Prepararea mediilor de cultură utilizate în procesele biotehnologice PDF

Biotehnologie generala si instalatii biotehnologice Lucrarea practică nr. 1 PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ UTILIZATE ÎN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE Șef lucrări dr. Gropoşilă-Constantinescu Diana-Gabriela   Mediul de cultură reprezintă...

Biotehnologie generala si instalatii biotehnologice Lucrarea practică nr. 1 PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ UTILIZATE ÎN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE Șef lucrări dr. Gropoşilă-Constantinescu Diana-Gabriela   Mediul de cultură reprezintă un complex de substanţe organice şi anorganice ce constituie suportul nutritiv necesar cultivării  Un microorganismelor în afarasă mediu de cultură trebuie nişei lor ecologice îndeplinească naturale condiţii: următoarele  să fie nutritiv, să conţină toate substanţele necesare întreţinerii, dezvoltării şi multiplicării microorganismelor  să fie steril  să aibă pH-ul optim microorganismului pe care dorim să-l cultivăm  să satisfacă tipul respirator al microorganismului cultivat  Mediile de cultură prezintă o mare importanţă în procesele biotehnologice, ele influenţând direct reproductibilitatea şi eficienţa tehnologiei aplicate.  Ele permit studierea la nivel de laborator a particularităţilor morfologice, fiziologice, genetice şi de biosinteză a microorganismelor cultivate.  Mediile de cultură utilizate în biotehnologie sunt diferite, având în compoziţie elemente specifice fiecarui tip de microorganism.  Clasificarea mediilor de cultură  După natura substanţelor nutritive care intră în compoziţia lor:  Naturale  Sintetice După spectrul lor de activitate:  Uzuale → pentru izolare şi întreţinerea microorganismelor  Selective → pentru selecţia microorganismelor După consistenţă:  lichide → pentru îmbogăţirea culturilor microbiene, pentru studiul proprietăţilor biochimice şi modificărilor asupra substratul lichid  solide → pentru izolarea microorganismelor şi pentru studiul caracterelor coloniilor  semisolide → favorizează migrarea microorganismelor în mediu pentru diferenţierea între specii  După tipul respirator al microorganismelor cultivate:  pentru microorganisme aerobe  pentru microorganisme anaerobe  După scopul şi frecvenţa întrebuinţării:  curente  de îmbogăţire  de conservare  de identificare  de bioproces  După de numărul ingredientelor pe care le conţin şi în funcţie de scop:  minimale  complexe  În funcţie de scara la care sunt folosite:  de laborator → medii complete, relativ simple care permit obţinerea unei biomase microbiene corespunzătoare  industriale → medii ieftine, ce asigură necesităţile nutriţionale ale microorganismelor cultivate şi producerea compuşilor doriţi; Utilizarea lor permite obţinerea de produse finale la un preţ de cost convenabil  Compoziţia mediilor de cultură  Mediile de cultură utilizate în biotehnologie conţin în principal:  sursă de carbon şi energie  sursă de azot  microelemente  oligoelemente  Surse de carbon  În majoritatea proceselor biotehnologice, principala sursă de carbon o constituie glucidele.  În mediile de cultură naturale, sursele de carbon sunt reprezentate de monoglucide (glucoză, fructoză) sau diglucide (maltoză, zaharoză, lactoză).  furnizate de produse agroalimentare ca: melasa, siropul de glucoză, făina de porumb, zerul de lapte, deşeuri celulozice.  Pentru obţinerea unui mediu de cultură, sursa de carbon se prepară sub forma unei soluţii de concentraţie cunoscută, astfel încât după reunire cu celelalte componente ale mediului de cultură, concentraţia sursei de carbon în mediu să corespundă valorii indicate în tehnologie. Glucoz Lactoza  Surse de azot Produse amoniac peptona naturale uree extract de carne sulfat de extract de porumb extract de drojdie amoniu faina de soia fosfat de aminoacizi/ amoniuSubstanţe proteine organice si anorganice  Substanţa reprezentând sursa de azot se cântăreşte la balanţa tehnică, se dizolvă în cantitate minimă în apă, se sterilizează, iar după răcire se amestecă cu celelalte componente ale mediului de cultură.  Oligoelemente si microelemente  Fosforul, potasiul, sodiul, sulful şi magneziul sunt elemente de bază pentru microorganisme, fără de care nu pot exista. Ele sunt furnizate din sărurile minerale care se introduc în mediul de cultură.  Microelemente ca fier, cupru, cobalt, mangan, zinc şi molibden sunt de asemenea esenţiale, fiind de regulă prezente în mediu sub formă de impurităţi existente în alte ingrediente ale mediului.  Sărurile minerale componente ale mediului de cultură se cântăresc şi se dizolvă separat în apă, apoi se reunesc şi se sterilizează conform protocolului indicat în reţeta de lucru. Reguli generale de preparare a mediilor de cultură I. Cântărirea şi dizolvarea pe rând a substanţelor indicate în reţetă, într-o cantitate minimă de apă, completarea cu apă până la volumul dorit şi apoi sterilizarea mediului de cultură. II. Cântărirea, dizolvarea şi sterilizarea separată a ingredientelor indicate în reţeta de lucru, urmată de reunirea lor în condiţii aseptice se elimină eventuale interacţiuni dintre diferitele componente din mediu în timpul operaţiei de sterilizare termică în timpul sterilizării prin autoclavare a sursei de carbon = glucide şi a sursei de azot = aminoacizi → reacţii Maillard, cu formarea unor produşi = melanoide cu efect inhibitor asupra microorganismelor  Completarea cu apă distilată la volumul final Filtrarea, prin hârtie de filtru (daca este cazul) Verificarea şi ajustarea pH-ului cu ajutorul unor soluţii alcaline de NaOH sau soluţii acide de HCl Dizolvarea substanţelor, de obicei la rece, într-o cantitate de apă distilată mai mică decât volumul total de mediu preparat biotehnologie Pregătirea şi cântărirea ingredientelor Etapele prepararii mediilor de cultură utilizate în Depozitarea mediilor, la 4-80C, nu mai mult de 4 săptămâni Controlul sterilităţii mediilor, prin incubare timp de 24 ore, la temperatura la care urmeză să se incubeze mediul de cultură Sterilizarea mediilor, de regulă 15-20 min, la 1210C pentru mediile care nu conţin glucide, iar cele cu glucide 15- 20 min, la 1150C Repartizarea mediilor lichide (eprubete, flacoane Erlenmeyer, sticle) Topirea agarului, pentru mediile solide, prin fiebere 30 min sau autoclavare  Aplicatie practica Geloza nutritiva Mediu YPG – solid Compus Cantitate Compus Cantitate % % Extract de 0.3 Glucoza 2 carne Peptonă 2 Peptonă 0.5 Extract de 1 Clorură de 0.5 drojdii sodiu Agar 2 Agar 1.5 pH = 7 pH = 6,5 - 7 Mediu pt fermentatie sterilizare 121OC, sterilizare 121OC, alcoolica (100 ml) 15 min Compus Cantitate 30 min % Glucoza 15 Extract de drojdii 0,4 Peptonă 0,4 Sulfat de amoniu 0,4 (NH4)2SO4 Fosfat monopotasic 0,2 KH2PO4  Prepararea a 25 ml mediu de cultură  Aparatura si ustensile necesare: - Pahar Berzelius cu apa distilata - Pahar Erlenmayer - Cilindru gradat - Eprubete - Balanta analitica - Agitator magnetic - Hartie indicatoare de pH si solutii corectoare de pH (NaOH 10%) Se măsoară 20 ml apă distilată într-un cilindru gradat Cei 20 ml apă distilată măsurată se trec într-un Erlenmayer Se adaugă un magnet și se plasează paharul pe agitator Se cântăresc ingredientele, conform rețetei și se dizolvă pe rând, sub agitare Se verifică pH-ul cu un pH-box și se corectează până la valoarea dorită (specificat in reteta) Se transferă conținutul paharului Erlenmayer în cilindrul gradat și se completează cu apă distilată până la volumul final Se cântărește agarul și se adaugă într-un pahar Erlenmayer, peste care se toarnă conținutul cilindrului gradat Se sterilizează în autoclav la 121OC timp de 20 minute și, după răcire, se distribuie mediul în eprubete