Techniki biologii molekularnej 2 PDF

Mikromacierz - szklana lub plastikowa płytka z regularnie naniesionymi mikroskopijnej wielkości polami, które zawierają różniące się od siebie sekwencją jednoniciowe cząsteczki DNA - sondy (1 pole/spot = 1 sonda). Do sondy hybrydyzują komplementarne cząsteczki badane Celem eksperymentu mikromacierz...

Mikromacierz - szklana lub plastikowa płytka z regularnie naniesionymi mikroskopijnej wielkości polami, które zawierają różniące się od siebie sekwencją jednoniciowe cząsteczki DNA - sondy (1 pole/spot = 1 sonda). Do sondy hybrydyzują komplementarne cząsteczki badane Celem eksperymentu mikromacierzowego jest zmierzenie obecności i liczebności oznakowanych cząsteczek kwasu nukleinowego w danej próbce biologicznej, która hybrydyzuje do mikromacierzy poprzez utworzenie dupleksów, a następnie zostanie odczytana dzięki znakowaniu Zastosowanie mikromacierzy: - Analiza ekspresji genów - mikromacierze umożliwiają badanie, które geny są aktywne w danym momencie w różnych warunkach (np w zdrowych i chorych komórkach). Używane są w badaniach nad nowotworami, chorobami neurodegeneracyjnymi czy innymi schorzeniami - Diagnostyka molekularna - wykorzystuje się je do identyfikowania specyficznych markerów chorobowych np w onkologii do wykrywania mutacji genowych związanych z nowotworami - Farmakogenomika - mikromacierze mogą pomóc w badanych dotyczących rekacji organizmu na leki, co pozwala na opracowanie bardziej spersonalizowanych terapii - Badania nad mikroRNA - mikromacierze mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji mikroRNA, które mają kluczowe znaczenie w regulacji genów i mogą być związane z różnymi chorobami - Identyfikacja nowych biomarkerów - dzięki mikromacierzy można odkrywać nowe biomarkery, które mogą być użyteczne w diagnostyce lub prognozowaniu przebiegu chorób - Badania nad interakcjami białek - mikromacierze wykorzystywane są również do badania interakcji miedzy różnymi białkami w komórce Schemat badania 1. Przygotowanie sond molekularnych i ich immobilizacja na powierzchni płytki 2. Przygotowanie wyznakowanych próbek DNA przeznaczonych do analizy 3. Hybrydyzacja próbek DNA z sondami mikromacierzy 4. Odczytanie sygnałów uzyskanych z hybrydyzacji 5. Analiza danych Rodzaje podłoży do mikromacierzy - Płytki szklane, na których nadrukowane są sondy - Błony hydrofobowe - Błony nitrocelulowe Do odpłaszczenia płytek macierzy stosuje się złoto, awidynę (białko produkowane w jajowodzie ptaków, gadów i płazów), streptawidynę (tetrametryczne białko którego punkt izoelektryczny jest równy obojętnemu pH, co czyni ją bardziej użyteczną niż awidyna), oraz związki posiadające grupy aminowe, aldehydowe, epoksydowe lub w mikromacierzach białkowych hydrożel. W powierzchniach hydrożelowych fazą rozproszoną jest woda, natomiast fazę formującą mogą stanowić naturalne tworzywa takie jak kolagen, elastyna, fibryna, chizozan albo tworzywa syntetyczne. Stosowanie podłoży tego samego rodzaju jest ważne ze względu na przygotowanie i standaryzację sprzętu do nadruku, hybrydyzacji oraz odczytu Cechy charakterystyczne podłoża: - Sztywne - Podatne na chemiczne modyfikacje powierzchni - Roztwór sondy nie powinien wnikać w podłoże ani defundować w nim Powinien charakteryzować się niską fluorescencją Powinien ulegać modyfikacjom w celu zwiększenia zdolności absorbowania sondy Rodzaje mikromacierzy - DNA - analiza mutacji, genotypowanie, profilowanie ekspresji genów i badanie liczby kopii genów - Białkowe - wykorzystują oddziaływania typu antygen - przeciwciało, białko - białko, białko - kwas nukleinowy, białko - lipid, enzym - substrat - Tkankowe - płytki zawierające od kilkudziesięciu do kilkuset wycinków tkanek różnego typu i pozwalają na diagnostykę markerów molekularnych Mikromacierze białkowe - składają się z białek, fragmentów białek, peptydów lub przeciwnikach unieruchomionych w postaci kratek na miniaturowej płytce. Unieruchomione cząsteczki są wykorzystywane do przeszukania oddziaływań w próbkach nanoszonych ma mikromacierz. Stosując przeciwciała, mikromacierz staje się wysoce wydajnym testem immunoenzymatycznym, stosowanym w diagnostyce klinicznej. Mogą być też przeszukiwane za pomocą substratów w celu wykrycia aktywności enzymatycznych, albo za pomocą DNA, leków lub innych białek aby wykryć ich wiązanie W zależności od zastosowania mikromacierze białkowe dzielimy na: - Wychwytujące - analityczne - oznaczanie białek, jako sondy wykorzystywane przeciwciała, wysoka czułość i swoistość, mogą niespecyficznie wiązać, potrzeba specyficznych białek, wychwytywanie przez antygeny, jeżeli odczytujemy czerwony kolor - połączyły się białka jednej frakcji, a jeżeli odczytami żółty kolor - połączenie białek obu frakcji Badanie zmian genetycznych lub wpływu warunków zewnętrznych Wykorzystywane do pomiarów ilościowych - Odwrotne - odwrotnej fazy - analizy próbek uzyskanych z lizaków, czułe i precyzyjne zastosowanie uzależnione od obecności komercyjnie wyprodukowanych przeciwciał - Czynnościowe - funkcjonalne - analiza białko - białko, sondami są oczyszczone białka, fluorescencja w postaci zielonego punktu na mikromacierzu po połączeniu się białek Identyfikacja np enzymów - reakcja białko - białko Etapy: 1. Oczyszczanie białka i drukowanie na powierzchni macierzy - szkiełka pokryte epoksisilanem (minimalny poziom tła fluorescencji) lub nitrocelulozą (duża zdolność wiązania białek i znaczna fluorescencja tła - pozornie dodatnie wyniki) 2. Immobilizacja białka na powierzchni płytki 3. Interakcje 4. Analiza uzyskanych wyników Mikromacierze tkankowe - podstaw jest pobranie tkanek referencyjnych przechowywanych w blokach woskowych (parafinowych) w archiwach Przebieg przygotowania: 1.Blok z tkanką wybarwiany - wyodrębnienie rdzenia bloku 2.Pobieranie fragmentu tkanki z bloku za pomocą igły - można przygotować kilka powtórzeń eksperymentu z jednej tkanki 3.Fragmenty tkanek są nanoszone na studzienki (spoty) na powierzchni mikromacierzy - porządek rozmieszczenia spotów jest ściśle określony dla prawidłowej identyfikacji wyników Zalety - Pozwala na szybkie diagnozowanie wielu próbek jednocześnie, co znacznie zmniejsza koszty oraz czas wykonywania przy zachowaniu rzetelności wyników. Pozwala na diagnostykę markerów molekularnych zarówno na poziomie kwasów nukleinowych jak i białek Analiza wyników - poddajemy barwieniu cytochemicznemu i mikroskopia fluorescencyjna Sondy stosowane w mikromacierzach: - Sondy wiążą komplementarne do nich sekwencje materiału genetycznego pochodzącego z próbki badanej (hybrydyzacja) - Każda sonda jest specyficzna - Obraz rejestrowany jest za pomocą lasera lub mikroskopu - Intensywność sygnału jest proporcjonalna do ilości kwasu nukleinowego - Ilościowo można porównywać sygnał dla jednej sondy w różnych próbkach Podział mikromacierzy ze względu na rodzaj sondy cDNA - Fragmenty cDNA zazwyczaj o długości 0,5 - 2,0 kpi - Jeden gen - jedna sonda, naniesiona w formie kropelki w ściśle określonym miejscu - Wielkość kropelki 100 - 150 um - Produkty amplifikacji PCR uzyskane z bibliotek cDNA (bakteryjne, fagowe, drożdżowe) Zalety: Wady: Niewielki koszt uzyskania Brak możliwości rozróżnienia nici sensownych od Nie trzeba znać sekwencji całego genomu antysensownych Można stosować w przypadku genów z dużą ilością intronów Możliwość otrzymania fałszywych wyników przy Unikatowe - rozróżnienie transkryptów niewiele różniących się bibliotekach o niskiej jakości od siebie - geny blisko spokrewnione z jednej rodziny genowej, warianty alternatywnego splicingu mRNA Krótkie oligo - 25 par zasad - Jeden gen 10 - 20 sond - Sondy oligo - 100% homologii - Wszystkie o podobnej kinetyce hybrydyzacji - Sondy oligo z podstawieniami - hybrydyzacja gorsza niż sondy 100% - Wielkość kropelki 2 - 20 um - Wysokiej, średniej i niskiej gęstości - Synteza in situ Długie oligo - Więcej niż 50 par zasad - 1 gen - jedna sonda (ew. Warianty gplicingowe) - Sondy oligo - 100% homologi - Wszystkie o podobnej kinetyce hybrydyzacji - Wysokiej, średniej i niskiej gęstości - Synteza in vitro, ewentualnie in situ Sondy oligo Zalety Wady Bardzo wysoka specyficzność Konieczna znajomość sekwencji całego genomu i jego Można rozróżnić geny posiadając różne warianty splicingu organizacji Można rozróżnić nić sensowną od antysensownej Wysoki koszt utrzymania Schemat badania mikromacierzy cDNA 1.Materiał wyjściowy stanowi zwykle RNA wyizolowany z komórek pobranych od badanego osobnika 2.RNA jest amplifikowany w reakcji odwrotnej transkrypcji - synteza cDNA z mRNA 3.Najczęściej próbki znakowane są bezpośrednio poprzez przyłączenie nukleotydów znakowanych fluorescencyjne lub radioizotopowi. Najpowszechniejszym sposobem detekcji na mikromacierzach jest znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi: zielonym - Cy3 i czerwonym - Cy5 oraz alexą fluor555 i 647 4.Łączy się równe ilości znakowanego materiału 5.Poszukiwany fragmenty jednonaciowego kwasu nukleinowego, hybrydyzuje ze znajdującą się na mikromacierzy sondą. W miejscach, gdzie sonda i badany DNA są komplementarne, tworzą się dwuniciowe fragmenty DNA, których obecność rejestrowana jest przez odpowiedni czynniki (fluorescencyjne, kolorymetryczne, chemiluminescencyjne, spektrometrii masowej itp) Schemat badań macierzy oligonukleotydowych 1. Izolacja i przygotowanie próbek RNA - wyizolowanie RNA z komórek lub tkanek, które mają być badane. Najczęściej wybierane są RNA z komórek w różnych warunkach (np w spoczynku i po stymulacji) lub z różnych grup badawczych. Izolowane RNA musi być odpowiedniej jakości, aby uniknąć zniekształceń wyników 2. Odwrócenie transkrypcji do cDNA - RNA jest odwracane do cDNA za pomocą rekacji odwrotnej transkryptazy. Przy tym procesie dodawane są specjalne znaczniki np fluorochromy (czerwony, zielony lub inny marker) które umożliwiają późniejszą detekcję 3. Hybrydyzacja cDNA z mikromacierzą - przygotowane cDNA jest następnie nanoszone na mikromacierz, która zawiera zestaw oligonukleotydów (krótkich fragmentów DNA) reprezentujących różne geny lub sekwencje. Mikromacierze są często osadzone na szkiełkach lub w formie chipów. cDNA hybrydyzuje z odpowiednimi oligonukleotydami na mikromacierzy 4. Detekcja - po hybrydyzacji próbki przechodzą przez kilka etapów płukania w celu usunięcia niespecyficznych wiązań. Detekcja sygnału jest możliwa dzięki wcześniej dodanym znacznikom, co pozwala na pomiar intensywności sygnału z każdego punktu mikromacierzy. Intensywność sygnału odpowiada liczbie cząsteczek cDNA, które związane są z danym oligonukleotydem, a zatem pośrednio informuje o ekspresji konkretnego genu 5. Analiza danych - odczyty sygnałów z mikromacierzy są następnie analizowane za pomocą odpowiednich algorytmów komputerowych. Pozwala to na porównanie ekspresji genów w różnych próbkach, identyfikację różnic w ekspresji genów, a także grupowanie genów, które mają podobny wzór ekspresji 6. Wyniki - na podstawie analizy danych, można uzyskać mapę ekspresji genów, która może wskazywać na różnicę w ekspresji pomiędzy próbkami na przykład pomiędzy zdrowymi a chorymi komórkami, różnymi warunkami ekspresy mentalnymi lub grupami kontrolnymi Metody biologii molekularnej stosowane w badanych genomu: - Izolacja i oczyszczanie DNA - Klonowanie DNA - Amplifikacja DNA w reakcji PCR - Elektroforeza żelowa - Analiza wyznakowanych fluorescencyjnie fragmentów STR - Analiza polimorfizmu typu SNP - Sekwencjonowanie DNA - Sekwencjonowanie genomowe - Analiza mikromacierzy SNP - Analiza restrykcyjna fragmentów DNA - Hybrydyzacja kwasów nukleinowych w tym metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ - Tworzenie bibliotek genomowych - Metody mikroskopowe z wykorzystaniem mikrodysekcji laserowej Metody biologii molekularnej w badaniu transkryptom - Izolacja i oczyszczanie RNA - Izolacja i oczyszczanie miRNA - Reakcja odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA - Amplifikacja cDNA metodą real time PCR - Analiza ekspresji genów metodą mikromacierzy Metody biologii molekularnej w badaniu proteomu - Izolacja i oczyszczanie białek - Sekwencjonowanie białek - Mikromacierz białkowa - Metody immunohistochemiczne - Elektroforeza białkowa - Immunoblotting - ELISA - Immunoprecypitacje - Aglutynacja - Spektrofotometria VIS i UV - Spektrofluorymetria - Chromatografia - Spektrofometria mas Markery genetyczne wykorzystywane w biologii sądowej - Występują na chromosomach autosomalhych - Występują na chromosomie X i Y - DNA mitochondrialne - Polimorfizmy typu SNP - polimorfizm pojedynczego nukleotydu - Sekwencje mikrosatelitarne STR nazywane krótkimi powtórzeniami tandemowymi Analizę markerów STR zlokalizowanych na chromosomach autosomalnych wykorzystuje się w - Identyfikacji osobniczej - Sprawach spornego ojcostwa - Sprawach ustalenia macierzyństwa - Identyfikacji NN zwłok i szczątków ludzkich - Ustalenia pokrewieństwa - Ustalenia dawcy materiału biologicznego - Analizy chimeryzmu po przeszczepie - Kontroli pochodzenia zwierząt Analizę markerów STR zlokalizowanych na chromosomie Y wykorzystuje się: - W badanych materiału biologicznego zabezpieczonego w przestępstwach na tle seksualnym (detekcja i identyfikacja męskiego DNA w mieszaninach) - Dla wyodrębnienia śladowych ilości męskiego DNA w materiale biologicznym zabezpieczonym od kobiety - Do ujawnienia więcej niż jednego sprawcy przestępstwa gwałtu - Gdy domniemany ojciec nie żyje lub jest niedostępny do badań (markery Y-STR ujawniają przynależność do określonej męskiej linii rodowej) - Do określenia regionu geograficznego lub grupy etnicznej, z którego pochodzi dany mężczyzna Analizę markerów STR zlokalizowanych na chromosomach X wykorzystuje się w - Badaniach materiału biologicznego ubezpieczonego w przestępstwach na tle seksualnym (detekcja i identyfikacja żeńskiego DNA na ciele i odzieży sprawcy) - Ustalenie ojcostwa gdy spornym dzieckiem jest córka - Gdy domniemany ojciec jest nieobecny wówczas markery chrom X wykazane u matki pozwanego i dziecka pozwolą na wnioskowanie odnośnie ojcostwa - W przypadku kazirodztwa gdy istnieje podejrzenie że domniemanym ojcem dziecka płci żeńskiej może być pozwany mężczyzna lub jego syn Analizę mitochondrialnego DNA wykorzystuje się w - Badaniach pokrewieństwa w przypadku degradacji DNA jądrowego - Włosów bez cebulek - Identyfikacji osobniczej na podstawie archiwalnego DNA - Ustalenie pokrewieństwa w linii matczynej - Badaniach antropologicznych - Badaniach ewolucyjnych Profilowanie DNA - ustalenie profilu genetycznego (profilu DNA) w oparciu o analizę markerów znajdujących się w różnych miejscach genomu i charakteryzujących się wysokim stopniem różnorodności DNA (STR) Profil DNA - Analiza markerów w materiale genetycznym wyizolowanym ze śladu biologicznego pobranego z miejsca zdarzenia - Próbka referencyjna - materiał genetyczny pobrany od osoby podejrzanej - identyfikacja osobnicza Zasadność profilowania DNA w kryminalistyce - DNA jest unikatowy dla każdego człowieka - Niezmienny w ciągu całego życia - Jest obecny w większości komórek ludzkiego ciała - Jego ślady zostają pozostawione w miejscu obecności danej osoby Profil DNA może być używany do - Identyfikacji osób - Potwierdzenia związku z określoną próbą biologiczną - Identyfikacji osób zaginionych lub niezidentyfikowanych ciał w przypadku gdy profile zostaną porównane z profilami osób spokrewnionych - rodzice, rodzeństwo STR - krótkie tandemowe powtórzenia tzw mikrosatelity czyli równomiernie rozproszone w genomie, tandemowo ułożone sekwencje składające się z 5-100 powtórzeń motywu obejmującego od 1 do 6 nukleotydów 16 markerów STR + markery płci Fenotypowanie DNA Przewidywanie cech wyglądu zewnetrznego danej osoby na podstawie DNA, które wyekstrahowano z ludzkich próbek biologicznych pobranych na miejscu zbrodni. Jest to tzw. Kryminalistyczne fenotypowanie DNA, które na podstawie markerów genetycznych oznaczonych w materiale dowodowym przewiduje wygląd osoby, jej wiek i pochodzenie biogeograficzne Znaczenie: zawężenie kręgu potencjalnych sprawców Krótkie powtórzenia tandemowe chromosomu Y (Y-STR) stosowane są do predykcji płci w kryminalistycznym fenotypowaniu DNA Analiza setek predykcyjnych markerów DNA (SNP). - NGS - sekwencjonowanie nowej generacji - Stare markery związane z kolorem oczu, włosów i skóry - Nowe markery związane z kolorem brwi, piegami, strukturą włosów, wypadaniem włosów u mężczyzn i wysokim wzrostem Wnioskowanie na podstawie DNA o pochodzeniu biogeograficznym - cechy odziedziczone po przodkach Im bardziej oddalone regiony geograficzne tym większe różnice genetyczne - mutacje, migracje, lokalna selekcja, izolacja genetyczna i dziedziczność DNA genomowe - markery zlokalizowane na autosomach są dziedziczone po obojgu rodzicach - Zawarte w jądrze komórkowym - Występuje w komórce tylko w dwóch kopiach - 50% od ojca i tyle samo od matki - Najwyższy stopień indywidualności osobniczej - przyporządkowanie śladu biologicznego z największym stopniem prawdopodobieństwa Markery zlokalizowane na chromosomie Y - charakterystyczny dla płci męskiej - Polimorfizm markerów genetycznych chromosomu Y ofiary - Materiał porównawczy potencjalnych krewnych w linii męskiej mtDNA - obecne w cytoplazmie, dziedziczone w linii żeńskiej (wszystkie dzieci jednej kobiety mają identyczną jego sekwencje; występuje w komórce w dużej ilości kopii) - Polimorfizm mitochondrialnego DNA ofiary - Materiał porównawczy potencjalnych krewnych w linii matczynej Praktyczne zastosowanie - w sprawach w których brak naocznych świadków. Zaleca się aby w praktyce kryminalistycznej stosować łącznie wszystkie trzy techniki fenotypowania DNA tj przewidywanie widocznych zewnętrznie cech, pochodzenie biogeograficzne i szacowanie wieku na podstawie DNA zgodnie z odpowiednimi ramami prawnymi Metody identyfikacji ofiar katastrof masowych zgodnie z ich efektywnością i stopniem wiarygodności Cele: - Odzyskanie wszystkich szczątków ludzkich z miejsca zdarzenia - Ustalenie tożsamości - Określenie sposobu śmierci - Rekonstrukcja przyczyn zdarzenia Dotyczy - Ofiar zamachów terrorystycznych - Ofiar katastrof i klęsk żywiołowych - Zwłok lub szczątków ekshumowanych z grobów masowych V Konferencja Komisji Interpolu ds Identyfikacji Ofiar KAtastrof Masowych i Klęsk Żywiołowych - uszeregowanie według stopnia wiarygodności metod identyfikacji zwłok i szczątków ludzkich. Najbardziej wiarygodna jest metoda identyfikacji genetycznej - dokładne ustalenia tożsamości na podstawie analizy DNA Metody identyfikacji ofiar - Metoda identyfikacji genetycznej - Porównanie odcisków palców - warunkiem jest ze ofiara była daktyloskopowana przeżyciowo przed katastrofą - Badania porównawcze uzębienia - konieczna karta leczenia stomatologicznego - Badania radiologiczne - przebyte złamania, identyfikacja w ciałach ofiar materiału dowodowego np pocisków, fragmentów ładunków wybuchowych - Porównanie danych medycznych na podstawie przebytych zabiegów chirurgicznych np brak organów, obecność implantów, warunek - przedśmiertna dokumentacja medyczna - Porównanie znaków szczególnych np blizny, znamiona, tatuaże - Porównanie danych dotyczących rysopisu - płeć, szacunkowy wiek, wzrost, budowa, kolor skóry, włosów i oczu - Identyfikacja rzeczy osobistych - Identyfikacja na podstawie dokumentów ujawnionych przy zwłokach lub szczątkach - Okazanie - metoda nienaukowa Sposób prowadzenia badań - Dostępność materiału porównawczego determinuje rodzaj i zakres badań identyfikacyjnych - W celu osiągnięcia pewnej identyfikacji zalecane jest stosowanie kombinacji wszystkich metod z wyraźnym wskazaniem na pobranie od wszystkich ofiar próbek biologicznych do identyfikacji genetycznej - Metody identyfikacji genetycznej mają zastosowanie gdy osoba nie ma krewnych DNA genomowe - Najwyższy stopień indywidualności osobniczej - Przyporządkowanie śladu z najwyższym stopniem prawdopodobieństwa - Na podstawie krwi, kości, tkanek, narządów, włosów możemy profilować DNA ofiary i porównany z profilem DNA potencjalnych krewnych - Opiera się na badaniu 16 markerów STR + marker płci Chromosom Y - Przekazywany w niezmienionej formie w linii męskiej - Badany materiał -> polimorfizm markerów genetycznych chromosomu Y ofiary porównywany z potencjalnymi krewnymi w linii męskiej - Analiza polimorfizmów typu SNP - analiza STR -> badanie przynależności do określonej linii rodowej - układ powtórzeń STR na chromosomie Y zmienia się z pokolenia na pokolenie, ale w obrębie jednej linii rodowej pozostaje względnie stały - 200 markerów STR zlokalizowanych na chromosomie Y - Badania przy zbyciu markerów Y - STR Rozdział fragmentów amplifikowanego DNA w polu elektroforetycznym Zestawy komercyjne do analizy markerów Y - STR mtDNA - Polimorfizm genetyczny markerów mtDNA polega na analizie sekwencji DNA - Dziedziczone w linii żeńskiej - mtDNA znacznie bardziej wytrzymały na degradację niż genomowy DNA - Występuje w komórce w dużej ilości kopii (1000>DNA genomowe) - Badania z kości czaszki, zębów, włosów, niewielkiej ilości DNA genomowego pozwala na stwierdzenie polimorfizmu mitochondrialnego DNA ofiary -> porównanie z potencjalnymi krewnymi linii matczynej Metody analizy markerów SNP - W genomie człowieka występuje ponad 2 mln markerów SNP - Zaleta - możliwość uzyskania produktu PCR mniejszego niż 100pz - Automatyzacja badań - Przeważająca ilość SNP zajmuje się w bazie danych Centrum Narodowym Informacji Biotechnologicznej - Brak idealnej metody genotypowanija SNP - badania identyfikacyjne i porównawcze wymagają analizy kilku SNP - Metody wykrywania: Hybrydyzacja AOS Elongacja - wydłużanie starterów Metoda oparta na działaniu ligazy OLA Inwazyjny podział Metoda hybrydyzacji ASO -Łączenie znakowanych specyficznych sond ASO do matrycy DNA zawierającej polimorficzne miejsce -Hybryda w pełni komplementarną lub z niedopasowaniem jednego nukleotydu -Amplifikacja fragmentu DNA, który zawiera polimorfizm -Startery PCR - badany pod względem polimorfizmu -Sonda allelospecyficzna - krótkie oligonukleotydowe fragmenty o długości około 15 - 21 par zasad, o niskiej zawartości GC (ok 50%), komplementarne do badanej sekwencji -Sonda ASO zawiera nukleotyd tzw różnicujący, który pozwala odróżnić od siebie poszczególne allele ponieważ niedopasowanie nawet jednego nukleotydu sprawia że hybrydy są mniej stabilne. Mogą być znakowane: Radioaktywnie Enzymatyczne Fluorescencyjnie Chemiluminescencyjne PCR - ASO występuje w dwóch odmianach 1.Forward -Sondy znaczone różnymi fluorochromami dla kolejnych wersji badanych sekwencji -W jednym eksperymencie kilka sond -Kolor fluorescencji będzie wskazywał jaka sekwencja DNA znajduje się w danym spocie -Pozwala nanieść na membranę wiele próbek różnego pochodzenia -Umożliwia jednorazowe badanie materiału od więcej niż jednej osoby -Wiele różnych próbek pod kątem niewielkiej liczby alleli 2. Reverse -Umożliwia zbadania wielu różnych alleli równocześnie Sondy przekazują energię poprzez FRET - Sonda z większą energią (reporter) przekazuje energię na fluorochrom sondy z niską energią (wygaszacz) - Fluorescencja generowana w każdym cyklu rekacji jest proporcjonalna do ilości amplifikowanego produktu - Dzięki FRET możliwe jest dokładne monitorowanie interakcji miedzy sondą a DNA, co poprawia czułość i specyficzność wykrywania polimorfizmów w badaniach z użyciem sond ASO Metoda elongacji - wydłużania starterów - Analiza multipleks SNP - w jednej reakcji badamy kilka nawet do 10 SNP równocześnie - Minisekwencjonowanie - primer rozpoczynający reakcję w sekwencji matrycowego DNA natychmiast łączy się i jest wydłużany poprzez polimerazę DNA, która zwiera nukleotyd komplementarny do polimorficznego miejsca SNaPshot - wykorzystuje się komercyjne zestawy o charakterze reakcji multiplex (stosuje się wiele sondy, aby zidentyfikować wiele miejsc polimorficznych). Rozdział produktów następuje przez elektroforezę kapilarną. Wykorzystuje się wysokoprzepustowe analizatory genetyczne. Możemy tak zaprojektować wiele reakcji multiplex analizując jednocześnie wiele SNP Metoda Maldi - Tof połączona ze spektrometrią mas - cząsteczki będą się odłączać od matrycy bo ta będzie pochłaniać energię z ładunków elektrycznych jonów z komory analizatora gdzie wykonuje się pomiar masy do ładunku elektrycznego - rozdzielenie pod względem wielkości - im większa masa cząsteczkowa jonów tym dłuższy czas przelotu - umożliwienie wychwycenia SNP na podstawie różnicy wiązania sond z dNTP - większe różnice masowe miedzy poszczególnymi allelami Mikromacierze - detekcja przez emocje fluorescencji - Allelospecyficzne wydłużanie - polega na różnicach efektywności wydłużenia polimerazy miedzy starterami ze zmianami na końcu 3’ - wydłuża tylko wtedy, gdy ten jest komplementarny do matrycowego DNA (czyli jeśli będzie obecne miejsce polimorfizmu, które chcemy zidentyfikować). Do każdego SNP potrzebna jest osobna para starterów. Detekcja przez mikromacierze znakowane fluorescencyjnie - Pirosekwencjonowanie - dokładna technika, umożliwia sekwencjonowanie DNA w czasie rzeczywistym Przygotowanie jednoniciowej matrycy za pomocą reakcji PCR i oczyszczenie z nieprzyłączonych nukleotydów - oligonukleotydów i starterów Hybrydyzacja matrycy ze starterem znakowanym biotyną Inkubacja z enzymami (polimeraza DNA, sulurylaza ATP, lucyferaza, apyraza) i dodanie substartów reakcji - cała reakcja przeprowadzana przez polimerazę z uwolnieniem fosforanu w ilości równej przyłączonych nukleotydów - konwencja lucyferyny do oksolucyferyny - powstawanie światła widzialnego i jego siła będzie odzwierciedleniem ilości zużycia ATP i powstanie oksylucyferyny Nieprzyłączone dNTP degradowane przez apyrazę - po zakończeniu tego procesu można dodawać kolejne dNTP - bez odczekania, błysk uniemożliwiłby odczytania sekwencji DNA Metoda ligacji nukleotydów - OLA - opiera się na właściwościach ligazy DNA, która włącza się do nukleotydów tworząc wiązania kowalencyjne. Składnikami reakcji są trzy sondy oligonukleotydowe i dwie sondy allelospecyficzne. Jedna z sond jest komplementarną z miejscem polimorficznym - koniec 3’ jest komplementarny do miejsce, które badamy. Do przyłączenia substratu do produktu dochodzi, gdy dwie sekwencje są komplementarne miedzy sobą Metoda inwazyjnego podziału - wymagana para oligonukleotydów - atakujący - przyłączający się do matrycowego DNA komplementarny do sekwencji SNP w regionie 3’ - tworzy strukturę wykrywaną przez endonukleazę - zwalnia sondę w miejscu 5’ jeśli enzym nie wykryje na matrycy, nie dojdzie do detekcji miejsca mutacyjnego - brak fluorescencji i wygaszacz Metody predykcji wieku: - Delecja w genomie mitochondrialnym - Skracanie telomerów - Racemizacja kwasu asparaginowego - Ekspresja mRNA - Badanie zaawansowanych produktów glikacji - Rearanżacja receptorów limfocytów T - Zmiany w poziomie metylacji genomowego DNA Pomiar częstości delecji w mtDNA - mtDNA zwiera 16 659 par zasad - Koduje 13 polipeptydowe - Nie zawiera intronów - W plemniku 50-800 kopii mtDNA, a oocycie 80 000 - 600 000 kopii mtDNA - Tempo mutacji mtDNA jest większe niż jądrowego DNA na skutek tworzenia się reaktywnych form tlenu spowodowanych oddychaniem - Wraz z wiekiem wzrasta ilość mutacji punktowych, delecji i duplikacji tandemowych objawiających się w całej tkance - Duże rearanżacje np delecja 4977 par zasad (delecja powszechna) - badamy za sprawą reakcji PCR i hybrydyzacji - Takie delecje mogą występować w krwi, mięśniach szkieletowych, mózgu i sercu - Wady: Częstość występowania różna tkankowi u tej samej osoby Różnice komórkowe w danej tkance Margines błędu kilkadziesiąt lat Zależy głównie od czynników zewnętrznych co zmniejsza dokładność metody Pomiar długości telomerów -Zachowanie stałej długości chromosomów ma wpływ na prawidłowe funkcjonowanie komórki -Końcówki chromosomów nie są kopiowane -W celu zabezpieczenia przed tym, chromosomy wyposażone są w telomery - funkcja ochronna -Telomery chronią DNA: Przed działaniem enzymów Zapobiegają zespoleniu komórek Zapobiegają wymianie materiału genetycznego (rekombinacji) z innymi chromosomami -Telomery składają się z heksamerowych powtórzeń 5’-TTAGGG-3’ - Skracanie telomerów to naturalny proces związany z wiekiem - Utrata części sekwencji telomerowej jest związana z jednokierunkowym mechanizmem replikacji DNA od końca 5’ do 3’ - Większość komórek dzieli się tylko określoną ilość, a później telomery osiągają krytyczną długość - Molekularny zegar, który informuje komórkę o przekroczeniu krytycznej liczby podziałów - Zjawisko skracania się telomerów wraz z wiekiem jest całkowicie naturalne - Indukcja starzenia się komórek zależy od krytycznej długości telomeru - genetyka ma 20% wpływu na starzenie się organizmu - Kiedy telomery stają się zbyt krótki, komórka przestaje się dzielić - Komórki mogą ulegać spoczynkowi replikacyjnemu lub apoptozie Etapy - Faza sygnalizacji: Sygnalizacja Replikacja Transkrypcja Naprawa DNA Fosforylacja białek (MPK) geny indukcji śmierci komórki - Faza wykonawcza Proteazy Fosfolipazy Fosfatazy Nukleazy - Faza eliminacji Telomeraza łączy się z końcem 3’ telomeru. Pomiar długości telomeru można zrobić z krwi lub miazgi zębów. Techniki do pomiaru długości telomeru to PCR i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ Hybrydyzacja kwasów nukleinowych w pomiarze długości telomerów Jest związana ze spontanicznym łączeniem się komplementarnych odcinków nici DNA ze sobą. Wysoka temperatura lub substancje chemiczne powodują denaturację podwójnej helisy DNA. Po eliminacji czynnika denaturującego następuje renaturacja czyli ponowne tworzenie podwójnej helisy. Wprowadzając do mieszaniny kwasów nukleinowych obce DNA w wyniku renaturacji, oprócz wyjściowych cząsteczek uzyskamy cząsteczki hybrydowe. Szybkość procesu zależy od: - Długości hybrydyzujących fragmentów - Komplementarności sekwencji - Obecności substancji hamujących proces hybrydyzacji Metody hybrydyzacji molekularnej Hybrydyzacja Southerna (Southern Blotting) - służy do wykrywania specyficznych fragmentów - Izolacja DNA - Cięcie enzymami restrykcyjnymi - Elektroforeza - Przeniesienie na membranę (nylonową lub nitrocelulozową) - Unieruchomienie - Hybrydyzacja z sondą molekularną - Detekcja sygnału Nothern Blotting - wykrywanie określonych sekwencji nukleotydów w RNA, identyfikacja mRNA genów aktywnie transkrybowanych -Izolacja RNA (całkowite lub frakcja zawierająca poliA) -Fragmentacja -Elektroforeza w warunkach denaturujących (żeli poliakrylamidowe z formaldehydem lub agarozowe z mocznikiem - rozdział mniejszych cząsteczek) - Przeniesienie na membranę - Unieruchomienie - Hybrydyzacja z sondą molekularną - znakowane radioaktywnie fragmenty DNA lub RNA z sekwencją komplementarną do poszukiwanego RNA - Detekcja sygnału Hybrydyzacja in situ - FISH - metoda cytochemiczna, polegająca na hybrydyzacji sekwencji DNA ze specyficznymi sondami barwionymi barwnikami fluorescencyjnymi, - Możemy określić pozycję danego markera czyli specyficznej oliagonukleotydowej sekwencji na badanej nici, - możemy zidentyfikować cały chromosom. - Reakcje przeprowadzamy w środowisku naturalnym występowania DNA. - Obserwacja przebiegu jest możliwa dzięki fluorochromom wzbudzanym światłem UV - Badanie DNA na poziomie jądrowym - z komórki usuwamy cytoplazmę i utrwalamy jądra komórkowe M - FISH (multiplex fluorescence in situ hybridization) - Znaczniki fluorescencyjne Rodamina Fluoresceina Kumaryna - Sondy stosowane w FISH dzielimy na Malujące Pokrywające cheomosom lub poszczególne ramiona Alfa - satelitarne - centromerowe, telomerowe Specyficzne dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus Q - FISH - Znaczniki fluorescencyjne Cy3  FITC - pochodna fluoresceiny - Specyficzne mimetyki DNA - oligonukleotydy kwasów peptydowych Metoda odcisku palca - DNA fingerpring Pomiar końcowych produktów glikacji (AGE) - Proces nieenzymatycznej glikacji białek - Spontaniczne łączenie grupy aminowej białek z grupą aldehydową cukrów prostych - niestabilna zasada przekształcana do związku amadori który prowadzi do powstania silnie reaktywnych dwuwęglowych pochodnych i prowadzi do powstania końcowych produktów glikacji - Coraz częściej wykorzystywany do pomiarów wieku biologicznego - starzenie się tkanek na skutek uszkodzenia funkcji białek - glikookygenacjaa i lipooksygenacja - Pomiary są niezwykle dokładne - obejmują techniki immunocytochemiczne jak i testy oceniające stężenie produktów w różnych tkankach - Produkty glikacji kumulują się w osierdziu, neuronach piramidowych centralnego układu nerwowego, soczewce oka, skórze - Największy współczynnik korelacji miedzy produktami końcowych produktów glikacji a wiekiem wykazują neurony - silnie związane ze starzeniem się - Najczęściej wykorzystywana metoda to metoda immunohistochemiczna - Możemy określić na podstawie zmiany koloru w ścięgnach - z biegi czasu z koloru żółtego stają się coraz bardziej brązowe - kumulacja końcowych produktów glikacji w kolagenie - wykorzystanie u osób poniżej 40 roku życia - Na błędny pomiar wpływają choroby np cukrzyca jak i temperatura - w zwiększonej temperaturze procesy glikacji zachodzą intensywniej - Procesy glikacji zachodzą w organizmach żywych, dlatego metoda ta nie nadaje się do identyfikacji wieku zmarłych Racemizacja kwasu asparaginowego AAR - Kwas asparaginowy wpływa na receptory, pobudza napływ wapnia do neuronów i wiele innych korzystnych rzeczy - Ze względu na niesymetryczny atom węgla może występować w formie L i D - przemiany skutkują zmienną konfiguracją przestrzennej cząsteczki - U ssaków dominują formy L, ale wraz z wiekiem w procesach zależnych od temperatury, mogą ulegać przekształceniu w formę D, tak samo działają warunki środowiskowego jak np. pH - W procesie starzenia się organizmu kwas asparaginowy w białkach (soczewkach oczu, zębach) ulega powolnej i przewidywalnej recemizacji - może być używany do predykcji wieku - Wykorzystujemy Chromatografię gazową ze spektrofometrią mas HPLC Analiza izotopowa - badanie próbek o znaczeniu archeologicznym - dostarcza informacje o stopniu racemizacji i o czasie przechowywania próbki Spektroskopia w podczerwieni FIT - analiza zmian w widmie adsorbcji będąca skutkiem zmian konformacji przestrzennej aminokwasów Występuje korelacja stosunku lizoform wraz z wiekiem - dotyczy zębiny, gdzie wiek metrykalny obliczono ze zgodnością 1,5 - 4 lat Rearanżacje receptorów limfocytów T - sjTREC - Proces inwolucji grasicy - kluczowy narząd w dojrzewaniu limfocytów T związanych z odpornością - Rozpoczyna się bardzo wcześnie - zaczyna tracić swoje właściwości -> przekształcenie w tkankę łączną tłuszczową -> zatracenie umiejętności tworzenia limfocytów dziewiczych T -> zmniejszenie odporności organizmu - Limfocyty rozpoznawane dzięki receptorom - 4 nukleotydy włączony do DNA chromosomu 14 tworzące koliste DNA pozostawiając ślad po działaniu limfocytów na zawsze - Jakieś cechy są charakterystyczne dla komórek dziewiczych wychodzących bezpośrednio z grasicy, nie są przekazywane innym komórkom - jest to wskaźnik aktywności grasicy - Do ilościowej analizy używamy sondę TagMan qPCR Zalety: Metoda stabilna w czasie  Duża czułość Wysoka precyzja szacowania Wady: Krew Tkanki zawierające krew Wpływ czynników zewnętrznych Poziom metylacji DNA - Nazywane zegarem biologicznym molekularnym - silna korelacja z wiekiem - Wyspy CpG - markery, regiony w DNA w których występuje duża ilość cytozyny i guaniny, w tych regionach cytozyna jest etylowana, co wpływa na regulację genów i aktywność chromosomów - metylacja ma istotne znaczenie dla metylacji - ekspresji genów, różnicowania komórek czy procesów nowotworzenia - Modele obejmują zmienne zestawienia miejsc CpG od 2 do 350 miejsc, najczęściej wykorzystuje się 3 takie miejsca - Rzadsze procesy wraz ze starzeniem się organizmu - Poziom metylacji zmienia się nie tylko z wiekiem ale też w zależności od płci lub chorób np otyłość i prowadzących niezdrowy tryb życia będzie mniejszy - zależy od poziomu minerałów i witamin - Zależy od rodzaju tkanki i komórki w której zachodzi - Próbki do badania to krew, ślina, sperma, tkanki zębów - cement, miazga i zębina. Można wykorzystać nieznane tkanki ludzkie Poziom ekspresji mRNA Cechy markerów - Związany z fizjologicznymi zmianami zachodzącymi w komórkach i tkankach ludzkich wraz z wiekiem - Niezależny od wpływu czynników środowiskowych czy procesów chorobowych - Daje możliwość predykcji wieku z wielu typów tkanek czy śladów biologicznych - Odporny na degradację - Informuje o wieku biologicznym - Prosty i wiarygodny w pomiarze oraz łatwy w interpretacji Przebieg rekacji PCR - DGGE I etap - Izolacja materiału genetycznego z próbki pobranej ze środowiska (próbka głąby, wody, powietrza) - Degradacja komórek w buforze licującym z dodatkiem enzymów trawiących, następnie otrzymany lizać przenosi się na kolumnę z membraną, która w trakcie wirowania wiąże DNA - Po kilkukrotnym przemyciu, buforami płaczącymi, materiału genetycznego związanego do membrany prowadzona jest jego elucja II etap - Amplifikacja wybranych sekwencji genomowych mikroorganizmów, na podstawie których dokonywane będzie ich różnicowanie - Ważny jest dobór odphwiendihc sekwencji - Dla bakterii uniwersalnym markerem molekularnym jest gen kodujący 16S rRNA rpoB - pierwszy opracowany marker dla bakterii Pseudomonas, kodował jednostkę B polimerazy DNA nifH - koduje białko żelaza molibdenowego mxaF Oprócz identyfikacji taksonomicznej możemy na jego podstawie ocenić także aktywność danego genu w zbiorowisku - W przypadku grzybów są to sekwencje w niekodującym regionie ITS - Łańcuchową reakcję polimerazy prowadzi się w termocyklerze - mieszanina reakcyjna zawiera H2O, 10x stężony bufor do polimerazy MgCl 2, startery zaprojektowane do DNA, mieszaninę oligonukleotydów, polimerazę Taq i matrycę (DNA) - Warunki temperaturowe prowadzenia PCR Denaturacja wstępna - zazwyczaj 95C przez 5-10 min Denaturacja - 95C przez 30-60s Przyłączanie starterów DNA do matrycy 30-100 s Elongacja 72C przez 30-120s Ostateczna elongacja 72C - Dla próbek o małej zawartości DNA możliwe jest zastosowanie technik nestedPCR (PCR zagnieżdżony) - Dwie reakcje, w pierwszej matrycą jest wyizolowany DNA, w drugiej reakcji matrycą jest produkt pierwszej reakcji PCR III etap - Po uzyskaniu odpowiedniej jakości amplikonów przeprowadza się ich elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z gradientem czynnika denaturującego najczęściej 30-60% (możliwe 20-80%) w którym jest zwykle mocznik lub formamid - Bufor do elektroforezy stanowi 0,5% bufor TAE. Po przeprowadzonej elektroforezie żel wybarwi się (bromkiem petydyny lub komercyjnie dostępnymi barwnikami) a otrzymany wzór prążków wizualizuje się z wykorzystaniem światła UV - Napięcie i czas prowadzenia elektroforezy zależny jest od wielkości rozdzielanych amplikonów Główne trudności metody DGGE/TGGE - wady - Dobór odpowiedniego startera do przedstawiania całej populacji mikroorganizmów - Optymalizacja warunków elektroforezy - Ograniczona czułość w wykrywaniu rzadkich członków populacji mikroorganizmów - Oddzielenie tylko małych fragmentów DNA do 500 par zasad - Odchylenia w reakcji PCR które mogą nie wyrazić prawdziwej różnorodności, ponieważ tylko gatunki dominujące ilościowo wykrywa się z powodu dużej ilości dostępnych wzorów DNA - Zmienna efektywność ekstrakcji DNA - ocenia się ze można wykryć tylko 1 - 2 % populacji gatunków dominujących obecnych w reprezentatywnej próbce środowiskowej - Fragmenty DNA różniące się sekwencją mogą mieć podobne cechy mobilności w żelu poliakrylamidowym - Zaburzenia obrazu różnorodności zespołu mikroorganizmów z powodu występowania wielu genów 16S rRNA o nieco zmiennej sekwencji Zalety - Śledzenie zmian w populacji drobnoustrojów w odpowiedzi na bodźce - Powtarzalność metod i ich niskie koszty - Możliwość analizowania wielu próbek równocześnie Zastosowanie - Ustalenie źródła i drogi rozprzestrzeniania mikroorganizmów - Powiązanie sprawcy z dowodem - Dopasowania przedmiotu użytkowego do jego właściciela