes y comprar el equipo para secuenciar costaba más de 1 millón mientras que los anteriores (MinIon, PromethIon..) solo llegan a 1000 euros. Casi quiebran, por lo que copiaron lo mejor de Illumina (calidad de lectura) y lo mejor de Oxford Nanopore (lecturas de gran longitud). En 2022 dio soporte al consorcio T2T (Telomere-to-telomere) para secuenciar el 8% del genoma humano que aún se desconocía (regiones telomérica y partes del cromosoma Y). Permitió resolver genoma completo, aunque mayoría fue secuenciado en 2003 había 12 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián regiones repetidas que con Sanger, Illumina y Oxford NanoPore era complicado resolver dichas regiones (ej: puzzle parte del cielo todas iguales y no se saben cómo montarlas, regiones repetidas en genoma complican el ensamblado). IMPORTANTE: usan secuenciación mediante enzimas, pero por unión para ganar en fiabilidad y las librerías se preparan con adaptadores que son circulares. Si estos son fusionados a fragmentos de ADN bicatenario y se desnaturaliza una sección; se genera un círculo covalente y ya no son moléculas con extremos libres. La profundidad de lectura es importante: a más lecturas, más fiabilidad y si ahora tenemos un círculo con la polimeras podemos dar vueltas y pasar por la misma molécula muchas veces, no solo una vez. Se lee la misma en paralelo varias veces. Con esta tecnología se detectan aneuploidías o translocaciones. Ejemplo: cromosomas 1,2 y 3 de cualquier genoma. Si tienes un número de lecturas en un lado de 10x y en otro de 20x significa que aquí hay una aneuploidía, trisomía probablemente, porque tiene el doble de lecturas que en los otros cromosomas, mirando cómo de profunda es la lectura. Otra estrategia: fusiones entre cromosomas, translocaciones, inversiones que se pueden detectar dichos puntos de unión artificiales no esperados. Ejemplo con lecturas con secuencias del cromosomas 2 y salta a las del 7. Esto indica que ha habido una fusión de dos cromosomas para detectar, por ejemplo, translocaciones robertsonianas como el Síndrome de Down familiar y con esto se podría saber exactamente qué nucleótido del cromosoma X está fusionado a qué nucleótido del siguiente cromosoma con secuenciación masiva, a nivel de nucleótidos. 13 Comisión 17 21/11/2024 Comisionista 1: Ana Rosa Rodríguez González Corrector: Victoria Rodríguez González Comisionista 2: Virginia Ramos García Genética Humana Docente: Fabián COMI X 1. Indique cuál o cuáles de las siguientes afirmaciones son ciertas en relación a las técnicas de detección de variación genética en humanos: a) En los arrays de genotipado, la fluorescencia en cada punto del array nos permitirá conocer los genotipos para cada uno de los SNPs interrogados tras un análisis bioinformático. b) La técnica PCR en tiempo real se lleva a cabo empleando los siguientes componentes de reacción: ADN molde, ADN polimerasa termoestable, oligonucleótidos específicos, desoxirribonucleótidos trifosfato, tampón que contenga cloruro de magnesio y agua. c) Los ensayos con sondas TaqMan requieren la adición de dos oligonucleótidos cuyas secuencias son complementarias a cada alelo y que están marcadas con agentes intercalantes. d) La secuenciación de ADN de tercera generación es una técnica basada en el proceso de síntesis de ADN que permite obtener lecturas de hasta i50 pb de longitud. e) Todos son ciertas. 2. Señale cual o cuales de las siguientes sentencias son correctas respecto a la variación genética entre individuos de la población humana. Seleccione una: a) Como promedio, en un individuo existen 4-5 millones de variantes respecto al genoma de referencia. b) Las variantes puntuales (