טכניקות מיקרוסקופיה

**מיקרוסקופיה** אבן דרך עיקרית בהיסטולוגיה היא התפתחות המיקרוסקופ הפלורוסנתי. חומרים פלורסנתיים יאירו בצבע בעל אורך גל קצר יותר מזה שהואר עליהם כתלות בסוג החומר, למשל אם נאיר בסגול, נקבל כחול, נאיר בירוק, נקבל צהוב וכדומה. בזכות הפלורוסנציה, אנחנו יכולים לסמן הרבה דברים בצבעים שונים בו-זמנית. ![]...

**מיקרוסקופיה** אבן דרך עיקרית בהיסטולוגיה היא התפתחות המיקרוסקופ הפלורוסנתי. חומרים פלורסנתיים יאירו בצבע בעל אורך גל קצר יותר מזה שהואר עליהם כתלות בסוג החומר, למשל אם נאיר בסגול, נקבל כחול, נאיר בירוק, נקבל צהוב וכדומה. בזכות הפלורוסנציה, אנחנו יכולים לסמן הרבה דברים בצבעים שונים בו-זמנית. עם התפתחות האימונולוגיה, למדנו שאפשר לייצר **נוגדים** לכל מבנה שאנחנו רוצים ולנוגדנים האלה לקשור חומר פלורוסנתי שיאיר. **VTS** היא טכניקה שבה אנחנו מנסים להחליט מה אנחנו רואים, מה גרם לנו לראות את הדברים האלו ולנסות לחשוב לאחר מכן על דברים נוספים שלא ראינו לפי כן. בתמונה מהסוג הזה אנחנו משתמשים בחלבונים פלורסנתיים, כמו GFP. חלבונים אלה דומים לחומרים הפלורסנתיים, רק שבהם המבנה המרחבי שלהם מעניק לו את תכונת הפלורוסנציה. על החלבון GFP שמאיר בירוק, מאירים בכחול. בגלל שחלבונים מקודדים מהדנא, אפשר להחדיר את הגן ל-GFP לתוך דנא של תאים. אם רוצים שהחלבון יתבטא ללא תלות בתפקוד התא, צריך להחדיר את הגן שלו יחד עם פרומוטור כדי שפקטורי שיעתוק יתחברו אליו באופן אינדיבידואלי. באופן הזה אפשר להאיר סוגים שונים של תאים כתלות במה שרוצים לראות, וכך לבודד אותם ולהאיר רק אותם מתוך רקמה עם הרבה תאים אחרים. באמצעות שילוב של צבעים שונים, אפשר ללמוד גם על הקשר בין תאים שונים. למשל תא עצב מבטא את חלבון 1 ו-2, אחד אחר את 2,3 ו-4 וכדומה. דרך פיזיולוגיה, אפשר ללמוד מתמונת מצב על תהליכים שמתרחשים באותו הרגע. התמונה הבאה למשל, היא חתך של מוח של עובר ביום מסויים של ההתפתחות. הכחול הוא חומר כימי שצובע את הדנא, בירוק הוא נוגדן שצובע כלי דם. אנחנו רואים שני כלי דם במוח שנמצאים בשלב ההתפתחות ומגששים זה אל זה ובסוף מתחברים. החומר האדום צובע את הדם. אנחנו יכולים לראות שהוא לא נשפך החוצה, כלומר, קצוות כלי הדם שנוצרים הם אטומים. (צהוב זה שילוב של ירוק עם אדום). **צביעות קלאסיות במיקרוסקופ אור (לא פלורוסנתי)** **Hematoxylin & Eosin:** כחול צובע חלקים חומציים כמו חומצות גרעין ורנא ואדום צובע חלקים בסיסיים כמו חלבונים. **PAS** -- צובע סוכרים בסגול.  **Vital Stain** -- תאים שבולעים את הצבע יצבעו בכחול. **Trichrome** -- צובע סיבים. **Elastic Stain** -- צובע סיבים אלסטיים. **Silver Stain** - צובע סיבים. טכניקה צביעה נוספת היא שימוש באחת הטכניקות האחרות ולדלל את הצבע. באופן הזה לא כל האלמנטים נצבעים אלא רק חלק מהם. האיור הזה היא silver staining מסוג golgi. אנחנו מסתכלים על נוירונים. בפועל בתמונה יש המוני תאים, אבל אם היינו צובעים את כולם לא היינו מסוגלים לראות את השלוחות. כשאנחנו מבצעים צביעה, אנחנו צריכים לזכור שכשאנחנו שופכים לתוך הדגימה את החומר הפלורוסנתי שאמור לקשור מבנה מסויים, הוא אמנם ייקשר לאן שאנחנו רוצים, אבל הוא גם יישאר בתמיסה לא קשור לשום דבר. כך, כשאנחנו נסתכל ישירות על הדגימה, נראה גוש שלם של צבע שלא מסביר לנו דבר. כדי לקבל מידע מהדגימה, אנחנו צריכים לשטוף אותה, כך הפלורוסנת היחיד שיישאר בדגימה הוא זה שקשור למבנה הרצוי. אם אנחנו משתמשים בחומר קושר דנא, אנחנו יכולים ללמוד הרבה על הרקמה רק מלהסתכל על הגרעינים שלה ועל המיקומים והצפיפות שלהם -- פה למשל אנחנו יכולים להבדיל בין שתי רקמות. גם התמונה הזו היא צביעה של הגרעינים בלבד. אנחנו יכולים ישר להגיש שמדובר במוח. כמו כן אפשר להבדיל בין אזורים שבהם יש הרבה גרעינים ואזורים בהם צפיפות הגרעינים נמוכה יותר. נזכור שהדנא עצמו אינו פלורסנתי, אלא החומר שנקשר אליו, למשל DAPI. החומר **מיטוטרוקר** הוא גם חומר פלורוסנתי שקושר מיטוכונדריה (יש לו אפיניות לאורגנלות) בתמונה הבאה, אפשר לראות את כל המיקומים בהם יש מיטוכונדריה כי נקשר אליה חומר פלורוסנתי אדום. במיקרוסקופ אור, זה שצולמה בו התמונה, אין רזולוציה מספיק נמוכה כדי לתעד מיטוכונדריה בודדה, לכן אנחנו מקבלים רשתות שהן אוסף של מיטוכונדריות. החומר **פלויידין** בעל אפיניות למולקולות חלבון ולכן הוא צבוע את סיבי האקטין (שלד תוך תאי). **צביעה אימונו-פלורוסנטית** היא צביעה פלורסנטית בעזרת נוגדנים. אפשר לסווג אותם לשתי קטגוריות: ישירה (direct) ועקיפה (indirect). **בצביעה אימונו-פלורוסנטית ישירה** משתמשים בנוגדן שקשור לחומר פלורסנתי מצד אחד ומצד אחר נקשר לאנטיגן המתאים לו על גבי התא שבחרנו. **בצביעה אימונו-פלורסנטית עקיפה** גם יש נוגדן שמזהה את האנטיגן שלו בסוג התא/חלבון הרצוי, נקרא **נוגדן ראשוני**, אבל הוא עצמו לא מסומן פלורסנטית. לאחר מכן שוטפים את התמיסה ובהתחלה לא רואים כלום, אבל לאחר מכן מוסיפים לתמיסה **נוגדן שניוני** שנקשר לנוגדן הראשוני והוא עצמו כן קשור לחומר פלורוסנתי, כך שאחרי השטיפה השנייה נראה אזורים מוארים שיהיו רק אלה שאליהן נקשר הנוגדן הראשוני. היתרון בשיטה הזו היא שעכשיו יש הגברה של הסיגנל, כי במקום מולקולה אחת של פלורופור יש 3. כדי לייצר נוגדים, צריך להזריק לגוף חומרים שזרים לו, באופן הזה הוא הופך ״מחוסן״ ומייצג נוגדים לאותו חומר שהשתמשנו בו. את הנוגדים האלה אוספים ומשתמשים בהם למחקר. בדרך כלל מחסנים באמצעות חלבונים של רקמה ולא תערובת של הרקמה עצמה. אלה הם הנוגדים הראשוניים. כדי לייצר נוגדנים שניוניים, צריך לקחת את הנוגדנים הראשוניים שיצרנו ולחסן חיה אחרת, שאותם נוגדים זרים לה. שימוש בשיטה הזו מאפשרת יד חופשיה יותר במעבדה. צביעה עם נוגדנים לא חייבת להיות פלורסנטית, אפשר להשתמש גם בצבעים של האור הנראה. בתמונה הזו למשל רואים חתך של כבד. כדי לקבל חתך צבוע, שופכים עליו נוגדנים מתאימים לאנטיגנים שקשורים בקצה האחר שלהם אנזימים. לאחר מכן שוטפים ושופכים מעל את הסובסטרט שמגיב לאותו אנזים. התוצר של התגובה נותן צבע ושוקע במיקום של האנזים. היתרון של שיטה זו היא שאפשר לשלוט על עוצמת הצבע -- ככל שנתן יותר סובסטרט, נקבל יותר תוצר צבוע. **מיקרוסקופ אלקטרונים** למרות היתרונות הרבים במיקרוסקופ אור, הרזולוציה שלו עדיין לא גבוהה מספיר, בעיקר אם אנחנו מסתכלים על רקמה: מיקרוסקופ אפי-פלורסנתי מאיר על רקמה שלמה וכל הרקמה מחזירה אור (בהתאם להימצאות פלורופור). תופעה זו גורמת לכך שכל מה שלא נמצא באותו מישור ייראה מטושטש וגם אור של מולקולה אחת מתפזרת במרחב ולא נותנת תמונת מצב מדוייקת. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים משתמש באורכי גל **קצרים** יותר, מה שנותן רזולוציה **טובה** יותר. **במיקרוסקופ אור** יש לנו מקור אור, עדשה מרכזת על הדוגמה, עדשה שאוספת אור מהדוגמה ועדשת עין שמגדילה את התמונה. **במיקרוסקופ אלקטרונים** במקום מקור אור יש אקדח אלקטרונים, במקום עדשות אופטיות יש מגנט, שבמקום לרכז את האור הוא מרכז את האלקטרונים על הדוגמה. מתחת יש מגנט שאוסף את האלקטרונים שעוברים דרך הדוגמה, מגנט נוסף שמשמש כמקרן שמקרין את הדוגמה על מסך. אלקטרונים, בשונה מאור נראה, עוברים הרבה פחות טוב דרך רקמה חיה, לכן הדוגמה צריכה להיות דקה מאוד, הרבה יותר מזו שמשתמשים עבור מיקרוסקופ אור. מה קובע אם יהיה סיגנל מאזורים ברקמה או לא, הוא נוכחות של מתכות -- מתכות מוליכות אלקטרונים, לכן בכל מקום בדוגמה שבה יש מתכות, האלקטרונים לא יוכלו לעבור ואיפה שאין מתכת, האלקטרונים יעברו. הצביעה של הרקמה דומה בטכניקה למביעה רגילה רק שפה משתמשים במתכות כבדות. עובי חתך דוגמה למיקרוסקופ פלורוסנתי הוא כ-12 מיקרון, ועבור מיקרוסקופ אלקטרונים הוא 70 ננומטר. יחד עם זאת, יכולת הסימון במיקרוסקופ אלקטרונים הרבה יותר מוגבלת מזו של מיקרוסקופ פלורוסנתי. באופן, הצלחנו לפתור את בעיית הרזולוציה כאשר מסתכלים על דוגמאות מסומנות. כדי לפתור את בעיית העומק, אפשר להשתמש **במיקרוסקופ קונפוקלי.** **מיקרוסקופ קונפוקלי** בתמונה פה אנחנו רואים את אותה הדוגמה, אחת תחת מיקרוסקופ אפי-פלורוסנתי והשנייה קונפוקלי. התמונה התחתית מטושטשת, ובעליונה יש רזולוציה טובה יותר. כיום אנחנו יודעים להגיד שהמקור לטשטוש הזה הוא שיש סיגנלים שמגיעים מעל ומתחת למישור הראייה -- כאשר אור מוקרן על דוגמה עבה, הוא פוגע בכל המולקולות שבאות בדרכו. יתרה מכך, לאחר מכן, נאסף אור פלורוסנתי מכל אותן המולקולות, לכן הטשטוש (פיזור לא שווה של אור בדוגמה). מיקרוסקופ קונפוקלי הוא מיקרוסקופ אור פלורסנתי שמוגבל ברזולוציית הדו-מימד שלו באותה מידה כמו מיקרוסקופ אפי-פלורוסנתי (לא יכול לראות משהו שקרוב יותר מ-200 ננומטר). יחד עם זאת, בניגוד למיקרוסקופ האפי-פלורסנתי, יש לו רזולוציה לעומק טובה יותר. שיטת העבודה של שני המיקרוסקופים היא די דומה -- אור מוקרן, וכל אור פלורוסנתי שמתקבל ממולקולות פלורופור בדרך מוקרנות על גבי המסך. יחד עם זאת, בגלל שהן מוקרנות על אותו מסך אבל המיקום שלהן במישור הוא שונה, אם נתמקד על מישור של נקודה אחת, האחרת תהיה מטושטשת. מה ששונה במיקרוסקופ קונפוקלי, הוא שיש בו מסך שחור שכשאר מתמקדים על מישור מסויים, כל הנקודות מהמישורים האחרים נתקעים במסך ולא עוברים למסך. השיטה הזו מתבססת על כך שמולקולות במישורים שונים מוקרנות בזוויות שונות. אמנם אנחנו מאבדים מידע עומקי כשאנחנו מסתכלים על תמונת מצב אחד, אבל אנחנו יכולים לשנות את מישור הצפייה ולצלם כל פעם מישור אחר, וכך לשמור על הרזולוציה הדו-מימדית וגם ללמוד על התלת-מימד. זאת אומרת, אם ניקח את כל המישורים ונחבר אותם לתמונה אחת, נוכל ליצור תמונה תלת מימדית, כמו שיש בדוגמה למעלה. החיסרון שיש בסוג כזה של מיקרוסקופ הוא שהוא לא בהכרח מצליח לקלוט אור ממולקולת פלורופור אחת, ואז אנחנו רואים שחור איפה שכן אמור להיראות אור, בשונה ממיקרוסקופ אפי-פלורוסנתי שקולט את כל המישורים. כדי להתגבר על בעיה זו המיקרוסקופ יכול לסרוק, במקום לצלם, כך שבזמן הזה ייפלטו עוד פוטונים והוא כן יקלוט. בנוסף, במקום מצלמה משתמשים במכשיר שקולט טוב יותר פוטונים בודדים. **Light sheet** שיטה נוספת שבעזרתה אפשר להתגבר על בעיית העומק. בשיטה זו, המכשיר אוסף את המידע מכל המישורים, אבל מלכתחילה הוא מקרין אור רק על מישור אחד. כך נוכחות של פלורופורים במישורים אחרים לא משפיעים כי הם לא פולטים אור ברגע הדגימה. במכשיר הזה, יש עדשה אחת למעלה ושתי עדשות בצדדים שמרכזות את האור לשכבה דקה מאוד, כך שרק מהשכבה הזו יש הארה. השיטה הזו הרבה יותר מהירה כי היא לא סורקת נקודה-נקודה ואפשר לקבל סריקה מהירה של הרקמה כולה לכל עומקה. יחד עם זאת, החיסרון במכשיר הזה היא שהאור שנפלט מהרקמה עדיין צריך לעבור את המרחק עד העדשה מה שגורם לפיזור של סיגנלים (בגלל חומרים שונים בתוך הרקמה שלא מעבירים טוב אור). הדרך להתגבר על כך היא להפוך את הרקמה לשקופה על ידי קיבוע הרקמה ושטיפה של שומנים ממנה. מתקבל שלד חלבוני של מה שהיה המוח, במבחנה חלבוני.