Tahap-Tahap Kultur Jaringan (PDF)

TAHAP-TAHAP KULTUR JARINGAN PERSIAPAN Pemilihan dan sterilisasi Pembuatan dan sterilisasi eksplan media PENANAMAN EKSPLAN INKUBASI SUB-KULTUR INKUBASI DS...

TAHAP-TAHAP KULTUR JARINGAN PERSIAPAN Pemilihan dan sterilisasi Pembuatan dan sterilisasi eksplan media PENANAMAN EKSPLAN INKUBASI SUB-KULTUR INKUBASI DST  MEMBUAT MEDIA MEMBUAT LARUTAN STOK MERACIK MEDIA DARI LARUTAN STOK  FORMULASI MEDIA MS-1962 Nama Senyawa Konsentras Konsentras Vol. stok dalam lart. i dalam i dalam lart.stok / stok media MS lart. stok liter media (mg/l) (mg/l) (ml) A NH4NO3 1.650 16.500 100 B KNO3 1.900 19.000 100 C CaCl2. 2H2O 440 44.000 10 D KH2PO4 170 1.700 100 E H3BO3 6,2 6.200 1 Na2MoO4.7H 0,25 250 2O CoCl2.6H2O 0,025 25 KI 0,83 830 Nama Senyawa Konsentras Konsentras Vol. stok dalam lart. i dalam i dalam lart.stok / stok media MS lart. stok liter media (mg/l) (mg/l) (ml) F MnSO4.7H2O 16,9 3.380 5 ZnSO4.7H2O 8,6 1.720 MgSO4.7H2O 370 74.000 CuSO4.7H2O 0,025 5 G FeSO4.7H2O 27,8 2.780 10 Na2EDTA 37,3 3.730 Vitamin Thiamin-HCl 0,1 100 1 Piridoksin-HCl 0,5 500 Asam 0,5 500 nikotinal (Glisin) 2,0 2.000 Mioinosit Mioinositol 100 5.000 20 ol SUKROSA 30.000  MODIFIKASI PEMBUATAN LARUTAN STOK Modifi kasi dalam pembuatan larutan stok berfungsi untuk menyesuaikan komponen atau kondisi larutan agar sesuai dengan kebutuhan spesifik dalam penelitian atau aplikasi tertentu. Sumber energy dan suplemen konsentrasi Sukrosa (gula pasir) 20-30 g/l Air kelapa 150 ml/l Bubur pisang 50-100 g/l Arang aktif 1-2 g/l Fungsi air kelapa : Sumber Zat Pengatur Tumbuh Alami (Hormon) Air kelapa mengandung sejumlah fi tohormon alami, terutama auksin, sitokinin, dan giberelin, yang berperan dalam mengatur pertumbuhan sel dan jaringan. seperti: 1. Sitokinin yang mendorong pembentukan tunas dan perbanyakan sel. 2. Auksin yang membantu dalam pembentukan akar dan perpanjangan sel.  MODIFIKASI PEMBUATAN LARUTAN STOK Fungsi bubur pisang : Meningkatkan Viabilitas dan Pertumbuhan Jaringan Bubur pisang dapat meningkatkan viabilitas (daya hidup) sel dalam media kultur dan mempercepat pertumbuhan. Misalnya, bubur pisang sering digunakan dalam kultur anggrek untuk mempercepat pertumbuhan dan meningkatkan pembentukan tunas dan akar. Hal ini juga berlaku pada kultur jaringan tanaman tropis lainnya. Fungsi arang aktif, sering digunakan dalam modifi kasi media kultur jaringan karena kemampuannya menyerap senyawa kimia tertentu yang mungkin berpengaruh negatif terhadap pertumbuhan sel atau jaringan MEMBUAT LARUTAN STOK Menyiapkan beaker-glass ukuran 1 liter Isi dengan 500 ml akuades Timbang dan masukkan kompenen bahan satu per satu agar tidak mengendap Tambahkan air sampai volume 1 liter KHUSUS UNTUK STOK G : FeSO4 dilarutkan dalam 400 ml akuades Na2EDTA dilarutkan dalam 400 ml akuades , dipanaskan Setelah homogen, dicampur, tambah akuades sampai 1 l MERACIK MEDIA DARI LARUTAN STOK Larutan stok diukur, dimasukkan satu per satu. Masukkan gula, diaduk dengan stirer Diukur pH, sampai 5,8 Jika diperlukan ditambahkan ZPT atau bahan lain Tambahkan agar, diaduk sambil dipanaskan sampai mendidih Dimasukkan dalam botol yang telah disterilkan Ditutup dengan alfo atau plastik tahan panas, diberi penguat karet gelang disterilisasi dalam autoklaf dengan suhu 120 Oc, tekanan 1,1 – 1,3 kg/cm2, 20 menit setelah dingin , disimpan dalam ruang ber-AC (24 – 26 oC) selama 3 – 4 hari Bila tidak kontam dapat digunakan STERILISASI STERILISASI ALAT & AKUADES 1. Alat gelas, alat logam, alfo : dengan udara kering dan panas , dimasukkan oven 130 – 170oC, 2 – 4 jam 2. Alat logam : Direndam dalam etil- alkohol 95%, kemudian dipanaskan dalam api 3. Botol kultur, tutup botol, pipet, akuades : dengan autoklaf 10~15 min. at 121℃, 15psi (or 1.06 kg cm-2)  STERILISASI MEDIA TANAM autoklaf filter mikrowave  STERILISASI MEDIA DENGAN AUTOKLAF Media dimasukkan dalam gelas, ditutup dengan kapas, alfo atau plastik tahan panas 15 psi, 121℃, dalam waktu 15 – 25 menit sesuai kebutuhan Tekanan dan temperatur tinggi dapat akibatkan penguraian karbohidrat dan senyawa termolabil lain  STERILISASI DENGAN FILTER Untuk komponen termolabil(karbohydrat, protein, amino acid, ekstrak tanaman, hormon) Menggunakan filter millipore (porositas< 0.2 μm) Tempat zat harus disterilisasi lebih dahulu dalam autoklaf  STERILISASI DENGAN MIKROWAVE Dengan daya 700W Waktu untuk medium cair 5 menit untuk 100ml, 10 menit untuk 250 – 500 ml, 15 menit untuk 1000mL, 30 menit untuk 2000mL, 50 menit untuk 3000mL Menghasilkan panas yang lebih rendah, membutuhkan energi yang lebih sedikit, Lebih murah dan mudah digunakan  STERILISASI EKSPLAN Tidak menggunakan panas dan tekanan yang ekstrem Menggunakan larutan sterilan (disinfektan) : yang paling umum 1% (v/v) NaOCl, 70% Etanol, or 10% H2O2 + Tween 20; atau dapat menggunakan pemutih komersial 20 – 100% Dapat dengan mencuci menggunakan detergen lembut (khususnya organ berkayu atau umbi), digojok selama 3 – 10, direndam dalam larutan sterilan pada lingkungan steril, kemudian dibilas dengan akuades steril  STERILISASI LINGKUNGAN Sumber kontaminan : debu, rambutm tangan, pakaian, pernafasan (bicara, bersin) Cuci tangan dengan air dan alkohol Jangan menyentuh langsung bagian-bagian di dalam LAF Disinari UV sebelum LAF dan ruang tanam digunakan Menggunakan blower udara dalam LAF Silahkan baca tahapan kultur jaringa n pada pisang di web berikut ini : https://www.slideshare.net/sathes32/tissue-culture-techniqu es-of-banana JENIS-JENIS KULTUR IN VITRO TUMBUHAN Types of In Vitro Culture  Culture of intact plants (seed and seedling culture)  Embryo culture (immature embryo culture)  Organ culture 1. shoot tip culture 2. root culture 3. leaf culture 4. anther culture  Callus culture  Cell suspension culture  Protoplast culture Organ-organ yang dapat dijadikan eksplan Kultur embrio zigotik  Embrio zigotik : embrio yang berasal dari perkembangan zigot, yaitu hasil peleburan gamet jantan dan betina.  Kultur embrio : pengambilan embrio secara aseptik dan menanamnya pada medium yang sesuai untuk perkembangan embrio di bawah kondisi optimum. Aplikasi  digunakan pada tanaman yang mempunyai masalah masa dormansi biji yang panjang  embrio hibrida interspesifik yang tidak kompatibel dengan endospermnya.  embrio dengan endosperm yang rusak seperti pada kelapa kopyor, dan  embrio tanpa endosperm seperti anggrek. Manfaat  mengatasi inviabilitas embrio,  mengatasi dormansi biji, dan  mencegah aborsi embrio. A. Embrio zigotik kacang tanah. B. Kultur embrio zigotik. C. Tunas yang tumbuh dari kultur embrio Kultur organ  a. Kultur akar  menggunakan potongan akar sebagai eksplan yang dapat ditumbuhkembangkan menjadi tunas  Tiamin merupakan vitamin yang sangat penting dan harus ada dalam kultur akar.  b. Kultur daun  menggunakan potongan daun sebagai eksplan  Tujuan : perbanyakan tanaman melalui organogenesis langsung maupun tidak langsung dan pembentukan kalus  Zat pengatur tumbuh yang digunakan umumnya menggunakan kombinasi auksin dan sitokinin dengan rasio tertentu. A. Kultur akar kawista yang telah menumbuhkan tunas. B. Kultur daun yang telah menumbuhkan kalus.  c. Kultur antera  menggunakan antera sebagai eksplan.  jaringan yang diproduksi oleh polen selama dikultur juga bersifat haploid.  Embrio yang dihasilkan dari polen bersifat haploid.  Embrio haploid berkembang menjadi tanaman.  Tanaman ini bersifat steril atau tidak menghasilkan biji.  kromosomnya sering terjadi mengalami duplikasi secara spontan pada kultur antera yang melalui tahap kalus sehingga menghasilkan tanaman dihaploid atau haploid ganda yang bersifat fertil.  Perkembangan polen di dalam antera Kultur antera yang menghasilakan plantlet haploid Aplikasi  a) produksi tanaman haploid,  b) produksi galur diploid homozygote melalui penggandaan kromosom, sehingga mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan galur inbred, dan  c) menemukan mutasi atau fenotip resesif. Kultur meristem  Kultur meristem menggunakan eksplan berupa jaringan meristem  Karena jaringan meristem merupakan jaringan vegetatif maka plantlet yang dihasilkannyapun merupakan suatu klon. Oleh karena itu kelompok tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem sering disebut mericlone. Keberhasilan kultur meristem tergantung pada  medium kultur,  keadaan fisiologis eksplan dan  lingkungan fisik tumbuh Jenis-jenis jaringan meristem Kultur kalus  Kalus adalah suatu kumpulan sel hasil pembelahan yang terjadi secara terus menerus namun tidak mengalami diferensiasi.  Sel-sel penyusun kalus umumnya berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain.  Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga mempunyai tekstur yang keras dan kompak.  Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Macam Kalus  kalus kompak  kalus remah Tujuan kultur kalus  memperoleh kalus dalam jumlah yang lebih banyak  memperoleh embrio somatik atau organ yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.  Kalus juga digunakan sebagai bahan pembentukan kultur suspensi sel. Kultur suspensi sel umumnya digunakan untuk produksi metabolit sekunder. kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung juga dari  a) umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi, b) musim pada waktu bahan tanaman diisolasi,  c) bagian tanaman yang dipakai, dan  d) jenis tanaman. Kultur suspensi sel tunggal  Kultur suspensi sel adalah kultur yang berisi kumpulan atau agregat-agregat sel yang berasal dari potongan kalus  Inisiasi dilakukan dengan cara yang sederhana yaitu dengan memindahkan kalus segar ke dalam media cair dalam botol erlenmeyer dan dikocok dengan meletakkannya diatas shaker dengan kecepatan antara 70-100 rpm. Kultur suspensi sel. A. Botol berisi kultur suspensi sel. B. Aerasi untuk memberi oksigen pada kultur suspensi sel. C. Aplikasi  (i) sumber sel untuk mendapatkan protoplasma;  (ii) sumber sel yang akan diberi perlakuan induksi mutasi;  (iii) bahan untuk mempelajari hubungan inang dan penyakit dalam fitopatologi;  (iv) metoda produksi bahan metabolit sekunder; dan  (v) sumber sel untuk media seleksi. Kultur protoplas  menggunakan eksplan berupa sel tumbuhan yang telah dilepas bagian dinding selnya.  Protoplast tanaman dapat diisolasi secara mekanik maupun secara enzimatik dari hampir semua bagian tanaman, seperti akar, daun, nodul akar, koleoptil, kultur kalus dan daun in vitro.  Kultur protoplas biasanya dilakukan untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma yang berasal dari spesies yang berbeda. Fusi protoplas. A. Bentuk protoplast. B. Hibridisasi sel soma dari dua spesies yang berbeda.