Biologia Molekularna - Kolokwium 1 PDF
Document Details
Uploaded by SuperiorAlien
Cardinal Stefan Wyszyński University in Warsaw
Tags
Summary
Ten dokument przedstawia notatki dotyczące biologii molekularnej, w tym zagadnienia takie jak budowa i funkcje DNA oraz RNA. Zawiera również informacje na temat genomów i polimorfizmów.
Full Transcript
Wykład 1 – wstęp do biologii molekularnej 1. Biologia molekularna 6. Elementy budujące kwasy nukleinowe to interdyscyplinarna dziedzina nauki Zasady azotowe budujące nukleotydy: zajmująca się wyjaśnian...
Wykład 1 – wstęp do biologii molekularnej 1. Biologia molekularna 6. Elementy budujące kwasy nukleinowe to interdyscyplinarna dziedzina nauki Zasady azotowe budujące nukleotydy: zajmująca się wyjaśnianiem zjawisk biologicznych poprzez ustalanie budowy i Purynowe, mają dwa skondensowane funkcji cząsteczek biorących udział w pierścienie pirymidyny (6 węgli w pierścieniu) i procesach życiowych. imidazolu (5 węgli w pierścieniu) Nauka o strukturze, funkcji i regulacji Zaliczamy od nich adeninę i guaninę funkcjonowania cząsteczek wchodzących w skład organizmów żywych i archeologicznych Głównie DNA, RNA i białek. 2. Genom to ogół materiału genetycznego (kwasu nukleinowego niosącego informację genetyczną) zawartego w pojedynczej części składowej (komórce, cząsteczce wirusa) organizmu. Największy genom w przyrodzie należy Pirymidynowe, ich szkieletem jest pirymidyna, do paproci Tmesipteris truncata; zawiera aż heterocykliczny związek aromatyczny, który przy 160,45 Gbp (giga [miliard] par zasad) różnych węglach przy pierścieniu głównym ma różne Najmniejszy genom w przyrodzie należy podstawniki do grzyba Encephalitozoon intestinalis; zawiera Zaliczamy do nich cytozynę, uracyl i tyminę tylko 0.0023 Gbp – 2.25 Mpz (mega [milion] par zasad) 3. Rodzaje DNA mtDNA – DNA mitochondrialne nDNA – DNA jądrowe cpDNA – DNA chloroplastowe 4. Porównanie komórki prokariotycznej z eukariotyczną Pentozy (cukry) budujące nukleotydy: β-D-ryboza, lewoskrętny, pięciowęglowy cukier prosty będący aldozą β-D-2-deoksyryboza, lewoskrętny, pięciowęglowy cukier prosty będący aldozą, różni się atomem wodoru przy drugim węglu w pierścieniu 5. Nowe organellum – eksluzosom zawiera DNA pozachromosomalne na zewnątrz jądra komórkowego ssaka W wyniku połączenia jednej z pentoz i jednej z Kodonami stop, kończącymi transkrypcje są zasad azotowych wiązaniem n-glikozydowym powstaje struktury spinki od włosów lub kodony bogate w uracyl. nukleozyd U eukariontów występują zarówno eksony jak i introny Aby otrzymać nukleotyd, powstały nukleozyd Kodonami start, rozpoczynającymi transkrypcje u należy połączyć wiązaniem estrowym z grupą eukariontów są kodony AUG. fosforanową, w zależności od ilości reszt wyróżniamy mono-, di- i tri- fosforany. Kodonami stop, kończącymi transkrypcje są kodony UAA, UAG, UGA. Kwasy nukleinowe (DNA) są zbudowane z deoksynukleotydów: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (w skrócie 8. Pytania pod koniec określane łącznie jako ddNTP) Biologia molekularna to nauka o: Kwasy rybonukleinowe (RNA) są zbudowane z A Strukturze cząsteczek (DNA, RNA, białek…) nukleotydów: ATP, GTP, CTP, *UTP B Funkcji cząsteczek (DNA, RNA, białek) *W RNA NIE WYSTĘPUJE TYMINA, TYLKO URACYL C Wyłącznie transkrypcji genów 7. Genom bakteryjny a eukariotyczny W skład kompletnej cząsteczki DNA wchodzą: Bakterie nie posiadają intronów (sekencji A Nukleotydy np. dATP i dTTP niekodujących, genów które nie kodują żadnego B Nukleotydy np. dATP i dUTP aminokwasu). Kodonami start, rozpoczynającymi transkrypcje u bakterii są kodony CAT lub CGT (zawsze z G lub A). Wykład 2 - Polimorfizm i anal izy kodu genetycznego 1. Zmienność genetyczna to naturalne różnice sekwencji DNA 3. Nowe biocząsteczki – glikoRNA (genotypu) organizmów jednego gatunku. inaczej, glikozylowane (z resztami Jeden organizm może być taki sam fenotypowo, cukrowymi) cząsteczki RNA, które występują na ale mieć różny genotyp, który jest indywidualny i powierzchni komórek osób z chorobami niepowtarzalny u innych osobników autoimmunologicznymi Polimorfizm na poziomie DNA to wynik mutacji 4. Long noncoding RNA – długie niekodujące kwasów nukleinowych oraz błędów w rekombinacji RNA (lncRNA) loci. stanowią 2% całego RNA, i pełnią Może dotyczyć zmian jednego nukleotydu (SNP – single funkcje w regulacji ekspresji genów związanych nucleotide polimorphism) lub dłuższych sekwencji z rozwojem nowotworów (mikrosatelitarnych) Są wysoce tkankowospecyficzne, dlatego mogą Polimorfizmy SNP są dziedziczone po być użyteczne w terapiach celowanych rodzicach, przykładem choroby genetycznej SNP jest LncRNA mogą działać na 3 sposoby: hemochromatoza (nadmiar żelaza), dochodzi do nadmiernego wchłaniania żelaza z pożywienia i Jako przewodniki kierujące kompleksy odkładania się go w tkankach, przy jednoczesnym modyfikujące chromatynę do określonych lokalizacji w braku wiązania żelaza w hemie erytrocytów genomie w celu regulacji genów, może być również Możliwe są 3 mutacje powodujące hemochromatozę biomarkerem w prognozie nowotworów. Działa na zasadzie sekwencyjnego dopasowania DNA' Innym polimorfizmem SNP jest polimorfizm genu NF1, który koduje białko neurofibrominę, który negatywnie reguluje szlak Ras/MAPK, odpowiadający za komunikację między receptorem na powierzchni komórki a DNA w jądrze. NF1 ma wysoki współczynnik mutacji, mutacje tego genu zaburzają podziały komórkowe i rozwój układu nerwowego, powodując nerwiakowłóknowatość. Polimorfizmem SNP jest również polimorfizm genu NF2, normalnie koduje on białko neurofibrynę 2 (schwannominę/białko Merlin), która jest białkiem Jako dynamiczne rusztowania dla kofaktorów, budującym cytoszkielet, łączy filamenty aktynowe do ważnych w procesie transkrypcji. błony komórkowej. Działa jak centralna platforma dla kofaktorów, które Mutacje tego genu powodują rozwój Schwannomay łącząc się, wpływają na przebieg transkrypcji i translacji nerwu przedsionkowo-ślimakowego poprzez nieprawidłową syntezę białka Merlin Procesy zachodzące na poziomie biologii molekularnej leżą u podstaw większości mechanizmów rozwojowych w komórkach w tym: - replikacji - transkrypcji - translacji 2. Epigenetyka to ingerencja pozagenetyczna, na ogół środowisko, czynniki zewnętrzne, uwarunkowania zewnętrzne wpływające na pojawienie się danego białka (ekspresja) Jako przynęty dla czynników transkrypcyjnych, które 6. Pytania na koniec blokują transkrypcje, poprzez wychwytywanie Polimorfizm SNP: inhibitorów, czego efektem może być kontynuacja A dotyczy pojedynczych zmian dNTP w sekwencji DNA transkrypcji ale też brak jej startu B występuje w sekwencji genu NF1 C może być tylko dziedziczny, nigdy nabyty Polimorfizm można badań na podstawie: A analizy gDNA B analizy mtDNA C analizy farmakogenów, np. CYP2D6 5. Farmakogeny to geny odpowiedzialne ze prawidłowy metabolizm leków Wykład 3 - Regulacja procesów replikacji DNA i RNA (SARS-COV-2), naprawa DNA 1. Mechanizm replikacji DNA Replikacja zachodzi w fazie S cyklu komórkowego Naprawa pęknięć jednoniciowych przez wycinanie i resyntezę odbywa się dzięki naprawię: Mechanizm replikacji DNA, najprawdopodobniej jest przez wycinanie zasad (BER) semikonserwatywna przez wycinanie nukleotydów (NER) U eukariontów występuje wiele miejsc replikacji, błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) inaczej oczka replikacyjne naprawę bezpośrednią (DR) Wyróżniamy trzy fazy replikacji: System łączenia końców niehomologicznych - aktywacja - elongacja Białka KU rozpoznają -terminacja pęknięcia i zbliżają do Replikacja DNA opiera się na dwóch niciach: siebie pęknięte końce dsDNA Wiodącej, jest to nowosyntetyzowana nić DNA, która powstaje w sposób ciągły Zawiera ona pojedynczy RNA primer, syntezowany przez prymazę, od którego zaczyna się proces tworzenia nici ciągłej poprzez dobudowywanie do niego nukleotydów przez polimerazę. Opóźnionej, druga nowopowstała nić podczas Białko XRCC4 replikacji DNA, składa się z wielu połączonych ze sobą aktywują ligazę i fragmentów Okazaki, za łączenie się fragmentów w stymulują adenylację jednorodną nić odpowiedzialna jest ligaza DNA 1. 5’ końców Inne białka biorące udział w replikacji DNA Ligaza odtwarza - Helikaza; rozrywa wiązania wodorowe między dwuniciowe DNA sparowanymi nićmi DNA przy widełkach replikacyjnych - Topoizomeraza; usuwa superzwinięcia i Inne białka uczestniczące w NHEJ: stabilizuje proces Białko MRE11 – białko o aktywności endo- i Polimerazy DNA różnią się w zależności od tego czy egzonukleazy organizm jest: Białko 53BP1 – ogranicza ono resekcje HR i promuje NHEJ Prokariotyczny, zawiera on polimerazy DNA I, II i III Eukariotyczny, zawiera on polimerazy DNA α (alfa), ε (epsilon), δ (delta) Kluczowym kompleksem białkowym odpowiedzialnym za zatrzymanie replikacji jest 55LCC 2. Mechanizmy naprawczę DNA Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSB - DNA double strand breaks) odbywa się za pomocą 3 mechanizmów -Rekombinacja homologiczna (HR) - Transpozycja (Tn) - System łączenia końców niehomologicznych (NHEJ) Naprawa przez wycinanie i resyntezę (ER) BER – naprawa przez wycinanie zasad MMR – naprawa błędnie sparowanych nukleotydów Źle sparowane pary są rozpoznawane przez kompleks MutS i rekrutowany jest kompleks MutLα do uszkodzonej nici, razem tworzą kolejny kompleks. Po zauważeniu uszkodzonej zasady, zostaje ona Kompleks PCNA stymuluje aktywność usunięta przez glikozylazę DNA endonukleolityczne PMS2 – jednostki MutLα, która tnie Powstaje miejsce AP, do którego przyłącza się w miejscu 5’ miejsca złego sparowania. endonukleazy APE EXO1 nukleaza jest rekrutowana i poszerza cięcie w Następnie polimeraza dołącza prawidłowy nukleotyd kierunku 3’ Polimeraza DNA ß, ɛ lub δ wraz z ligazą DNA Polimeraza stymulowana przez PCNA dobudowywuje odbudowywuje luki brakujące nukleotydy a całość jest łączona za pomocą NER – naprawa przez wycięcie nukleotydu ligazy I (https://www.researchgate.net/figure/Schematic-representation-of-MMR- Schematic-representation-of-MMR-Mismatched-base-pair-is_fig3_341945872) 3. Regulacja molekularna replikacji u SarsCov-2 Wirusy dzielimy na: Wirusy: Osłonkowe, z otoczką lipdowo białkową (poza kapsydem) Bezosłonkowe, z samym kapsydem Wirusy ssDNA – wirusy bezosłoknowe; parwowirusy Uszkodzone nukleotydy powodują zniekształcenie HPV-B19 helisy DNA Wirusy dsDNA – wirusy bezosłonkowe; wirusy Wszystkie nukleotydy, które są dotknięte skrzywieniem brodawczaków człowieka HPV-16, adenowirusy Adv12 ulegają usunięciu przez endonukleazy Następnie polimerazy DNA i ligazy DNA odbudowywują Wirusy ssRNA – wirusy, których RNA musi zostać luki przy pomocy polimerazy TLS, która potrafi przepisane na komplementarną nić RNA, zanim może syntezować nić na uszkodzonej matrycy DNA być matrycą do syntezy komponentów budulcowych wirusa; wirus grypy i wirus wścieklizny. Wirusy +ssRNA ulegają translacji na -ssRNA, które następnie replikują się na kilka +ssRNA ulegających enkapsulacji. Wirusy dsRNA – wirusy bezosłonkowe; rotawirusy Replikacja RNA u wirusów. białek niestrukturalnych, są one zlokalizowane w otwartej ramce odczytu 1a i otwartej ramce odczytu 1b, kodują one kluczowe enzymy w replikacji RNA wirusa. Są nimi: -Nsp3; proteaza -Nsp5; proteaza Mpro - Nsp12; polimeraza RNA zależna od RNA -Nsp13; helikaza 4. Pytania pod koniec Genom SARS-COV-2 składa się z: Białka uczestniczące w replikacji wirusów: A ośmiu cząsteczek RNA (-) -ORF1a i 1b – geny białek niestrukturalnych B jednej cząsteczki RNA (+) -Polimeraza RdRp – niezbędna, aby jedna nić C jednej cząsteczki DNA RNA wirusa powieliła się na miliony kopii -Proteaza Mpro – uaktywnia polimeraza| -Polimeraza RNA zależna od RNA – potrzebuje Naprawa błędów typu NER w ssDNA dotyczy Nsp5 – *proteazy Mpro powstaje polipeptyd pp1a/b usunięcia: *proteaza Mpro (3CLpro) umożliwia hydrolizę polipeptydu A całego fragmentu pz na kolejne funkcjonalne peptydy wiralne (m.in. polimerazę RdRp) B pojedynczych pz Genom wirusa SarsCov-2 składa się z genów: C korekty 3' → 5' białek strukturalnych, są to białka strukturalne i pomocnicze wirusa, które odgrywają pośrednią rolę w funkcjonowaniu wirusa Kodują one białko kolca, białko błonowe oraz białko nukleokapsydu i białko płaszcza Wykład 4 – białkowe markery polimorfizmu – immunodetekcja 1. Markery białkowe 4. Białka izoenzymatyczne Białka mogą występować pod 4 różnymi różnią się budową podjednostek formami: aminokwasów (kodowanych przez 1 lub więcej genów) i katalizują te same reakcje Struktura 1-rzędowa; łańcuch polipeptydowy z końcem biochemiczne n (z grupą aminową NH3+) i z końcem c (z grupą Izoenzymy to podobne formy enzymu, różniące karbonylową -COO- się konformacją, katalizują one tą samą reakcję, Strukturą 2-rzędowa; łańcuch polipeptydowy złożony w ale różnią się sekwencją aminokwasów. helisa α lub harmonijkę β, stabilizowany wiązaniami Przykładowym białkiem jest fosfoglukomutaza (PGM) wodorowymi między grupą karbonylową (wolnym złożona z 1 lub 2 polipeptydów, a jest kodowana przez 1 atomem tlenu) a grupą aminową (atomem wodoru) gen. Struktura 3-rzędowa; struktura przestrzenna złożona z Aktywna jako monomer białek 2-rzędowych (łańcuch β hemoglobiny) Struktura 3-rzędowa PGM składa się z: Struktura 4-rzędowa; kilka podjednostek białek - 1 polimeru (peptydu); homozygota struktury 3-rzędowej (4 podjednostki: α 1 i α 2 [1 prążek na żelu] oraz β 1 i β 2 tworzą pełnoprawną hemoglobinę) - 2 różne polimery; heterozygota [2 prążki na żelu] 2. Marker genetyczny to, (1) dowolna cząsteczka molekularna (białko, Izomeraza glukozowo-6-fosforanowa (GPI), jej gen lub segment DNA o znanym położeniu w struktura jest kodowana przez jeden lub wiele genów: chromosomie), którego obecność można łatwo - 1 polimeru (polipeptyd); homozygota zidentyfikować [1 prążek na żelu] lub - 2 różne polimery (polipeptydy); heterozygota (2) cząsteczka (białko lub gen) warunkująca [3 prążki na żelu] łatwo wykrywany fenotyp i wykorzystywana do Jej aktywność katalityczna wymaga połączenia dwóch wyróżnienia posiadających go osobników lub polipeptydów – aktywna jako dimer komórek Jest aktywnym enzymem w glikolizie 5. Główne antygeny Sars-Cov-2 Antygenem może być zarówno cząsteczka cukrowa Białko nukleokapsyd NCP – wysoka czułość białko, DNA lub RNA Białko kolca (spike) – wysoka swoistość Epitop to część Około 90 AA bierze udział w wiązaniu S1 z rozpoznawana przez receptorem gospodarza (ACE2): - 6 kluczowych immunoglobuliny reszt AA (Leu455, Phe486, Gln493, Ser494, Asn501 i Tyr505) Spośród nich, tylko 1 reszta jest identyczna z 3. Pozyskiwanie białek z materiału SARS-CoV (poprzednim wariantem). organicznego Ludzki Sars-Cov-2 ma 4 dodatkowe aminokwasy między podjednostką S1 i S2, które bardzo Z tkanek zwierzęcych pobiera się komórki i poddaje się zwiększają powinowactwo do receptora ACE2 je wstępnej lizie. Następnie zachodzi liza błon i degradacja DNA 6. Metody immunodetekcja Eliminuje się pozostałą resztę komponentów Te zjebane testy ja nie wiem ocb komórkowych Zebrane białka przetrzymuje się w stabilizującym 7. Markery białkowe i DNA buforze pozyskane z materiału organicznego mają ogromne znaczenie w: -diagnostyce molekularnej - analizie polimorfizmów 8. Pytania pod koniec Markery izoenzymatyczne Za pomocą testu ELISA można wykryć A Są kodowane przez jeden lub więcej genów A Immunoglobuliny B To markery DNA B Antygeny białek S1 i NCP C Umożliwiają analizy polimorfizmu w C Jakikolwiek antygen populacjach Wykład 5 – molekularna regulacja metabolizmu – receptory ACE 1. Regulacja metabolizmu na poziomie Struktura genotypu (mutacje, polimorfizmy komórkowym DNA, błędy w dziedziczeniu) Homestaza Wpływ czynników zewnętrznych na ekspresje to stałość warunków w komórkach, czyli jak genów (cząsteczki regulatorowe, hormony, patogeny) najefektowniej przeprowadzać reakcje metaboliczne z Taka regulacja zachodzi u nicieni, występują u nich dwa jak najmniejszym wydatkiem energii geny, lin 4 i lin-14 odpowiedzialne za specjalizacje Enzymy, które potrzebują ATP do działania: komórkową. Gen lin-4 działa sprzężeniem zwrotnym - kinazy biłkowa (PKA, PKC - ujemnym na gen lin-14. zależna od wapnia) Mutacje powodujące utratę funkcji w genie lin-4 - P3 (trifosforan inozytolu), Ca2+ - powodują znaczny niedorozwój. rola sygnałowa, stres Gen lin-14 jest regulowany przez mirRNA lin-4 i - białko G uniemożliwia jego akumulacje białka LIN-14 - replikazy Białko DICER jak rozpozna miRNA lin-4, tnie go na - polimerazy kawałki. - helikazy Po związaniu się mRNA lin-4 do RNA nie zajdzie ekspresja genu lin-14 Procesy, które są energochłonne: -Transport aktywny 2. Bakteriofagi -Podziały komórkowe Wyróżniamy dwa rodzaje fagów Homeostaza na przykładzie organizmu człowieka: Lityczne; zbudowany jest z główki, tułowia, - pH krwi – [7,35-7,45] nóżek, cząsteczki RNA oraz receptora RBP, który - ciśnienie tętnicze – [80-120mmHg] odpowiada za rozpoznawania receptorów na powłoce - ciśnienie osmotyczne – [6,5 atm] bakteryjnej. - CO2 we krwi – [22-28 mmol/l] Po pozytywnym rozpoznaniu bakteriofag przekazuje - glukoza we krwi – [3.9 do 5,5 mmol/l] swój materiał genetyczny do komórki, gdzie jego - temperatura ciała – [36,3-37,3 C] elementy strukturalne się replikują Cały proces kończy się lizą komórki W celu utrzymania homeostazy, wykorzystywana jest reakcja sprzężenia zwrotnego: Lizogeniczne; integrują swój genom z chromosomem bakterii, występują w ten sposób w Ujemne; wysokie stężenie produktu w szlaku formie profaga. powoduje wyhamowanie syntezy tego produktu W dobrych warunkach fizjologicznych i energetycznych Sprzężenie zwrotne ujemne kontroluje stężenie danych zachodzi ekspresja genów zintegrowanego faga i hormonów w organizmie dochodzi do wytworzenia genów kodowanych przez Dodatnie; wysokie stężenie produktu w szlaku fagowy genom. powoduje kontynuacje syntezy tego produktu Terapie fagowe Sprzężenie zwrotne dodatnie nie jest częste w organizmie Zakażenia skóry w terapiach wywołanych przez s. aureus Molekularne podstawy regulacji metabolizmu Zakażenia przewodu pokarmowego przez E.coli i Regulacja epigenetyczna ekspresji genów Salmonella (lncRNA, miRNA, metylacja DNA, deacetylacja histonów) Onkologiczne: wykorzystanie bakteriofagów do Metylacja jest silencerem, ponieważ dołączenie grupy selektywnego atakowanie komórek nowotworowych – metylowej do łańcucha DNA, powoduje usztywnienie rola miRNA w bakteriofagu PP7 i terapia raka wątroby struktury DNA. Inżynieria fagowa Typy szczepionek: Próby zastosowania miRNA do zahamowania -żywe szczepionki atenuowane proliferacji komórek nowotworowych. -szczepionki atenuowane, które są organizmami zabijanymi chemicznie lub termicznie 3. Układ hormonalno-enzymatyczny RAAS -szczepionki podjednostkowe, które są Wirus Sars-Cov-2 ma jedną cząsteczkę RNA otoczoną wykonane za składników patogenu, takie jak białka, otoczką wirus. Jego kolce są zbudowane z peptydy lub materiał genetyczny podjednostek S1 i S2. Do szczepionek dodawane są metale ciężkie Podjednostka S1 ma wbudowany receptor RBD, który (adiuwanty), które mają na celu jest kompatybilny z receptorem ACE 2. - wzmocnić odpowiedź immunologiczną Receptor ACE 2 konwertuje angiotensynę typu II do - zorientowanie odpowiedzi immunologicznej z angiotensyny 1-7, która następnie łączy się z komórkowej na humoralną receptorem Mas, wtedy dochodzi rozszerzenie naczyń, - zmniejszenie dawki potrzebnego antygenu i działanie ochronne na naczynia, hamowanie uszkodzeń liczby wstrzyknięć płuc i powstawania odm. Modyfikacje zasad nukleozydowych mRNA Receptor RBD Sars-Cov-2 łącząc się z receptorem przeciwko COVID-19 ACE 2, uniemożliwia konwersje Ang 2 w Ang 1-7, przez co Ang 2 łączy się z receptorami AT1R i AT2R co RNA ssaków różni się od RNA prokariontów. powoduje skurcz naczyń krwionośnych, zapalenia, RNA prokariontów dodatkowo jest ono bardzo włókniaki, uszkodzenia płuc i odmy. niestabilne, i szybko zostaje rozkładane przez komórki, przed wywołaniem reakcji immunologicznej. Występują markery podatności na Sars-Cov-2. Dlatego takie mRNA należy podać w cząsteczce Osoby z grupą krwi A są bardziej podatni lipidów. Jakieś gówno o soku z aloesu. 4. Wakcynologia Zalety szczepionek opartych na mRNA - można je szybko zaprogramować w zależności Idea produkcji szczepionek: od danego wariantu wirusa Tradycyjnych: wytwarzanie atenuowanych - brak integracji mRNA z genomem pacjenta (sztucznie otrzymanych odmian patogenów o obniżonej - w przyszłości, możliwość zastosowania w zdolności do namnożenia się i uszkodzenia tkanek, przy terapiach antynowotworowych równoczesnym zachowaniu ich oddziaływania immunologicznego na organizm) 5. Pytania pod koniec W ten sposób podajemy wiele antygenów (całe wirusy Domena RBD białka S1 rozpoznaje miejsca lub ich części strukturalne) aktywne Szczepionka przeciw polio, WZW typu A A receptora ACE3 Rekombinowanych: wyselekcjonowanie B receptora ACE2 pojedynczych antygenów (wybranych białek lub C polimerazy RdRp DNA/RNA wirusów) Szczepionka przeciw WZW typu B Sama cząsteczka Ψ-mRNA: A jest silnie immunogenna w komórkach ssaków A B nie jest immunogenna w komórkach ssaków C w większym stopniu podlega translacji niż niemodyfikowane mRNA Wykład 6 – Markery jądrowego i organellowego DNA 1. Markery jądrowe Metoda magnetyczna – schemat Komórki somatyczne (2n - diploidalne) to są wszystkie 1. Liza błony komórkowej komórki organizmu oprócz gamet. 2. Wiązanie z kulkami Składają się z podwójnego zestawu chromosomów, co 3. Wypłukanie zanieczyszczeń oznacza również, że mają po dwa allele w komórce 4. Uwalnianie DNA Komórki somatyczne (n) składają się z pojedynczego Spektrofotometria: chromosomu, co z tym idzie – mają tylko jeden allel. ocena ilościowa i jakościowa Są w organellach; mitochondrium i *chloroplastach Odczytuje się informacje z niego na podstawie *W GENOMIE CHLOROPLASTOWYM NIE MA HETEROZYGOT, absorbcji fal TYLKO JEDEN WARIANT RODZICIELSKI Elektroforeza Marker molekularny ocena ilościowa i jakościowa to wybrany fragment cząsteczki DNA lub białka, Metoda rozdzielania molekuł w polu elektrycznym, na który różni się budową (strukturą) od innych podstawie ich wielkości, kształtu i ładunku fragmentów lub cząsteczek umożliwia detekcję polimorfizmu między Mieszanina reakcyjna osobnikami 1. Wyekstrahowane DNA Markery w większości są nie kodujące 2. Bufor reakcyjny 3. MgCl2 Cechy dobrego markera molekularnego: 4. Startery nukleotydowe (Forward i Reverse, - występuje z wysoką frekwencją w genomie; jest multipleks) łatwo wykrywalny 5. dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - wykazuje naturalność selekcyjną; nie zależy od 6. DNA polimeraza czynników zewnętrznych DNA polimeraza musi być termostabilna, nie - generuje powtarzalne wyniki rozpada się przy dużych wahaniach temperatur i działa - cechuje się prostą i szybką metodą w dużym zakresie temperatur (-20oC - 120oC) wykrywalnością Wykazuje aktywność korektorską w kierunku Schemat wykrywania markerów: od 3’ do 5’ 1. Zbieranie materiału RT-PCR; reakcja łańcuchowa polimerazy w 2. Izolacja DNA czasie rzeczywitstym 3. Przeprowadzenie reakcji PCR - wysoki stopień detekcji obecności badanego 4. Genotypowanie w sekwenatorze fragmentu w próbie 5. Odczyt profili genetycznych DNA i - technika oparta na reakcji PCR z analizą w interpretacja wyników czasie rzeczywistym Izolacja kwasów nukleinowych – schemat - technika łatwa, koszt średni 1. Liza błony komórkowej Schemat RT-PCR: 2. Wiązanie z matrycą 1. przepisanie RNA na cDNA dzięki odwrotnej 3. Wypłukanie zanieczyszczeń transkryptazie RNA 4. Uwalnianie DNA 5. Zawieszenie w końcowym buforze TE lub 2. qPCR – PCR w czasie rzeczywistym i walidacja miliQ H2O wyniku 2. Podstawowe typy markerów molekularnych 3. Podstawowe typy markerów molekularnych jądrowego DNA mt i cpDNA DNA genomowa: PCR-RFLP; polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych RAPD; losowo amplifikowane polimorifczne DNA - detekcja polimorfizmu regionów kodujących - źródło polimorfizmu: jednozasadowe insercje SSR (STR); mikrosatelitarne DNA lub delecje RAPD: - typ dziedziczenia markera: kodominujący (A lub a) - wysoki stopień detekcji polimorfizmu (insercje - trawienie enzymami restrykcyjnymi lub delecje) - technika czasochłonna - technika oparta na reakcji PCR z losowymi - koszt wysoki starterami - typ dziedziczenia markera – dominujący RAD-seq; sekwencjonowanie DNA związane z (A, brak a) miejscem restrykcyjnym - technika łatwa, koszt średni - detekcja polimorfizmu pojedynczych mutacji Wady i zalety RAPD: (SNPs) - wykrywanie i genotypowanie całych genomów Zalety Wady i populacji wiązanie starterów o markery typu - typ dziedziczenia markera: kodominujący (A niskiej temperaturze dominującego lub a) (nawet 35 C) o - sekwencjonowanie 13-pz sekwencja posiada niska powtarzalność - technika czasochłonna 413 wariantów, które między laboratoriami - koszt wysoki mogą znaleźć sekwencje komplementarne w Markery polimorfizmu organellowego DNA liczbie średnio 10 - haplotyp mtDNA przekazywany jest prążków na próbę w potomstwu przez matkę u zwierząt i drzew genomie 1x109 iglastych - haplotyp cpDNA przekazywany jest SSR/STR potomstwu przez matkę u drzew liściastych - procent mutacji w mtDNA