PODSTAWY GENETYKI - 2024/25 PDF

PODSTAWY GENETYKI 1  Efekty kształcenia: Wiedza Student zna: budowę i sposób powielania materiału genetycznego oraz reguły jego dziedziczenia, wyjaśnia interakcje między genami i związane z nimi modyfikacje praw dziedziczenia, zna strukturę genów oraz mechanizmy r...

PODSTAWY GENETYKI 1  Efekty kształcenia: Wiedza Student zna: budowę i sposób powielania materiału genetycznego oraz reguły jego dziedziczenia, wyjaśnia interakcje między genami i związane z nimi modyfikacje praw dziedziczenia, zna strukturę genów oraz mechanizmy regulacji ekspresji genów u Prokaryota , Eukaryota i wirusów, rozumie przyczyny zjawisk zmienności genetycznej (mutacyjnej i rekombinacyjnej ) u organizmów żywych, opisuje genomy pozajądrowe i mechanizmy dziedziczenia pozajądrowego, wskazuje zależności pomiędzy zmianami w DNA a chorobami genetycznymi człowieka, zna podstawy genetyki populacyjnej. 2  Umiejętności Student posługuje się podstawowymi technikami laboratoryjnymi stosowanymi w badaniach genetycznych, wyjaśnia mechanizmy dziedziczenia materiału genetycznego organizmów żywych i ich modyfikacje związane ze współdziałaniem genów, interpretuje zależności pomiędzy zmianami w DNA a występującą u organizmów żywych zmiennością mutacyjną i rekombinacyjną , analizuje główne zagrożenia dla człowieka związane z mutacjami genowymi i chromosomowymi w jego materiale genetycznym, wyjaśnia zależności między genetyką populacyjną a ewolucją. 3  Kompetencje społeczne ( postawy ) Student wykazuje zrozumienie podstawowych zjawisk genetycznych w przyrodzie, ma świadomość zagrożenia związanego ze zmianami materiału genetycznego u organizmów żywych, pracuje w zespole i wykazuje odpowiedzialność za wspólnie realizowane zadania, wykazuje odpowiedzialność za powierzony sprzęt laboratoryjny i rozumie wagę przestrzegania zasad BHP w laboratorium genetycznym. 4  Treści kształcenia: Materiał genetyczny organizmów prokariotycznych, eukariotycznych i wirusów. Mechanizmy dziedziczenia - prawa Mendla, uzupełnienia i modyfikacje reguł dziedziczenia ustalonych przez Mendla. Mapowanie genetyczne. Struktura, funkcje i mechanizmy regulacji ekspresji genów u Prokaryota, Eukaryota i wirusów. Zmienność organizmów - mutacje, rekombinacje i hybrydyzacja protoplastów. Dziedziczenie pozajądrowe - mitochondrialne i chloroplastydowe. Choroby genetyczne. Podstawy genetyki populacyjnej. Podstawy biologii molekularnej. 5 Ważniejsze osiągnięcia dla rozwoju genetyki. Drobnoustroje i ich znaczenie dla postępu badań genetycznych. Dziedziczenie cech. Prawa Mendla. Uzupełnienia i modyfikacje reguł dziedziczenia ustalonych przez Mendla. DNA - materiał genetyczny -lokalizacja w komórce, struktura chromosomów: prokariotycznego i eukariotycznego. Cykle podziałowe komórek. Sprzężenie genów. Mapowanie genetyczne. Geny, struktura i regulacja ich ekspresji u Prokaryota, Eukaryota i wirusów. Kod genetyczny - uniwersalność, wieloznaczność i zasady kodowania. Poziom błędów przy odczytywaniu kodu genetycznego. Zmienność organizmów żywych ( fluktuacyjna, mutacyjna i rekombinacyjna). Mutacje genowe. Molekularny mechanizm mutacji. Mutacje spontaniczne i indukowane. Czynniki mutagenne. Systemy reparacyjne w komórkach bakterii (fotoreaktywacja, reperacja przez wycinanie. poreplikacyjna reperacja DNA ). Mutacje chromosomowe liczbowe i strukturalne. Procesy rekombinacji u bakterii - koniugacja, transdukcja i transformacja. Rekombinacja uprawniona i nieuprawniona - mechanizm molekularny. Dziedziczenie poza jądrowe organelarne. Genom mitochondrialny drożdży. Mutanty mitochondrialne. Podstawy genetyki populacyjnej - równowaga Hardy'ego - Weinberga. Czynniki naruszające równowagę genetyczną populacji (mutacje, migracje, selekcja, dryf genetyczny). 6  LITERATURA 1. Gajewski W. GENETYKA OGÓLNA I MOLEKULARNA 2. Praca zbiorowa pod red. Piotra Węgleńskiego GENETYKA MOLEKULARNA 3. P.C. Turner, A.G. McLennan, A.D. Bates, M.R.H. White, BIOLOGIA MOLEKULARNA. KRÓTKIE WYKŁADY 4. P.C.Winter, G.I. Hickey, H.L. Fletcher GENETYKA. KRÓTKIE WYKŁADY 5. Brown T.A. GENOMY 6. Inna, byle w temacie 7  PODSTAWOWE POJĘCIA GENETYKA – nauka, która zajmuje się: zjawiskami dziedziczności i zmienności; prawami, które decydują o przekazywaniu informacji genetycznej od rodziców na potomstwo. DZIEDZICZNOŚĆ – występowanie w przyrodzie, u form rodzicielskich i potomnych, tych samych form funkcjonalnych i strukturalnych. zjawisko polegające na przekazywaniu przez rodziców potomstwu materialnych zawiązków, rozwijających się później w możliwe do zaobserwowania cechy, które są podobne u rodziców i ich potomstwa oraz pomiędzy rodzeństwem. Cechy dziedziczności: Cechy, które się ujawniają, ale również te potencjalne. 8 ZMIENNOŚĆ – odstępstwa od identyczności z rodzicami; (odchylenie w wyglądzie cech obserwowanych u rodziców i ich potomstwa, pomiędzy potomstwem lub pomiędzy osobnikami należącymi do jednego taksonu) Zmienność genetyczna – przekazywana na potomstwo; zmienność modyfikacyjna - zmienność wynikająca z modyfikacji cechy zapisanych w materialne genetycznym przez warunki, w jakich rozwija się i żyje osobnik np. nasłonecznienie, wilgotność. Nie jest przekazywana na potomstwo. zmienność mutacyjna - zmienność zaistniała w materiale genetycznym jako spontaniczna lub wywołana czynnikami chemicznymi bądź fizycznymi mutacja. zmienność rekombinacyjna - zmienność powstała wskutek "tasowania się" materiału genetycznego związanego z produkcją gamet (crossing over) oraz losowym łączeniem się gamet. 9 POPULACJA – ogół osobników tego samego gatunku, które żyją w określonym miejscu, na danym obszarze. Podlegają tym samym prawom dziedziczenia i temu samemu doborowi. W biologii grupa osobników tego samego gatunku (w obrębie której możliwa jest wymiana genów), zasiedlająca pewien obszar, izolowana barierami (genetycznymi, geograficznymi, etologicznymi) od innych podobnych grup, posiadająca specyficzne właściwości, takie jak liczebność populacji, zagęszczenie, tempo rozrodczości i śmiertelności, rozkład wiekowy (demografia) oraz sposób 10 rozmieszczenia w przestrzeni.  Gen - materialna, autonomiczna i niepodzielna jednostka dziedziczności, fragment chromosomu zawierający informację o jednej cesze (wg współczesnego ujęcia: informację o budowie jednego łańcucha białka). Geny ułożone są liniowo jeden za drugim w chromosomach. Allel - jedna z możliwych, wzajemnie wykluczających się form tego samego genu. Ponieważ gen jest czymś materialnym, pojawiają się błędy w kopiowaniu, które generują większą liczbę odmian genu. Allele dominujące - allele genów, które ujawniają się u heterozygot kosztem alleli recesywnych. Allele recesywne - allele genów, które nie ujawniają się w fenotypach heterozygot, ale stają się widoczne u około ¼ potomstwa dwóch identycznych heterozygot. 11  Haploidalność - cecha polegająca na tym, że materiał genetyczny osobnika zawiera tylko jedną kopię każdego genu. Realizowany jest jeden możliwy allel. Diploidalność - obecność dwóch kompletów genów w komórce (człowiek, większość zwierząt i roślin). Możliwe jest równoczesne występowanie dwóch alleli jednego genu. Zygota - diploidalna komórka powstała ze zlania gamet i połączenia się ich materiału genetycznego w jednolity diploidalny genom. Homozygota - osobnik diploidalny, którego genotyp zawiera jeden allel danego genu. Heterozygota - osobnik posiadający dwa allele danego genu. 12  Genom - komplet wszystkich genów organizmu, obejmujący także ich formy alleliczne, Genotyp - skład alleliczny dowolnego genomu osobnika. Fenotyp - dowolna cecha osobnika, możliwa do empirycznej weryfikacji. Może dotyczyć morfologii, anatomii, szlaków metabolicznych, biochemii (np. obecność charakterystycznych antygenów), behawioru. 13  SYMBOLE WYKORZYSTYWANE W KRZYŻÓWKACH GENETYCZNYCH P - pokolenie rodzicielski F1 - pokolenie I (dzieci) F2 - pokolenie II (wnukowie) g - gameta Cechy pojawiające się w wyniku działania krzyżówek można podzielić na: DOMINUJĄCE - są widoczne w fenotypie w pierwszym pokoleniu; oznacza się je dużymi literami RECESYWNE - niewidoczne w fenotypie w pierwszym pokoleniu, ale mogą ujawniać się w kolejnym pokoleniu; oznacza się je małymi literkami Z połączenia dwóch gamet mogą powstać trzy typy genotypów: HOMOZYGOTA DOMINUJĄCA oznaczana literami AA HETEROZYGOTA DOMINUJĄCA oznaczana literami Aa HOMOZYGOTA RECESYWNA oznaczana literami aa Zygoty dominujące zawierają co najmniej jeden allel A, charakteryzują się tym samym fenotypem mimo różnic w genotypach. Natomiast homozygota recesywna (aa) ujawnia inny fenotyp - określany przez allele recesywne. 14 DZIEDZICZENIE CECH I PRAWO MENDLA GRZEGORZ MENDEL I JEGO BADANIA ❖ Czeski zakonnik ❖ Studiował nauki przyrodnicze i matematyczne ❖ Przez 10 lat prowadził badania dotyczące dziedziczenia cech u rozmnażającego się płciowo grochu jadalnego. ❖ Badania polegały na kojarzeniu (krzyżowaniu) rożnych odmian grochu oraz kontrolowaniu, obserwowaniu i notowaniu tych cech rodziców, które występują u potomstwa. ❖ Jego wnioski są obecnie podstawą teorii dziedziczności. 15  Dlaczego groch Łatwy w uprawie Wieloodmianowy Kwiaty obupłciowe Słupki i pręciki osłonięte płatkami korony Możliwe jest zapylenie sztuczne, ponieważ jest samopylną rośliną 16  http://www.gdynia.mm.pl/~drake87/drake87/3/37/3701.html ❖ Mendel wykorzystywał osobniki z tzw. linii czystej, które otrzymywał po krzyżowaniu miedzy sobą roślin tej samej odmiany. Następnie sprawdzał, czy wybrane cechy występują u wszystkich osobników potomnych. ❖ Ogółem Mendel przebadał 7 rożnych cech: barwę nasion, długość pędu, kształt nasion, barwę kwiatu, kształt strąka, kolor strąka, położenie kwiatu. ❖ Ustalał, które cechy są dominujące (ujawniają się u wszystkich osobników w pierwszym pokoleniu), a które recesywne (występują w drugim pokoleniu u 25% potomstwa). ❖ Stwierdził, ze wśród siedmiu zbadanych przez niego przeciwstawnych (allelicznych) par cech jedna cecha była zawsze dominująca, a druga recesywna. 17 18  TERMINOLOGIA GENETYCZNA Zapisując krzyżówki, posługujemy się ogólnie przyjętymi zasadami: - gen dominujący oznaczamy dużą literą alfabetu, - gen recesywny - małą literą, - geny dziedziczące się równomiernie - tą sama literą z indeksem górnym lub dolnym. Kolejne pokolenia w krzyżówkach oznaczamy odpowiednio: P – parentes (łac. rodzice); pokolenie rodzicielskie (ang. parental generation) F1 – filius (łac.) pierwsze pokolenie mieszańcowe (ang. first filial generation), F2 – drugie pokolenie mieszańcowe, F2 – dalsze pokolenia (n = 3, 4, 5,...). 19  TERMINOLOGIA GENETYCZNA LINIE CZYSTE – reprezentują osobniki będące homozygotami (dominującymi lub recesywnymi). Krzyżowanie osobników linii czystych o przeciwstawnych cechach daje w F 1 pokolenie fenotypowo jednorodne, a genotypowo są to mieszańce. HYBRYDY – osobniki posiadające różne allele danego genu, czyli heterozygoty, nazywane również mieszańcami. W zależności od liczby rozpatrywanych genów mogą to być: - monohybrydy – heterozygoty w jednej parze genów, - dihybrydy – heterozygoty w dwóch parach genów, - trihybrydy - heterozygoty w trzech parach genów itd. 20  Mendel sformułował I prawo: PRAWO CZYSTOŚCI GAMET: Gamety zawierają tylko po jednym allelu danego genu. 21 Jednopunktowa krzyżówka wsteczna (testowa) osobnika heterozygotycznego skrzyżowanego z osobnikiem homozygotycznym recesywnym. W potomstwie otrzymuje się osobniki o cechach dominujących i recesywnych w proporcji 1:1. 22  Mendel sformułował II prawo: PRAWO NIEZALEŻNEJ SEGREGACJI DWÓCH PAR ALLELI: Allele dwóch różnych genów przechodzą do gamet niezależnie od siebie. Krzyżówka mendlowska dwucechowa: 23 Za pomocą krzyżówki testowej (krzyżówki z homozygotą recesywną) można sprawdzić, jakie rodzaje gamet i z jaką częstotliwością wytwarza osobnik o nieznanym genotypie. Krzyżując testowo heterozygotę z F1, Mendel otrzymał: RrYy x rryy RY Ry rY ry ry RrYy Rryy rrYy rryy fenotyp okrągłe okrągłe pomarszczone pomarszczone żółte zielone żółte zielone stosunek 1 1 1 1 częstość 25% 25% 25% 25% 24 RÓŻNE POZIOMY GENETYCZNYCH INTERAKCJI I ICH WPŁYW NA GENOTYP I FENOTYP Interakcje między allelami tego samego genu: DOMINACJA CALKOWITA – DZIEDZICZENIE TYPU PISUM Allel dominujący (R) nie pozwala na ujawnienie się cechy uwarunkowanej allelem recesywnym (r). W wyniku krzyżowania homozygoty RR z homozygotą rr powstaje heterozygota Rr, która ma taki fenotyp jak homozygota dominująca. Taki wynik krzyżówki świadczy o tym, że allel R w pełni dominuje nad allelem r. Recesywny fenotyp ujawni się tylko u osobnika będącego homozygotą recesywną. 25 Interakcje między allelami tego samego genu: DOMINACJA NIECAŁKOWITA (SEMIDOMINACJA, PÓŁDOMINACJA) – DZIEDZICZENIE TYPU ZEA Jeden allel nie zawsze musi w pełni dominować nad drugim. Często heterozygota ma fenotyp pośredni w stosunku do homozygot rodzicielskich, a stosunek fenotypowy w pokoleniu F2 wynosi 1:2:1. W tym typie dziedziczenia genotyp odzwierciedla fenotyp. Krzyżując wyżlin o kwiatach czerwonych z wyżlinem o kwiatach białych otrzymano potomstwo jednorodne o barwie różowej. Interpretacja tego wyniku jest prosta: ❖ rośliny o kwiatach czerwonych to homozygoty R1R1, ❖ rośliny o białych kwiatach - R2R2. W wyniku krzyżowania: R1R1 x R2R2 R1 R2 R1R2 – heterozygota o fenotypie pośrednim w stosunku do form rodzicielskich. Taki wynik krzyżowania świadczy o tym, że gen R1 nie w pełni dominuje nad genem R2. 26 Dominacja niecałkowita u wyżlinu Antirrhinum majus. 27 Barwa kwiatów uwarunkowana jest zdolnością do syntezy antocjanu w płatkach kwiatów. Kwiaty białe nie wytwarzają antocjanu, gdyż gen R2 wytwarza nieaktywny enzym szlaku biosyntezy tego barwnika. Wówczas synteza antocjanu zostaje zablokowana. Heterozygota R1R2 ma gen: ❖ kodujący aktywny enzym ❖ kodujący nieaktywny enzym w porównaniu do R1R1 tworzy połowę ilości aktywnego enzymu - antocyjanu, co wystarcza do zabarwienia kwiatów na różowe. DOMINOWANIE WYSTEPUJE NA POZIOMIE EFEKTÓW KOŃCOWYCH AKTYWNOŚCI KODOWANYCH PRZEZ GEN ENZYMÓW, A NIE NA POZIOMIE BEZPOŚREDNICH PRODUKTÓW BIAŁKOWYCH GENÓW. 28 Interakcje między allelami tego samego genu: WSPÓŁDOMINOWANIE – KODOMINACJA, DOPEŁNIANIE SIĘ W przypadku współdominowania u heterozygot, cechy uwarunkowane przez dwa allele danego genu ujawniają się niezależnie od siebie. Oba allele są równorzędne, a heterozygota prezentuje fenotyp obojga rodziców. Przykład: U heterozygot oba allele ulegają ekspresji, w rezultacie powstaje mieszany fenotyp. Dziedziczenie u ludzi grup krwi układu MN (M, N i MN). Lp Fenotypy i genotypy Liczba Grupy krwi potomstwa rodziców rodzin M MN N 1. M x M (MM xMM) 24 znalezione 98 1 spodziewane 99 - 2. N x N (MnMn x MnMn) 6 znalezione 27 spodziewane 27 3. M x N (MM x MnMn) 30 znalezione 43 1 spodziewane 44 - 4. M x MN (MM x MMn) 86 znalezione 183 196 spodziewane 189,5 189,5 5. N x MN (MnMn x MMn) 71 znalezione 156 167 spodziewane 161,5 161,5 6. MN x MN (MMn x MMn) 69 znalezione 71 141 63 spodziewane 68,75 137,5 68,75 29  INTERRAKCJE MIĘDZY GENAMI NIEALLELICZNYMI Krzyżowanie dihybrydów pod względem genów dziedziczących się niezależnie daje w pokoleniu potomnym 9 różnych genotypów, a rozkład fenotypowy jest zgodny z II prawem mendla i wynosi 9:3:3:1. Odchylenia od tego stosunku świadczą o interakcji dwóch lub więcej genów w wytworzeniu fenotypów. Wpływ dwóch par genów na kształtowanie tej samej cechy Różne geny mogą kontrolować tę samą cechę i wspólnie wpływają na kształtowanie nowego fenotypu. 30 EPISTAZA Zjawisko to dotyczy współdziałania genów nieallelicznych. Polega na tym, że jeden gen maskuje fenotypową ekspresję innych genów, zmieniając w ten sposób fenotyp. GEN EPISTATYCZNY - gen, który maskuje ekspresję innego genu; GEN HIPOSTATYCZNY- gen maskowany. Istnieją różne rodzaje epistazy: - epistaza recesywna (9:3:4) - podwójna epistaza recesywna (komplementacja genów) - epistaza dominująca - podwójna epistaza dominująca - epistaza dominująca i recesywna 31 PODWÓJNA EPISTAZA RECESYWNA Współdziałanie genów dominujących z różnych loci wymaga ich równoczesnej obecności (komplementacji, wzajemnego uzupełniania się), aby ujawnił się określony fenotyp, np. barwa kolb u kukurydzy Zea mays. Jeśli skrzyżujemy dwie odmiany kukurydzy o kolbach białych, to roślin z F 1 pojawią się tylko kolby purpurowe. P: I odmiana II odmiana AAbb x aaBB białe białe F 1: AaBb purpurowe AaBb x AaBb F 2: AB Ab aB ab AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb aB AaBB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb 32 PODWÓJNA EPISTAZA RECESYWNA Aby ujawniła się barwa purpurowa, muszą być obecne allele dominujące z każdej pary (co najmniej jeden). Roślina o genotypie aaB_ wytwarza kolby białe, mimo obecności genu dominującego B, podobnie rośliny A_bb dają kolby białe. Mechanizm epistatycznego działania alleli a i b determinujących zabarwienie kolb kukurydzy: Oba geny A i B zaangażowane są w jeden szlak metaboliczny, a dominujące formy obu genów są konieczne, aby ujawnił się barwny fenotyp. 33 EPISTAZA DOMINUJĄCA (12:3:1) Epistaza dominująca polega na tym, że allel dominujący w jednym locus maskuje efekt genu w innym locus, np. dziedziczenie barwy owoców u dyni lub barwy upierzenia u kurcząt. Biała barwa owoców dyni uwarunkowana jest genem dominującym (W), za żółtą barwę odpowiedzialny jest allel dominujący (G), a za zieloną recesywny (g). Gen W jest epistatyczny w stosunku do genu barwy G, jak i te z recesywnymi allelami gg są białe. Barwa owoców ujawni się tylko w obecności alleli ww, allel W jest inhibitorem genu G. Krzyżując linie czyste dyni o białych owocach (WWGG) z dynią o owocach zielonych (wwgg), w pokoleniu F 1 otrzymamy wszystkie rośliny o owocach białych WwGg. W pokoleniu F2 otrzymamy stosunek fenotypowy 12:3:1. 34  P: WWGG x wwgg białe owoce zielone owoce F 1: WwGg białe WwGg x WwGg F 2: WG Wg wG wg WG WWGG WWGg WwGG WwGg Wg WWGg WWgg WwGg Wwgg wG WwGG WwGg wwGG wwGg wg WwGg Wwgg wwGg wwgg 35 Mechanizm powstawania barwy owoców u dyni: 1. Droga powstawania białego zabarwienia owocu: 36 2. Droga powstawania żółtego zabarwienia owocu: 37 3. Droga powstawania zielonego zabarwienia owocu: 38 PODWÓJNA EPISTAZA DOMINUJĄCA (15:1) W tym rodzaju epistazy wystarczy tylko jeden dominujący allel jednego z dwu współdziałających genów, aby ujawnił się fenotyp dominujący, np. kolor ziarniaków pszenicy lub kształt owoców tasznika pospolitego. Gdy skrzyżowano linie czyste tej rośliny o owocach sercowatych (AABB) z roślinami o owocach podłużnych (aabb) w pokoleniu F 2 otrzymano zmieniony stosunek fenotypowy. Biochemiczne podłoże tego typu epistazy nie są jeszcze znane. AABB x aabb AaBb sercowate AaBb x AaBb 15 : 1 A_B_ aabb A_bb 39 aaB_ MODYFIKACJE STOSUNKU FENOTYPOWEGO WYNIKAJĄCE Z INTERAKCJI GENÓW: 40  Penetracja i expresja Penetracja – przenikliwość, jest to częstość ekspresji określonego genu wyrażona w procentach Expresja – to ujawnienie się produktu danego genu odpowiedzialnego za daną cechę – określa się na poziomie mRNA lub białka. Niektóre geny dominujące wykazują zmienną ekspresję, czyli zmienny stopień natężenia cechy 41 PENETRACJA I EKSPRESYWNOŚĆ GENÓW CAŁKOWITA PENETRACJA NIECAŁKOWITA PENETRACJA Identyczne genotypy dają 100% Identyczne genotypy dają mniej niż 100% identycznych fenotypów. identycznych fenotypów. STAŁA EKSPRESYWNOŚĆ ZMIENNA EKSPRESYWNOŚĆ Identyczne genotypy przy stałej Identyczne genotypy przy zmiennej ekspresywności dają 100% ekspresywności wytwarzają różnorodne oczekiwanych fenotypów. fenotypy. NIECAŁKOWITA PENETRACJA ZE ZMIENNĄ EKSPRESYWNOŚCIĄ Identyczne genotypy dają rozległy zakres fenotypów w związku ze zróżnicowanym stopniem aktywacji i ekspresji genu. 42  Plejotropia i komplementacja Plejotropia polega na warunkowaniu przez jeden zmutowany gen kilku pozornie nie związanych ze sobą cech fenotypowych – efekty plejotropowe obserwuje się w wielu chorobach dziedziczonych monogenowo recesywnie Komplementacja genetyczna polega na dopełniającym się działaniu produktów różnych genów. Geny komplementarne działają wspólnie, produkt jednego genu ma wpływ na produkt drugiego genu. 43  ALLELE WIELOKROTNE Najczęściej w populacji występują dwie alternatywne formy genu, które determinują kształtowanie określonej cechy. Niekiedy w wyniku mutacji dochodzi do powstania trzeciego, czwartego, piątego allelu, które warunkują tę samą cechę co allele pierwotne. Jeśli w populacji występuje więcej niż dwa allele danego genu, to mówimy, że są to ALLELE WIELOKROTNE. Allele wielokrotne charakteryzuje to, że: ❖ warunkują tę samą cechę, ❖ osobnik diploidalny może mieć tylko dwa allele genu, po jednym na każdym chromosomie homologicznym. 44 45 46 47 48 49  Schemat eksperymentu mającego na celu zaprezentowanie semikonserwatywn ej replikacji z 50 B-DNA jest najpowszechniejszą formą –bruzdy w helisie jest miejscami wysoce dostępnymi dla wszelkich ligandów np. białka. A-DNA to prawoskrętna, szersza i krótsza forma B-DNA, często spotykana w dwuniciowym RNA 51 Z-DNA, forma niestwierdzona in vivo, jest 52 53 54 55 56 57 58 59 60  Genofor – chromosom bakteryjny Inaczej zwany nukleoidem tworzony przez II rzędowe DNA, gdzie na każde 40 pętli przypada centralnie umieszczony fragment RNA 61 ROZDZIAŁ CHROMOSOMÓW W KOMÓRCE BAKTERYJNEJ Po zakończeniu replikacji kolistych chromosomów bakteryjnych powiązanych z błoną komórkową następuje interkalarny wzrost błon komórkowych i następuje wytworzenie poprzecznej ściany komórkowej (septy) rozdzielającej dwie pochodne komórki z pojedynczymi chromosomami. 62 Chromatyda - ramię chromosomu widocznego w metafazie. W wyniku replikacji każdy chromosom posiada dwie chromatydy, które następnie w wyniku podziału jądra komórkowego rozchodzą się do przeciwległych biegunów komórki i stają się samodzielnymi chromosomami. Każda chromatyda zbudowana jest z pojedynczej nici DNA połączonej z białkami – chromatyny. Chromatyna – włóknista substancja występująca w jądrze komórkowym, zbudowana z DNA, histonów i niehistonowych białek. Stanowi główny składnik chromosomów. Chromosom – forma organizacji materiału genetycznego wewnątrz komórki. Chromosomy są zbudowane z dwóch chromatyd siostrzanych (podłużnych jego części) połączonych w jednym punkcie centromerem (wyjątkiem są chromosomy powstałe po pęknięciu centromeru w trakcie podziału jądra komórkowego – pod koniec metafazy). 63 U organizmów wyższych – czyli eukariotycznych – przyjmuję się, że chromosomy zbudowane są z podjednostek Chromatyna DNA – 37 % histony – 37 % białka niehistonowe – 24 % RNA – 2 % + cząstkowe ilości polimeraz, nukleaz, ligaz 64 NUKLEOSOM – kompleks DNA z oktamerem histonowym. Wzdłuż podwójnego heliksu DNA rozmieszczone są HISTONOWE OKTAMERY złożone z dwóch cząsteczek każdego z 4 histonów: ❖ H2A ❖ H2B ❖ H3 ❖ H4 Odcinki łącznikowe są luźno związane z histonem H1. 65 BUDOWA CHROMATYNY: Rozkład nukleosomów i obszarów je przedzielających. Odległości między nukleosomami wynoszą około 200 nukleosomów, zaś na nukleosomy owinięty jest łańcuch o długości około 150 nukleotydów. 66 U organizmów wyższych występuje problem uzupełniających się dwóch podziałów oraz wymiany informacji w mejozie Mitoza – podział komórek somatycznych – rozmnażanie bezpłciowe – identyczność materiału genetycznego. Mejoza – redukcja – udział gamet lub typów płciowych (np. drożdże) PRZED mitozą musi dojść do replikacji DNA 67  Interfaza Cykl komórkowy składa się z interfazy – okresu pomiędzy podziałami komórki oraz samego podziału komórki czyli mitozy 68 Wyróżnia się trzy fazy: - Przedreplikację – G1 – czyli fazę między końcem mitozy a rozpoczęciem syntezy DNA - Replikację – S – czyli synteza DNA - Postreplikację – G2 – czyli czas pomiędzy końcem syntezy DNA a początkiem mitozy 69  Faza G1 Komórka wchodzi w tą fazę 2-krotnie mniejsza od komórki macierzystej, Następują intensywne procesy anaboliczne, wzmożona wymiana biochemiczna z otoczeniem, podwyższona wrażliwość na bodźce zewnętrzne Rośnie ilość składników komórkowych – białek, RNA, itd., powodując rozrost masy o objętości komórki Faza ta decyduje o całości cyklu – komórka rzadko dzieląca się praktycznie przebywa w tej fazie W późnej fazie G1 zlokalizowany jest sygnał R , punkt w którym komórka niezależnie od czynników zewnętrznych musi przejść do następnej fazy 70  Faza S Faza o stosunkowo stałej długości uwarunkowanej replikacją DNA , a ta przebiega ze stałą prędkością bez względu na warunki otoczenia Następuje dalszy rozrost komórki Odbywa się synteza histonów 71  Faza G2 Służy do bezpośredniego przygotowania do mitozy poprzez syntezę istotnych białek, szczególnie białek podziałowego wrzeciona (tubuliny) Następuję nadprodukcja składników niezbędnych do odtwarzania błony komórkowej w telofazie W późnej fazie aktywizuje się kinaza białkowa odpowiedzialna za zanik błony jądrowej i kondensację chromosomów 72  Faza G0 Stan spoczynkowy komórki – komórka funkcjonuje nie marnując energii na powielanie materiału genetycznego Zawiera bardziej skondensowaną chromatynę, inne rodzaje mRNA i białka nie występujące w aktywnie dzielących się komórkach Czas trwania - dowolny 73  Cechy kodu genetycznego Trójkowy Uniwersalny – odstępstwa możliwe tylko w mitochondriach i chloroplastach, jako jednostkach posiadających pewną autonomię genetyczną Niezachodzący – nukleotyd nie może być częścią 2 kodonów Bezprzecinkowy Wieloznaczny – (zdegenerowany) – aminokwas może nyć kodowany prze kilka trójek 74 75  UNIWERSALNOŚĆ KODU GENETYCZNEGO Do 1980r. uważano, że kod genetyczny jest uniwersalny tzn. taki sam we wszystkich organizmach. W 1980r. Odkryto, że mitochondria, które mają własne genomy (mDNA) wykorzystują kod genetyczny różniący się nieznacznie od standardowego, uniwersalnego kodu. Obecnie wiadomo, że niektóre organizmy jednokomórkowe używają kodu, który wykazuje odstępstwa od kodu uniwersalnego. Przykłady: AGA Arg Stop, Ser niektóre zwierzęta, mitochondria CGG Arg Tryp roślinne, mitochondria CUN Leu Thr drożdżowe, mitochondria AUU Ile Start niektóre prokarionty 76  Materiał genetyczny Teoretycznie, przyjmując prawidła ewolucji, DNA w genomie powinno być więcej u wyższych organizmów eukariotycznych a najmniej u wirusów i bakterii Jednak nie ma bezpośredniej zależności pomiędzy rozmiarami organizmu a ilością DNA w komórce 77  Heterogenność DNA Nici DNA ulegające prawie natychmiastowej renaturacji (łączeniu) odpowiadające DNA wysoce powtarzalnemu, satelitarnemu, istniejącemu w dużej ilości kopii Nici DNA ulegające wolniejszej renaturacji odpowiadająca DNA umiarkownie powtarzalnemu, posiada charakterystyczne sekwencje: - SINE - krótkie rozproszone powtórzenia - LINE – długie rozproszone powtórzenia, sekwencje niekodujące otoczone regionami bogatymi w pary AT Nici DNA renaturującego bardzo powoli, odpowiadające sekwencjom unikalnym, pozwalającym na syntezę dużych ilości białka w obecności jednej kopii genu. 78  Regiony podstawowe 5’ i 3’ flankujace Eksony – części kodujące genu, introny – części niekodujące CAAT –sekwencja, do której przyłączają się białkowe czynniki regulatorowe, traskrypcyjne 79 TATA – kaseta, box – miejsce przyłącznia się polimerazy RNA II  GENY nie podlegające regulacji (house-keeping genes) Należą do nich te, które ulegają expresji w ściśle określonych tkankach (różnicowanie) albo kodują białko wszechobecne. Są to z reguły geny konstytutywne, a ich expresja zależy wyłącznie od warunków środowiskowych. Posiadają cechy wspólne: - Stały i niski poziom traskrypcji - Brak kasety TATA - Często powtarzające się liczne niemetylowane pary CG - Obecność w niekodującym obszarze 5’ jednej lub wielu GC kasety (GGGGCGGG) – miejsca przyłączania się białka SP1 – jednego z pierwszych wykrytych czynników transkrypcyjnych u cukariotów 80  TRANSKRYPCJA Enzymatyczna synteza RNA w oparciu o matrycę DNA U Procariota proces zachodzi w cytoplazmie w obecności jednej polimerazy zbudowanej z 4 podjednostek głównych i jednej pomocniczej Region promotorowy u bakterii zbudowany jest z heksamerowego regionu Pribnow box z sekwencją TATAAT i drugiego heksamerowego umiejscowionego w pozycji -35 promotora 81 82 83 84 85 86 U Eucariota proces traskrypcji jest zdecydowanie bardziej skomplikowany, a co najważniejsze zachodzi w jądrze komórkowym 87 W trakcie dojrzewania do rRNA przyłączają się białka rybosomalne Po przyłączanie się 34 białek powstaje duża podjednostka Wędrujące z jąderka do cytoplazmy tworzące się 88 łańcuchy rRNA w 89  Polimeraza RNA II syntezuje prekursora mRNA, przyłączając się do kasety TATA, w obecności czynników transkrypcji TF II (A,B,D, E, F) Dodatkowo syntezuje częściowo lub w całości snRNA – mały jądrowy RNA – uczestniczący w obróbce mRNA (splicing) Bezpośrednio po rozpoczęciu transkrypcji na końcu 5’ mRNA przytwierdza się „czapeczka” cap element niezbędny dla translacji Pierwotne transkrypty mRNA są rozcinane przez specyficzną nukleazę na końcu 3’, a następnie polimeraza poli-A bez uzycia matrycy dobudowuje do 200 nukleotydów adenylowych – ogon poli-A odpowiedzialny za stabilność. Ogon nie jest obecny u bialek histonowych 90 Charakterystyczna budowa nukleosomów może mieć bezpośredni wpływ na transkrypcję na trzech poziomach – wiązania czynników niezbędnych dla 91 właściwego przyłącznia się polimerazy, inicjacji  SPLICING – wycinanie intronów Sekwencje GU i AG zwane są sekwencjami konsensusu (zgodności) Miejsce Adeninowe gdzie zahacza się koniec 5’ intronu tworzac lasso Istotny jest również udział małych cząstek RNA 92  93 Mechanizm usuwania intronów 94 95 96 97 98  Translacja Szczególnie jej inicjacja jest procesem silnie złożonym, wymagającym użycia czynników inicjujących eIF Sygnałem początkowym jest sekwencja AUG w mRNA oraz tRNA inicjatorowe 99 100 101 102 103 104 105 Gdy polipeptyd w trakcie syntezy zawiera ok 25 aminokwasów rybosom przemiesza się 106 Większość genów wyraża się jako białka zarówno wewnątrz jak i zewnątrz-komórkowe. Inne geny znajdują swoje odzwierciedlenie w przeróżnych formach RNA. Produkty kodowane przez geny są wytwarzane w ilościach określonych właściwościami strukturalnymi i funkcjonalnymi danej komórki. Regulacja ekspresji genów u Procariota zasadniczo odbywa się na dwóch poziomach: - Na poziomie transkrypcji poprzez regulacje liczby utworzonych cząsteczek mRNA - Na poziomie translacji poprzez regulacje liczby kopii łańcucha polipeptydowego Ale istnieje poziom trzeci – poprzez regulację aktywności końcowego produktu danego genu, np. poprzez kowalentną modyfikację produkowanych białek lub wpływ produktów końcowych na szlaki metaboliczne. 107 Geny prokariotyczne zorganizowane są w strukturalne i funkcjonalne jednostki zwane operonami 108 SCHEMAT ZMIAN ALLOSTERYCZNYCH I AKTYWNOŚCI REPRESORÓW POD WPŁYWEM INDUKTORA BĄDŹ KOREPRESORA W operonie laktozowym ß-galaktozydy funkcjonują jako induktory, które w połączeniu z represorem powodują utratę jego powinowactwa do operatora. Represor operonu tryptofanowego dopiero po połączeniu z tryptofanem, który w tym wypadku jest korepresorem, staje się aktywnym represorem zdolnym do wiązania się z operatorem operonu tryptofanowego. 109 Regulacja negatywna 110 Regulacja pozytywna 111  OPERON TRYPTOFANOWY GENY KODUJĄCE ENZYMY SZLAKU BIOSYNTETYCZNEGO TRYPTOFANU trp E syntetaza kwasu antranilowego trp D fosforybozyloantranilotransferaza trp C fosforybozyloantraniloizomeraza trp B syntetaza tryptofanowa α trp A syntetaza tryptofanowa ß Enzymy podlegają wspólnej, skoordynowanej regulacji. 112 W wyniku stałej ekspresji genu R powstają cząsteczki represora, które w obecności korepresora łączą się z operonem 113 Przy braku korepresora nie następuje aktywacja represora i następuje synteza endogennego tryptofanu 114  OPERON TREONINOWY Dla niektórych aminokwasów np. TREONINY i IZOLEOCYNY ciąg biosyntetyczny posiada pierwsze etapy wspólne, katalizowane przez te same enzymy. Następnie zachodzi rozgałęzienie ciągu i ze wspólnego prekursora odrębne enzymy prowadzą do syntezy treoniny i izoleucyny. D F H TREONINA A B C E G I IZOLEUCYNA Operon treoninowy złozony z 4 genów struktury jest reprymowany zarówno przez treoninę jak i leucynę. Jeden rodzaj REPRESORA może się łaczyć zarówno z treoniną jak i izoleucyną. 115 Regulacja ekspresji genów u Eukariota różne możliwości regulacji 116 117 118  Regulacja na poziomie matrycy – chromatynowe otoczenie genów Obszar DNA otaczający gen lub grupę genów ulegający ekspersji nazwano domeną funkcjonalną. Region domeny jest możliwy do oceny poprzez trawienie oczyszczonej chromatyny deoksyrybonukleazą I. DNA-aza I wyszukuje wystawione strefy DNA w chromatynie. DNA-aza I nie ma dostępu do głębiej upakowanch fragmentów nici DNA i stąd wywodzą się dwa pojęcia miejsc wrażliwych i nadwrażliwych Miejsca wrażliwe odpowiadają genom aktywnym – czyli konformacja chromatyny czyni je bardziej dostępnymi – dla np. polimeraz 119 ATENUACJA – system regulacji operonów represyjnych Polega na kontroli transkrypcji poprzez translacje. Ateunuator, o określonej długości par zasad , w transkrypnie RNA może utworzyć strukturę spinki działając tym samym jako terminator transkrypcji i w efekcie tworzy się krótszy transkrypt 120 Metylacja DNA polega na przyłaczaniu reszt metylowych do nukleozydów, głównie zreszta cytozyn. Metylacja może zmienic powinowadztwo DNA do czynników transkrypcyjnych, ułożenie nukleosomów w danym regionie chromatyny, oraz oddziaływanie histonu H1 z DNA – wyłacza funkcje genu. Metylacja jako proces odwracalny spełnia rolę w długoterminowej inaktywacji genu – istotny element różnicowania komórek Metylacja następuję natychmiast po replikacji w miejscach koplementarnych do zmetylowanych cytozyn na matrycowej nici DNA 121  Białka regulatorowe Zwane inaczej czynnikami transkrypcyjnymi - zdolne są do przyłaczenia się do DNA w miejscu specyficznych sekwencji i mogą przez to kontrolować poziom transkrypcji dodatnio lub ujemmnie. Jeden gen może być kontrolowany przez wiele białek regulatorowych Czynniki traskrypcyjne mają budowę modułową i składają się z domen białkowych pełniących określone funkcje : - Wiążące DNA - Odpowiedzialne za dimeryzację - Transaktywujące 122  Regulacja ekspresji genu w pozycji cis trans Komórki eukariotyczne kierują ekspresją genów głównie przez regulację wydajności traanskrypcji Wydajność transkrypcji może być regulowana przez sekwencje DNA zwane wzmacniającymi – enhancer - które poprzez wiązanie czynników transkrypcyjnych mogą stymulować transkrypcję określonego genu Te sekwencje, które zmniejszają wydajność transkrypcji nazywa się wyciszającymi - silencer Sekwencje wzmacniające mogą także modyfikować strukturę przestrzenna DNA lub stopień spiralizacji 123 Alternatywny dobór promotowa (regulacja przez specyficzność tkanki) 124 125 Regulacja posttranskrypcyjna – wycinanie intronów 126 127 Regulacja genów pod wpływem temperatury – białka szoku cieplnego (HSP) Komórki odpowiadają na podwyższanie temperatury wzmożoną syntezą grupy polipeptydów - head shock protein Do syntezy tych białek dochodzi również w wyniku działania innych czynników takich jak: Infekcje wirusowe Czynnik uszkadzające DNA Analogii aminokwasów Zmiana pH Etanol 128 Aktywacja genów szoku termicznego jest jedną ze zmian zachodzących w komórce w odpowiedzi na stres. Modyfikacja obejmuje równocześnie sam metabolizm i czas półtrwania organelli komórkowych. Aktywność metaboliczna jądra komórkowego jest w tym przypadku najistotniejsza. Proces syntezy DNA ulega spowolnieniu , kumulują się prekursory rRNA i zahamowane zostaje usuwanie intronów z hmRNA. Histony ulegają modyfikacji przez fosforylację (w normalnych warunkach proces ten przebiega podczas kondensacji chromatyny) W komórce zmienia się również przebieg procesów glikolizy i kumuluje się np. kwas mlekowy, podnoszony jest też poziom jonów Ca 129 130 131  Białka chaperonowe - opiekuńcze Chaperony to powolnie działające ATP-azy. Uczestniczą w ATP-zależnym procesie zwijania polipeptydów syntetyzowanych w komórce oraz dysocjacji i tworzeniu kompleksów białkowych zgodnie z zasadami termodynamiki Potrzebne są do tworzenia prawidłowej struktury oktamerów histonowych, do przenoszenia białek przez błony mitochondrialne i do przywracania ich właściwej konformacji wewnątrz mitochondriów Rosnące łańcuchy polipeptydowe po przejściu do światła reticulum wiążą się z chaperonami, pozostając dzięki temu w formie rozwiniętej – chaperony pomagają w uporządkowaniu struktur zapobiegając niepożądanym reakcjom w komórce. 132 133 134 Zmiennością nazywamy występowanie dziedzicznych lub niedziedzicznych różnic pomiędzy komórkami danego organizmu, pomiędzy osobnikami należącymi do tej samej populacji lub pomiedzy populacjami Zmienność dziedziczną podzielono na rekombinacje i mutacje Rekombinacja to każdy proces wymiany fragmentów DNA pomiędzy chromosomami homologicznymi lub dwuniciowymi helisami DNA Dzieli się na : - Homologiczną - Zlokalizowaną - Transpozycyjną Rekombinacja nie prowadzi do wytworzenia nowych alleli, ale do ich przetasowania i kombinowania genami 135 Rekombinacja prokariotów - Losowy dobór koniugantów - Rekombinacja w czasie koniugacji Rekombinacja eukariotow - Losowa segregacja chromosomów - Losowy dobór rodziców - Losowe łączenie się gamet 136 137 138 139 Rekombinacja zlokalizowana Dotyczy wymiany niehomologicznych, ale specyficznych fragmentów. Katalizowana przez białka ukierunkowane na ściśle określone sekwencje zasad - pozwala to na rekombinowanie wyłącznie pomiędzy ścisłe określonymi genami mającymi na „flankach” sekwencje sygnałowe U bakterii proces ten pozwala na wbudowywanie plazmidu w genom – a to jak wiadomo, dla właściwej replikacje musi zajść w ściśle określonym miejscu 140 Rekombinacja transpozycyjna – wbudowywanie transpozonów w nowe miejsce w genomie. Transpozon to ruchome elementy genomu zawierające geny kodujące traspozazę – enzym o właściwościach nukleazy Gen transpozazy ma wlasny promoror, który może wzmacniać ekspresję sąsiednich genów, lub wręcz zawierać w swojej sekwencji inne geny (transpozon złożony) Eukariotyczny transpozon ma budowę podobną do retrowirusów, drożdżowy np. koduje białka podobne do odwrotnej transkryptazy 141  Sekwencje insercyjne mają długość 1-2 kpz, gen transpozazy jest oskrzydlony 20-nukleotydowymi odwróconymi sekwencjami powtórzeniowymi. W rekombinacji transpozycyjnej wymagane jest istnienie specyficznej sekwencji w miejscu akceptorowym dla IS. Sekwencja ta podlega podwojeniu, a IS wbudowuje się pomiędzy podwojone fragmenty 142  MUTACJE Mutacja to dziedziczna zmiana powstała wskutek : zmianę genu w nowy allel – genowa, zmianę struktury chromosomu – chromosomowa strukturalna, zmianę liczby chromosomów – liczbowa, oraz zwielokrotnienie haploidalnego zestawu chromosomów - genomowa 143 Mutacja Cząsteczka DNA Zmiana na mała skalę w sekwencji Zmutowane DNA Mutacja genowa to zmiana sekwencji nukleotydu w obrębie genu Tranzycja – zamiana purynowej na purynowa, pirymidynowej na pirymidynowa Transwersja - zamiana purynowej na pirymidynową, pirymidynowej na purynową Delecje – wypadnięcie jednego lub kilku nukleotydów Insercje – wstawienie jednego lub kilku nukletydów 145 146 Mutacje genowe mogą prowadzić do: Zmiany sekwencji aminokwasów w polipeptydzie kodowanym przez zmutowany gen Do przerwania syntezy łańcucha polipeptydowego, jeżeli powstanie triplet nonsensowny Do mutacji niemej, jeżeli powstanie triplet synomiczny (podobny) 147 MUTACJA PUNKTOWA 148 Błąd w replikacji Rodzic Pokolenie I stopnia  niesynomiczna nonsensowna Pominięcie stopu synomiczna MUTACJE PROWADZĄCE DO ZMIANY FAZY ODCZYTU KODONÓW 151  Jeden z możliwych efektów działania mutagenu Zmieniony nukleotyd Skutek poślizgu replikacji Dodatkowa jednostka powtórzeniowa Delecja 3 nukleotydów Delecja 1 nukleotydu Aberacje chromosomowe Powstają w wyniku utraty ciągłości chromatydy lub chromosomu: Delecja – utrata fragmentu chromosomu Inwersja – odwrócenie fragmentu chromosomu Translokacja – przemieszczenie części chromosomu do innego Duplikacja – podwojenie A także powstawanie chromosomów kolistych wskutek pęknięcia i utworzenia lepkich końców 155  RÓŻNE TYPY MUTACJI STRUKTURALNYCH (ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH) TRANSLOKACJA DUPLIKACJA INWERSJA DEFICJENCJA Litery oznaczają obszary homologiczne. Po prawej stronie pokazana jest konfiguracja w mejozie u form heterozygotycznych pod względem aberracji. 156  POWSTAWANIE INWERSJI W WYNIKU ZAPLECENIA CHROMOSOMÓW I PEKNIĘCIA PĘTLI 157 Inwersja – czyli odwrócenie fragmentu chromosomu o 180 stopni Inwersja obejmująca odcinek chromosomu wraz z centromerem nazywa się pericentryczną (eucentryczną) Nie zawierająca centromeru paracentryczą (acentryczną) 158 159 Translokacje - przeniesienie fragmentu chromosomu w obrębie tego samego lub do innego chromosomu. Translokacje polegające na wzajemnej wymianie odcinków między chromosomami niehomologicznymi nazywamy translokacją wzajemną Duplikacje – podwojenie określonego chromosomu wiąże się z podwojeniem kopii genu – podwojenia mogą być bezpośrednimi powtórzeniami lub odwrócone względem siebie. Ocenia się że własnie duplikacje miały największe znaczenie w ewolucji 160 161 162 Chromosom kolisty – kiedy chromosom pęka, a jego końce łączą się ze sobą 163 Izochromosom – powstaje w wyniku nieprawidłowego, poprzecznego podziału centromeru metafazowego. Składa się on tylko z połączonych ramion krótkich lub długich 164 Aberracje chromosomów liczbowe – powstają w wyniku nierozdzielenia się (nondysjunkcji) par chromosomów homologicznych w czasie podziałów Aneuploidie – zwiększenie lub zmniejszenie diploidalnej liczby chromosomów o pojedynczy chromosom Euploidie – zwielokrotnienie całego haploidalnego zestawu chromosomów: - Autopoliploidie – zwielokrotnienie o ten sam zestaw chromosomów - Allopoliploidie – zwielokrotnienie o niehomologiczne chromosomy 165 166 Mutagenami nazywamy czynniki indukujące powstawanie mutacji o częstotliwości przekraczającej poziom mutacji spontanicznych Podzielono je na: - Fizyczne - Chemiczne - Biologiczne 167 Do chemicznych należą: - Kwas azotawy - Hydroksylamina - Związki alkilujące – sulfaniany, iperyt - Analogi zasad azotowych - Barwniki akrydynowe – oranż proflawina, akrylflawina - Wolne rodniki tlenowe - Nadtlenki - Policykliczne węglowodory aromatyczne …….. 168 - LEKI – cytostatyki (busulfan, cyklofosfamid) - antybiotyki o właściwościach cytostatycznych - Związki występujące w produktach spożywczych: Produkty pirolizy aminokwasów Mykotoksyny Środki konserwujące 169 Fizyczne mutageny: - Promieniowanie jonizujące X, alfa beta gamma, kosmiczne, - Promieniowanie niejonizujące UVA i UVB Biologiczne czynniki to - Niektóre wirusy DNA - RNA wirusy np. retrowirusy. 170  NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE CZYNNIKI MUTAGENNE NAZWA PRAWDOPODOBNY MECHANIZM DZIAŁANIA PROMIENIE Dimeryzacja tyminy -> zakłócenia w replikacji DNA; ULTRAFIOLETOWE Tworzenie nadtlenków w podłożu i cytoplazmie; (UV) PROMIENIE Naruszenie struktury DNA; rozbicie łańcucha DNA; JONIZUJACE (np. X i γ) KWAS AZOTOWY Dezaminacja zasad -> błędne podstawienie zasad III w czasie replikacji DNA; 5-BROMOURACYL Wbudowany w DNA na miejsce tyminy (lub cytozyny) -> błędne podstawienie zasad w czasie replikacji DNA; 2-AMINOPURYNA Wbudowywana w DNA na miejsce adeniny -> błędne podstawienie zasad w czasie replikacji; 171 Tworzenie par komlementarnych przez 5-bromouracyl Właściwości mutagenne 5-bromouracylu Powrót do tautomerycznego ketonu Przemiana tautomeryczna insercja Efekt mutagenny bromku etydyny Przy okazji wizualizacja barwienia DNA PRZYKŁADY INNYCH MUTAGENÓW: ❖ hydroksylamina ❖ iperyt azotowy ❖ dwuepoksybutan ❖ trójetylenomelamina ❖ proflawina ❖ MnCl2 ❖ formol 176 177 178 Mutanty drobnoustrojów dzieli się na 4 kategorie AUKSOTROFY – czyli komórki wymagające w środowisku do wzrostu składnika zbędnego dla komórek typu dzikiego (prototrof) – np. dla wytworzenia tryptofanu potrzebne jest 5 genów →operon tryptofanowy omawiany wcześniej MUTANTY WARUNKOWO LETALNE – czyli takie, które w pewnych warunkach nie rozwijają się, wydają się zupełnie normalne w warunkach permisywnych, lecz po przeniesieniu do warunków restryktywnych ujawnia się fenotyp mutacji – np. mutanty termowrażliwe (mutacja wywołuje błedy w konformacji białka, które w wyższych temperaturach traci strukturę a tym samym aktywność) 179 MUTANTY ODPORNE NA INHIBITORY – potrafiące znieść toksyczne działanie antybiotyków czy innych związków (mutacja może zmienić strukturę białka wrażliwego na czynnik (białko rybosomalne u E.coli odpornej na streptomycynę), lub białka odpowiedzialnego za transport inhibitora do komórki, np. metalu ciężkiego) MUTANTY REGULATOROWE – posiadające defekty w inhibitorach i innych sekwencjach regulatorowych (mutanty konstytutywne, które zapominają „wyłaczyć” ekspresję genów bez względu na warunki środowiska I oczywiście mutacje letalne 180 181 182 Naprawa bezposrednia Naprawa przez wycinanie Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów Łączenie końców niehomologicznych 183 184 SCHEMAT REPERACJI PRZEZ WYCINANIE. Kolejne stadia usuwania dimeru tyminowego z DNA: A- dimer tyminowy w jednym z łańcuchów DNA B- nacinanie nici DNA obok dimeru przez UV-endonukleazę C- synteza nowego DNA od wolnego końca 3’ i degradacja odcinka DNA przez polimerazę DNA I * Polimeraza DNA I kodowana jest przez gen pol A D- połączenie dosyntetyzowanego odcinka DNA przez ligazę. Odcinek dosyntetyzowany zakreskowany. 185 Usuwanie błędnie sparowanej zasady 186 przyłaczenie Odłaczenie i usuniecie 187 Naprawa przez wycinanie zasad azotowych 188 189 Naprawa przez wycinanie nukleotydów 190 191 192  Uszkodzony nukleotyd zniekształcający helisę cięcie 193 Naprawa pęknięcia przez ligazę DNA pęknięcie 194 195 196  Uszkodzony fragment uniemożliwia działania polimerazy. Białko RecA Silnie uwalniając geny pozwala uszkodzona na utworzenie mutasomu - matryca polimerazy V (aktywne UMU D i C) równocześnie wiążąc uszkodzoną jednoniciowa cząsteczkę DNA, a następnie pozwalając zajść obarczonej błedami replikacji aby w nornalmym obszarze znów Synteza DNA obarczonego błedem pozwolić „pracować” polimerazie III 197 Mutacje niestabilne - dynamiczne 198 Mutacje spontaniczne i indukowane Mutacje indukowane to takie, które powstają pod wpływem czynnika mutagennego 199 200 Do modyfikacji szczepów, obok mutacji, mogą służyć wszelakie metody podstawowe opierające się na procesach rekombinacyjnych (→ „przedszkole” inżynierii genetycznej) Po co: Poprawa wydajności produktu Przyswajania nowych, nietypowych substratów Zweryfikowania wymagań pokarmowych Poprawienie tolerancji na zmiany środowiskowe Biosynteza nietypowych produktów ubocznych 201  Rekombinacja Proces w którym dochodzi do pękania i ponownego łączenia łańcuchów polinukleotydowych 202 Dzielimy na : Rekombinacje homologiczną (ogólną) – zachodzącą między fragmentami DNA wykazującymi znaczną homologię sekwencji Odpowiada za crossing-over podczas mejozy oraz za naprawę DNA w komórce Rekombinacja umiejscowiona (nieuprawniona) – zachodząca między cząsteczkami DNA mającymi jedynie krótkie podobne obszar (w tym integracja genomów fagowych do chromosomów) Transpozycja – przeniesienie fragmentu DNA z jednej pozycji w genomie na inna 203  Rekombinacja homologiczna Pomiędzy różnymi cząsteczki W obrębie pojedynczej nici JEDEN Z MOŻLIWYCH MECHANIZMÓW REKOMBINACJI OGÓLNEJ Linie przerywane – obce DNA (DNA dawcy w koniugacji, transformacji); Linie ciagłe – DNA własne (genoforu biorcy); l i r – komplementarne nici DNA DNA dawcy i biorcy ustawiaja się tak, że odcinki homologiczne o niemal identycznej sekwencji zasad leżą obok siebie. DNA dawcy z wolnym końcem wnika do helisy DNA biorcy i zaczyna tworzyć strukturę trójniciową, czemu towarzyszy miejscowa denaturyzacja DNA biorcy. Inwazja pojedynczej nici DNA dawcy rozszerza obszar denaturacji. 205 Endonukleaza (en) nacina wolną pętlę DNA biorcy. Nie połaczony z nicią homologiczną odcinek DNA biorcy ulega strawieniu przez egzonukleazę (eg). Endonukleaza nacina nic dawcy w miejscu, gdzie nie wytworzyły się wiązania wodorowe. Brakujące odcinki nici DNA zostają zreplikowane, a poszczególne odcinki łaczy ligaza. Opisany schemat odnosi się do REKOMBINACJI NIEWZAJEMNEJ. 206  Rekombinacja umiejscowiona Dokładnie zbadana, opierająca się na malutkim fragmencie homologicznej sekwencji 207 Rekombinacja umiejscowiona Zarówno w DNA faga jak i genomie bakterii występują kopie miesca att Obie składające się z identycznej sekwencji centralnej zwanej O i sekwencji otaczających P i P’ (u faga) i B i B’ u bakterii. Integracja pomiędzy obszarami O powoduje integrację genomu faga do DNA bakterii  Kolista cząsteczka faga ma miejsce przyczepu attP złozone z odcinków POP’. W DNA E. coli występuje analogiczne miejsce attB o strukturze BOB’. Oba miejsca przyczepu mają wspólną 15-nukleotydową sekwencję rdzeniową O. Enzymy Int i IHF przeprowadzają zlokalizowaną rekombinację wyniku dwóch przesuniętych nacięć w obszarach O fagowym i bakteryjnym. Po połączeniu krzyżowym wolnych końców naciętych nici zachodzi integracja DNA fagowego do DNA bakteryjnego w postaci liniowej struktury profaga λ. Przeciwny proces wycinania profaga λ z DNA bakterii przeprowadzają trzy enzymy Int, Xis i IHF. 210  Rekombinacja umiejscowiona znalazła zastosowanie w GMO. Markerem w wektorach często stosowany jest gen odporności na kanamycyne. Gen kanR koduje syntezę fosfotransferazy neomycyny II i mimo braku toksyczności wobec zwierząt i ludzi zachodzi obawa przekazana go bakteriom układu pokarmowego. Tym samym wykorzystuje się rekombinazę Cre ulokowaną na drugiej kopii wektora, która po transformacji i ekspresji usuwa wątpliwy gen REKOMBINACJA NIEUPRAWNIONA a – insercja faga λ do genoforu bakterii (g) h – odcinki homologii. Poza tymi odcinkami DNA λ i DNA genoforu nie są homologiczne. b – integracja czynnika F z genoforem bakterii (g); IS – sekwencje insercyjne. DNA F i genoforu są, poza IS, niehomologiczne. c – przenoszenie transpozonu (Tn) z plazmidu P1 na inny plazmid P2. We wszystkich przypadkach rekombinujace struktury nie są komologiczne; homologia jest ograniczona do małych odcinków lub do IS. 1, 2, 3 – kolejne stadia rekombinacji. 212 Traspozycja Replikatywna Konserwatywna Transpozycja sama w sobie opiera się nie na rekombinacja klasycznej lecz na zdolności do przenoszenia fragmentu DNA z jednego miejsca na drugie Wydzielić tu można: -Transpozony DNA, które przenoszą się replikatywnie, czyli pierwotny transpozon zostaje na miejscu a w innym pojawia się jego kopia -Transpozony DNA, które przenoszą się konserwatywnie – pierwotny transpozon przenosi się w nowe miejsce w procesie wyciecia i wklenia -Retroelementy, które przenoszą się za pośrednictwem kopii RNA (z udziałem retrowirusów) 214  Aktywność integrazy Integracja dwuniciowego retroelementu do genomu gospodarza, która powoduje Asymetryczne cięcia pojawienie się czteronukleotydowej sekwencji powtórzeniowej po obu stronach nowego Utrata części elementu jednoniciowych retroelementu Uzupełnienie luk Duplikacja sekwencji jednoniciowych Transformacja to proces gdzie wyizolowany DNA wprowadza się do komórki biorcy Generalnie wymagane jest wprowadzenie podwójnej nici DNA, komórka musi być w stanie kompetencji – zmieniona struktura ściany komórkowej Fazy przyjęcia DNA: - Absorbcja, odszukanie przez DNA miejsca - Przyczepienie - Przeciskanie się DNA, rozplatanie, ponieważ rekombinować może tylko jedna nic, druga ulega degradacji - Poszukiwania homologii w genoforze biorcy (okres eklipsy) - Replikacja i powstanie transformanta KROKI PROWADZĄCE DO TRANSFORMACJI KOMÓRKI BAKTERYJNEJ PRZEZ EGZOGENNE DNA 217 Transdukcja – zachodzi wtedy, kiedy wykorzystywany jest „przenośnik” np. fag Dzielimy na: specyficzną – możliwa do zastosowania tylko dla jednego ściśle określonego genu i ogólna – umożliwia przenoszenie dowolnego fragmentu DNA 218  SCHEMAT TRANSDUKCJI DAWCA jest prototrofem, BIORCA – auksotrofem niezdolnym do syntezy czynnika wzrostowego. 219  Lizogenny dawca ulega lizie, a wyzwalające się cząstki fagowe zawierają, obok swojego, DNA dawcy ze znajdującym się na nim genem (wyznacznikiem). Zakażone komórki biorcy ulegają lizogenizacji i pomiędzy integrujacym się DNA faga a genoforem biorcy dochodzi do rekombinacji, w wyniku której biorca uzyskuje gen B, A, B, C sa to wyznaczniki genetyczne, określające zdolność (+) lub niezdolność (-) do syntezy jakiegoś metabolitu. 220  TRANSDUKCJA OGRANICZONA (a) i (b) - Fag λ rekombinuje z chromosomem bakterii obok locus genu gal. 221 (c) – Fag λ wyrekombinuje nieprawidłowo, czego rezultatem jest powstanie defektywnego faga zawierającego zamiast częsci swoich genów fragment chromosomu bakterii z genem gal. (d) i (e) – Defektywny fag integruje z chromosomem bakteryjnym na zasadzie rekombinacji pomiędzy przenoszonym przez siebie a obecnym w chromosomie genem gal. 222 TRANSDUKCJA OGÓLNA 223 Transdukcja poronna Kiedy wprowadzony DNA do komórki nie podlega procesowi integracji i pozostaje w stanie wolnym zachowując się jak plazmid – fenotypowy efekt autonomicznego fragmentu DNA Transfekcja Proces wprowadzenia nagiego DNA 224  KONIUGACJA U E. coli K 12. SCHEMAT DOŚWIADCZENIA LEDERBERGA I TATUM 225 226  Bakteria dawcy Hfr i biorcy F-. Komórka Hfr ma plazmid F zintegrowany ze swoim chromosomem (fragment zaciemniony). Cztery wybrane markery genowe A, B, N i R zaznaczono na odpowiednich pozycjach mapy. Komórka akceptorowa posiada recesywne (zmutowane) kopie tych samych genów a, b, n i r. Podczas koniugacji chromosom jest przerywany w obrębie sekwencji plazmidu F. Pojedyncza nic DNA jest przenoszona przez pilę. Zauważ, że ulega ona replikacji wewnątrz komórki biorcy, a synteza nowej nici zachodzi także w komórce dawcy w rejonie dystalnym w stosunku do F, co zaznaczono linia przerywaną. Jest to REPLIKACJA WEDLUG TOCZĄCEGO SIĘ KOŁA. 227  Kolejność i względna pozycja genów A, B, N i R jest oznaczona przez określenie liczby komórek biorcy, które uzyskały te wybrane markery genetyczne w róznych czasach po których przerwano koniugację. Jak to pokazano na wykresie przybliżona pozycja mapowa genu markerowego wynosi dla A – 8 minut, dla B – 17 minut, dla N – 36 minut, dla R – 54 minuty od poczatku przenoszenia. 228 KONIUGACJA POMIĘDZY BAKTERIAMI Hfr i F- 229  GENETYKA POPULACYJNA Zajmuje się krzyżowaniem organizmów, dziedziczeniem w naturze (uzależnionym od warunków środowiska) Zajmuje się poznawaniem praw rządzących strukturą genetyczną populacji (pula genetyczna wszystkich alleli). Oparta na modelach matematyki i statystyki. Ujmuje stosunek pomiędzy częstością genu a częstością genotypu w populacji panmiktycznej 230 Populacja panmiktyczna to taka populacja w której kojarzenie się par odbywa się mniej więcej na zasadzie doboru przypadkowego. Gdzie populacja to zbiór osobników tego samego gatunku zamieszkujących dany obszar w określonym czasie. Organizmy należące do tej samej populacji mogą kojarzyć się między sobą posiadając wspólną pule genową. 231  PRAWO HARDY’EGO - WEINBERGA Stwierdza, że częstość występowania różnych genotypów w populacji jest stała i zalezna jedynie od częstości występowania alleli w populacji. 232 233  PULA GENOWA Całkowite wyposażenie genetyczne populacji. Osobniki posiagają allele wybrane losowo z tej puli genowej. Równowaga Hardy’ego – Weinberga jest średnią spodziewanych częstości genotypów obliczoną z częstości alleli ustawionych w tej samej populacji. LOSOWE KOJARZENIE to: wyrównany sukces reprodukcyjny brak skutków selekcji brak migracji oddziaływujących na poszczególne genotypy EFEKTY ZAKŁÓCAJĄCE dobór (selekcja) migracja kojarzenie nielosowe (selektywne) subpopulacyjne mutacja dryf 234  MUTACJA A DOBÓR NIEFUNKCJONALNE ALLELE SĄ RECESYWNE, WIĘC DOBÓR DZIAŁA TYLKO PRZECIWKO HOMOZYGOTOM, KTÓRE WYSTĘPUJĄ Z CZĘSTOŚCIĄ q2. W DIPLOIDALNEJ POPULACJI U N OSOBNIKÓW WYSTEPUJE 2N ALLELI. ZAKŁADAJĄC, ŻE CZĘSTOŚĆ MUTANTÓW q JEST NISKA, WÓWCZAS NOWYCH MUTACJI BĘDZIE 2pNµ gdzie: µ - tempo mutacji na pokolenie p – częstość funkcjonalnych alleli DOBÓR USUNIE 2Nsq2 ZMUTOWANYCH ALLELI s – współczynnik selekcji przeciwko homozygotom (s = 1 dla recesywnych alleli letalnych) 235 W RÓWNOWADZE 2pNµ = 2Nsq2 ZWYKLE ZAKŁADA SIĘ, ŻE p = 1 W PRZYPADKU DZIELENIA PRZEZ 2N DAJE: µ = sq2 q2 = µ / s q = ‫( ך‬µ / s) JEŚLI NIE MA DOMINACJI, A HETEROZYGOTY PODLEGAJĄ DOBOROWI 0,5 S WÓWCZAS: Q=2Μ/S DOBÓR USUWA WADLIWE ALLELE, A RÓWNOWAGA CZĘSTOŚCI Q WYSTAPI WTEDY, KIEDY TEMPO USUWANIA PRZEZ DOBÓR WADLIWYCH ALLELI JEST RÓWNE TEMPU POWSTAWANIA MUTACJI. 236 Częstość nowych mutacji można wyliczyć ze wzoru 237 238 239 240 241 Izolacja Zjawisko ograniczenia krzyżowania i zahamowania przepływu genów pomiędzy populacjami 242 Dobór naturalny 243 Migracja Zmiana częstości allela jednym pokoleniu w efekcie migracji określonej frakcji genów (m) 244 Dryft genetyczny Statystyczne, losowe zmiany częstości genu, które zachodzą w małej populacji Odchylenia te często prowadzą do nieodwracalnych zmian genetycznych w populacji. Działanie dryftu prowadzi do utrwalenia jednego a alleli z całkowitym wykluczeniem drugiego 245  DRYF – PRZYPADKOWA RÓŻNICA W PRZEKAZYWANIU ALLELI MIĘDZY POKOLENIAMI WARIACJĘ CZĘSTOŚCI ALLELI OTRZYMUJE SIĘ Z ROZKŁADU DWUMIANOWEGO I MOŻNA JĄ OBLICZYĆ: WARIACJA S2 CZĘSTOŚCI q DWÓCH ALLELI a WYNOSI S2 q = (p0 q0) / 2N p0, q0 – początkowa częstość dwóch typów allelu Po czasie t pokoleń wariacja będzie wynosić: S2 q = p0 q0 { 1 – [1 – 1/(2N)]t} ZMIANA PROPORCJONALNA ZALEŻY OD POCZATKOWEJ CZĘSTOŚCI ALLELI. RZADKIE ALLELE SĄ PODATNE NA DRYF. 246  DRYF JEST WAŻNY ODGRYWA WAŻNĄ ROLĘ W USUWANIU LUB PROMOWANIU BARDZO RZADKICH ALLELI, SZCZEGÓLNIE NOWYCH KORZYSTNYCH MUTACJI ZANIM SIĘ USTABILIZUJĄ, PONIEWAŻ DRYF MA WIĘKSZE WPŁYW NA PRZEKAZYWANIE RZADKICH ALLELI NIŻ DOBÓR. DRYF ODPOWIADA ZA ZMIANĘ CZĘSTOŚCI NEUTRALNYCH MUTACJI, KTÓRE ZNAJDUJĄ SIĘ BARDZIEJ POD WPŁYWEM DRYFU NIŻ DOBORU. PRAWDOPODOBIEŃSTWO USTABILIZOWANIA SIĘ W POPULACJI NOWYCH NEUTRALNYCH MUTACJI WYNOSI 1 / (2Ne) Ne – efektywna wielkość populacji – liczba osobników biorących udział w rozrodzie, a nie liczba wszystkich samic i samców. 247 248 249 Selekcja 250  LITERATURA 1. Gajewski W. GENETYKA OGÓLNA I MOLEKULARNA 2. Praca zbiorowa pod red. Piotra Węgleńskiego GENETYKA MOLEKULARNA 3. P.C. Turner, A.G. McLennan, A.D. Bates, M.R.H. White, BIOLOGIA MOLEKULARNA. KRÓTKIE WYKŁADY 4. P.C.Winter, G.I. Hickey, H.L. Fletcher GENETYKA. KRÓTKIE WYKŁADY 5. Brown T.A. GENOMY 6. Inna, byle w temacie 251