מבוא מבוא לביולוגיה תאית - PDF

יחידת החיים הקטנה ביותר היא התא. כל היצורים החיים מורכבים מתאים. בגוף האדם יש כ-100 טריליון תאים שמתחלקים לכ-200 סוגים. קבוצת תאים שפועלים בתפקיד משותף יוצרים רקמה. סך הכל יש 4 רקמות: אפיתל, שריר, חיבור ועצב. צבר של רקמות יוצר איבר. יש כ-80 איברים שונים בגוף. אוסף של איברים יוצר מערכת וכל המערכות יח...

יחידת החיים הקטנה ביותר היא התא. כל היצורים החיים מורכבים מתאים. בגוף האדם יש כ-100 טריליון תאים שמתחלקים לכ-200 סוגים. קבוצת תאים שפועלים בתפקיד משותף יוצרים רקמה. סך הכל יש 4 רקמות: אפיתל, שריר, חיבור ועצב. צבר של רקמות יוצר איבר. יש כ-80 איברים שונים בגוף. אוסף של איברים יוצר מערכת וכל המערכות יחדיו יוצרות גוף. אנטומיה עוסקת במבנה איברים בגוף ופיזיולוגיה עוסקת בתפקוד האיברים בגוף. היסטולוגיה, שהיא תורת הרקמות, מגשרת ביניהם. **מיקרוסקופ אור** **מודיפיקציה:** יכולת הגדלה, זום-אין. **רזולוציה:** יכולת הפרדה, נמדדת ביחידות מרחק. המרחק המינימלי הוא נראה הפרדה בין שני גופים. מעבר לגבול הרזולוציה לא נצליח להבחין בין שני אלמנטים נפרדים ונראה אותם כגוף אחד. ככל שההגדלה גדולה יותר, נוכל לראות טוב יותר את מרכיבים התאים, בתנאי שהרזולוציה טובה. אין תועלת בלהגדיל עוד ועוד אם הפרטים קטנים יותר מהרזולוציה. בתמונה הזו הרזולוציה היא 0.2 מיקרומטר. נצליח לראות אברונים שגדולים מרזולוציה זו כמו הגרעין, גרעינון, סיליה וסטריאוסיליה. לא נצליח לראות בבירור מיטוכונדריה, ליזוזום ומיקרובילי, אלא אם כן הם נמצאים בכמות גבוה מאוד ואז נוכל להבחין בקיומם אבל עדיין לא נוכל להפריד ביניהם. **גרעין אאוכרומטי** יראה בהיר יותר כי הכרומטין בו יותר פתוח, יותר נגיש ולכן גם פעיל יותר. לעומת זאת, **גרעין הטרוכרומטי** ייראה כהה יותר בצבעים מאחר והוא סגור יותר וכנראה פחות פעיל. אפשר לראות אברונים קטנים יותר בבירור בעזרת מיקרוסקופ אלקטרונים, אבל לא נתעסק המיקרסקופ כזה בקורס היסטולוגיה. בגלל שאיברים של בעלי חיים הם קטנים משמעותית, בשונה מאיברים של בני אדם, תתקינים של חיות אפשר להכניס במלואם לתוך זכוכית הגדלה ולחקור אותם בקלות. תתקינים של בעלי חיים זמינים יותר מאלו של בני האדם וגם בריאים יותר מאחר והם מגודלים כחיות מודל ובני אדם תורמים איברים רק במקרים שליליים. החתיכה של התתקין צריכה להיות מאוד דקה אחרת האור לא יצליח לעבור דרכה. **כדי לקבל תתקין טוב ונוח לשימוש, הוא צריך לעבור 5 שלבים עיקריים:** 1. **פיקסציה (fixation)** כאשר יצור מת, הגוף עובר אוטוליזיס -- פירוק עצמי. אנזימים שהיו מושתקים עד כה מופעלים ומפרקים את התאים. בנוסף, כאשר ייצור לא חי יותר הוא לא יכול להגן על עצמו ממיקרואורגינזמים. כדי למנוע ריקבון ולעצור את כל התהליכים הדינמיים והפתולוגיים שמתרחשים ברקמה צריך להקפיא אותה ברגע מסויים. סוג הקיבוע שנחשף אליו בקורס הוא קיבוע באמצעות פורמלין שגורם לתגובה כימית: יצירה של קשרים קוולנטיים בין חלבונים בתא. כאשר חלבונים מחוברים אחד לשני ותקועים, הם לא יכולים לבצע תהליכים שונים לכן התאים נשארים כפי שהיו ברגע הקיבוע. דנא ורנא שהן חומצות גרעין שלא מגיבות לפורמלין יכולות גם הן לעבור קיבוע בזכות האסוציאציה שלהן לחלבונים: חלבוני הכרומטין בגרעין והריבוזום שקושר אליו מרנא בציטופלסמה. סוכרים ופוספוליפידים לעומת זאת, לא יעברו קיבוע לא בציטופלסמה ולא על גבי הממברנה. שיטה נוספת לפיקסציה היא הקפאה שנהוגה יותר לשימוש בניתוחים. הקפאה מהסוג הזה היא מהירה ומיידית בהשוואה לקיבוע מהסוג הראשון שדורש תהליכים רבים. יחד עם זאת, ההקפאה המכאנית לא איכותית ולא מונעת מתהליכים פתולוגיים להמשיל ולהתרחש ברקמות, בשונה מהשיטה הראשונה. 2. **Embedding** רקמות הגוף הן מימיות ולכן צריכות לעבור הקשיה כדי שיהיה אפשר לחתוך אותן לפרוסות מתאימות לתתקין. בהקפאה מכאנית אפשר לחתוך בלי הקשיה. דרך ההקשיה הנפוצה ביותר היא באמצעות פרפין (שעווה). היתרון העיקרי שלה הוא שאפשר לעבוד איתה בטמפרטורות נמוכות יחסית (50) ובכך לצמצם פגיעה ושריפה של הרקמות. החיסרון בשימוש בשעווה הוא שהיא שומנית ולא חודרת לתאים בגלל המים. כדי להתגבר על בעיה זו עושים תהליך של דהידרציה -- הוצאת מים מהתאים. מתחילים מ-100% מים בתאים ועולים בהדרגה ל-100% אלכוהול ומשם ל-100% חומר אורגני שידידותי לשעווה. באופן הזה אפשר להקשות את כל הרקמה כולה מבחוץ וגם מבפנים. חומר נוסף אך פחות נפוץ הוא JB-4 שהרבה יותר קשה מפרפין. ככל שהבלוק קשה יותר, כך אפשר לעשות חיתוכים יותר מדוייקים. 3. **חיתוך (microtome sectioning)** החיתוך מתבצע על ידי מכשיר מיוחד שפורס את הדגימה לפרוסות דקות מאוד. 4. **השטחה (flattening)** כדי לתקן את החספוסים של החיתוך, צריך לשטח את התתקין. כדי לעשות זאת מחממים את התתקין באמבטיית מים חמים ולמרות שלא כל השעווה מתיישרת זה מסייע משמעותית לאיכות התתקין. התתקין עדין ביותר, כדי לשים אותו על הזכוכית צריך להניח אותה על גבי התתקין בעדינות. (סרטון) 5. **צביעה (staining)** כדי לקבל תמונה מדוייקת של מה שאנחנו רוצים לראות, צריך להשתמש בשיטת צביעה וצבענים מתאימים. **צביעת H&E:** H הוא צבען כחול בסיסי שטעון חיובית. הוא צובע חומצות גרעין -- את הדנא בגרעין ואת המרנא במקובע בציטופלסמה. E הוא צבען ורוד חומצי שטעון שלילית וצובע בעיקר חלבונים. **צביעת PAS:** צובעת סוכרים. סוכרים לרוב לא נשארים אחרי השטיפה אלא אם כן הם מקובעים על גבי חלבונים או שריכוזים מלכתחילה מאוד גבוה כך שגם אחרי השטיפה לא מעט נשארים מקובעים סוכרים יכולים להישאר גם אחרי הקיבוע כאשר היה ריכוז גדול מאוד של סוכרים מלכתחילה ולא הכל נשטף. התמונה משמאל מתארת צביעה H&E שלא נתפסת על סוכרים. הצביעה משמאל היא PAS. התמונות מתארות רקמה של מערכת הנשימה שיש בה תאי סיליה שמפרישים ריר צמיגי סוכרים. משמאל לא רואים סוכרים כלל (לבן) ומימן רואים. בדוגמה הזו למשל אנחנו מעוניינים לראות מאקרופגים. אנחנו אמנם רואים גרעינים (נקודות כחולות) אבל אי אפשר לקבוע בשיטה הזו מה סוג התאים מאחר ולא רואים מתארים ומבנים מדוייקים. לעומת זאת, אם נזריק צבען גרגירי כחול לווריד זנבי של עכבר, המאקרופאגים שהם תאים בולעניים יתקפו את הצבען ויבלעו אותו. כאשר נסתכל על תצלום של הצביעה, נראה תאים שיש בתוכם חומר גרגירי כחול, מה שמבדיל את הבולענים משאר התאים הגרעיניים. נשים לב שבתמונה הזו הגרעינים הם ורודים ולא כחולים. חשוב לבחור את הצבעים המתאימים כדי ליצור ניגודיות -- אם גם החומר הגרגירי כחול וגם הגרעינים, לא נצליח להבדיל ביניהם. **(vital stain).** **ארטיפקט (artifact)** ארטיפקט הוא דבר מלאכותי מעשה אדם או גם תקלות והרס שנגרמים על ידי אדם בגלל שנגע בפרטים מסויימים. יכולים לקורת ארטיפקטים בזמן הכנת תתקינים. רובם צפויים ואת חלקם אפשר לתקן. **ארטיפקט בשלב הפיקסציה:** אחד השינויים העיקריים שיכולים להתרחש בשלב הפיקסציה הוא שינוי נפחי בייחוד ברקמת עצב. האקסונים (בשחור) באופן טבעי מוכלים בתוך קפסולה וצמודים לה, כמו בחלק העליון של התמונה. בעקבות התכווצות של הרקמה נגרם בה קרע. קרעים יכולים להתרחש גם בגלל התכווצות וגם התרחבות של רקמות כמו גם בגלל תקלות מכאניות בזמן העברת תתקינים ממקום למקום. גם עצירה של תהליכים דינמיים שאמורים להתרחש ברקמה כמו חלוקת תאים נחשבת ארטיפקט. **ארטיפקט בשלב ה-embedding:** אובדן של חומרים מסיסים במים ובשומן. למשל בתמונה אנחנו רואים תאי שומן ריקים כי השומן בהם נשטף. הקווים שכן רואים בתמונה הם לא הממברנה כי גם הממברנה עשויה שומן ונשטפת, אלא קונטור של שאריות ציטופלסמה שנדחקו להיקף. לרוב לא רואים ממברנות בתתקינים אלא את החלבונים. הנקודות השחורות הן הגרעינים שגם כן נדחקו למעטפת. דבר דומה אפשר לראות בתאים שיש בהם מאגרים תוך-תאיים של שומן כמו בתאים שמייצגים הורמונים סטרואידיים. מולקולת המוצא של הורמונים אלו הוא הגליצרול, כך שכשיש מאגרים גדולים של גליצרול או כולסטרול בתאים גם הוא לא נשמר ומתקבל מראה ספוגי. **ארטיפקט בשלב החיתוך:** חיתוך אלמנט תלת-ממדי לפרוסה דקה מאוד הופכת אותו לדו-ממדי. כמות ואיכות האינפורמציה שנצליח להשיג תלויה בזווית החיתוך. לעיתים נוצר קושי להבין מה בדיוק רואים. כדי להתגבר על בעיה זו נדרש תרגול וחשיפה לסוגים שונים של תתקינים. אלמנט שכיח בגוף האדם הם צינורות וכיוון החיתוך שלהם משפיע משמעותית על הבנת מבנה הרקמה. למשל, אם חותכים בדיוק במרכז הצינור, מקבלים את היחס בין גודל הדופן ללומן של הצינור. ככל שנזוז בכיוון החיתוך, כך היחסים ביניהם יתעוותו. אם החתך עובר על דופן הצינור, לא נראה בכלל את הלומן ונתקשה להבין שמדובר בכלל בצינור. בתתקין הזה למשל, אנחנו מסתכלים על חתך של צינור מפותל של יתרת האשך. נשים לב שיש חתכים שעוברים במרכז בצורה יפה לאחד מהכיוונים ויש חתכים שהתרחשו בדיוק על הדופן ולא רואים לומן כלל. **ארטיפקט בשלב ההשטחה:** על אף ניסיון ההשטחה, עדיין יכולים להישאר קיפולים כמו כן יש רקמות ואיברים שנוטים להתקבל על עצמם כמו הנרתיק למשל שלו רקמה גמישה לכן נוטה להתקפלות. בתמונה הקיפולים נראים כפסים כהים -- יכול להיות קיפול כפול או יותר. הבעיה העיקרית שנובעת מאותם הקיפולים היא יכולת ההתמקדות -- נראה שיש חלקים שאנחנו רואים אותם באיכות גבוה, ואחרים שאנחנו רואים מטושטש כי בהם יש קיפול. כדי להתגבר על הבעיה ובכל זאת לנסות ללמוד לעל הרקמה נצטרך להזיז אותה לאזור בו היא לא מקופלת. **ארטיפקט בשלב הצביעה:** כאשר מסתכלים על תתקין צריך לקחת בחשבון את סוג הצביעה שביצעו ולהעריך מה המידע שאנחנו מצפים לקבל ממנה ואיזה מידע לא. כל אלו הם ארטיפקטים צפויים, אבל יכולים להיות כאלה שאינם צפויים בעיקר ברקמת הדם שיכולה להתנהג שונה בין תתקין לתתקין: לעיתים נראה רק את הפלסמה, לפעמים יהיו הרבה תאי דם אדומים, לבנים או קרישים. יכולות להופיע גם בועות. אין לנו דרך למנוע מאלו להופיע וגם לא נוכל לצפות להם.