Primer Parcial Trabajo Práctico de Tecnología de los Alimentos y Biotecnología PDF

E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. TRABAJO PRÁCTICO N° 2 INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA OBJETIVO: -Desarrollar habilidades en diversas técnicas microbiológicas -Preparar cultivos microbiológico...

E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. TRABAJO PRÁCTICO N° 2 INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA OBJETIVO: -Desarrollar habilidades en diversas técnicas microbiológicas -Preparar cultivos microbiológicos para su reconocimiento. - Utilizar de forma adecuada los diferentes instrumentos en el campo de la microbiología. INTRODUCCIÓN: La microbiología es rama de las ciencias naturales que se ocupa del estudio de los microorganismos en sentido amplio (desarrollo, morfología, comportamiento, etc). Como algunos ejemplos de microorganismos podemos nombrar las bacterias, algunos protozoos, virus, parásitos y hongos. Características de los microrganismos:  Sus reacciones metabólicas son muy veloces.  La relación que mantienen con el medio es intensa.  Tienen la capacidad de alterar el medio en el cual se encuentran.  Se reproducen a una gran velocidad. . Su tamaño es tan reducido que son imperceptibles a simple vista. BACTERIAS: son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros (por lo general entre 0,5 y 5 μm de longitud) y diversas formas. Su estructura en general es la siguiente: CLASIFICACION DE BACTERIAS; Se clasifican de acuerdo a varios criterios (Morfología, respiración, pared celular, temperatura y nutrición) 1 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. SEGUN SU TEMPERATURA Tipo Temperatura de crecimiento Temperatura optima TERMOFILAS Entre 40°C y 60°C De 55°C a 75°C MESÓFILAS Entre 5°C y 45°C De 30°C a 45°C PSICRÓFILAS Entre 5°C y 20°C De 12°C a 15°C PSICRÓTROFAS Entre 5°C y 35°C De 25°C a 30°C MEDIO DE CULTIVO: Es una preparación realizada en el laboratorio en condiciones estériles, que contienen las sustancias necesarias para la vida vegetativa de los microorganismos en desarrollo. Su composición es similar al medio en que se desarrollan los gérmenes en la naturaleza. Entre los componentes principales de un medio de cultivo se pueden mencionar: El agua, proteínas degradadas, hidratos de carbono, sales inorgánicas, indicadores, etc... Para que un medio de cultivo sea eficiente, es decir que se dé el desarrollo de los microorganismos a estudiar sea de manera correcta, debe tenerse en cuenta: a) Que la composición sea exacta y cumpla el fin previsto. b) Que tenga un PH adecuado. 2 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. c) Estar totalmente esterilizado el ámbito de trabajo y los materiales. d) Estar protegido de forma adecuada de la contaminación exterior. e) Utilizar según las condiciones que rigen cada medio. A los medios de cultivo líquidos se les puede adicionar agar, un gelificante (polisacárido) proveniente de algas marinas, que tiene la propiedad de actuar si éste es llevado al punto de ebullición del medio en el que se encuentra para poder luego solidificar en frío. De acuerdo a la cantidad de agar que contiene el medio de cultivo, éstos se clasifican en: - Líquidos: con 90% - 95% de agua, sin agar. - Semisólidos: con 0,1% - 0,3% de agar. - Sólidos: con 1,5 a 2% de agar. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: - Agar. Se utiliza como agente solidificaste. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. - Azúcares: Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa, etc. - Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. - Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales. - Fluidos corporales. Sangre completa, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos. - Buffers: Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos. - Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. - Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato. - Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. - También los medios de cultivos pueden clasificarse de acuerdo a su procedencia: Animal, vegetal y sintética o al uso que se le da: uso generales o especiales, aislamiento, reproducción, conservación, enriquecimiento, análisis o conteo. METODOS DE AISLAMIENTO BACTERIANO PUROS 3 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. En términos microbiológicos se entiende por siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. Un cultivo puro aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas. Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente iguales y constituyen un clon. Uno de los métodos más utilizados es el de agotamiento por estrías en placas de Petri o en tubos mediante el llamado pico de flauta o agar inclinado. De esta forma, en un recipiente de poco diámetro gran altura, como un tubo de ensayo, se logra exponer una gran superficie, favoreciendo la reproducción de bacterias aerobias. Para realizar este procedimiento se utilizan un matraz con el caldo o tubos de ensayos perfectamente sellados y luego se lo transvasa a las diferentes cajas de Petri. RECUENTO BACTERIANO Las bacterias se reproducen de forma exponencial, formando una colonia, que poseen diferentes formas, por tal motivo y de acuerdo al medio donde se realice el crecimiento, se realiza esta técnica, siendo su resultado el número de bacterias viables y no viables. Para ello se utiliza el microscopio, como instrumento óptico. RECUENTO EN PLACA: Es un método muy utilizado cuando se necesita determinar el tamaño de la población bacteriana de una muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollará una colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homogénea con respecto a su composición microbiológica, es posible que una colonia se origine de un microorganismo o de cientos de ellos, dando en este último caso un recuento menor del real. También es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este caso el recuento también será inferior al real. Lo que sí se sabe es que cada colonia observada se formó a partir de por lo menos un microorganismo. Esta es una condición necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos 4 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. de los cálculos. Se admite, por lo tanto, que, en los métodos de recuento de microorganismos vivos, son inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan muestras pequeñas, es posible cometer grandes errores. La forma corriente de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias es la realizando diluciones seriadas 1/10 de una suspensión bacteriana o de una muestra en ensayo y sembrar volúmenes medidos de varias de ellas, de modo de obtener colonias separadas. Esto se logra cuando el número de colonias por placa de Petri es entre 30 y 300, dependiendo del tamaño de las colonias originadas. En general, por encima de ese límite hay superposición de colonias y por debajo de él la significación estadística es muy pobre. Las siembras se pueden hacer: -Por diseminación: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado, contenido en la placa, de volúmenes de 0,1 –0,2 ml de las diluciones correspondientes. - En profundidad: incorporando el inóculo en un volumen de medio fundido, mantenido a temperaturas compatibles con la viabilidad microbiana (aproximadamente 45°C), que luego se vuelca en una placa de Petri y se deja gelificar. Los volúmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen del medio. Luego de la incubación en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la concentración de UFC presentes en una suspensión se calcula multiplicando el número de colonias por placa, promedio de varias placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y dividiendo por el volumen sembrado: - La concentración de microorganismos viables puede ser estimada por el método del número más probable (NMP). Este método infiere matemáticamente el recuento de viables a partir de la fracción de cultivos en tubos que no muestran crecimiento. Consiste en realizar varias diluciones de la muestra, inocular varias réplicas de las mismas en tubos conteniendo un medio de cultivo apropiado y registrar el número de tubos con crecimiento en cada dilución. Este método si bien no es muy efectivo, debido a la gran cantidad de materia que puede perderse en cada una de las diluciones que se realiza. Las distintas colonias pueden clasificarse de acuerdo a su taxonomía 5 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. PROCESOS DE ESTERILIZACION: La asepsia y antisepsia son las acciones conseguidas por la esterilización y la desinfección, respectivamente. Son dos procedimientos de lucha antimicrobiana. Concepto de asepsia: etimológicamente significa "sin putrefacción'. Ausencia de materia séptica; estado libre de infección (definición del Diccionario de la Real Academia) La asepsia produce la ausencia de todo germen y de cualquiera de sus formas de resistencia, suprimiendo el aporte de microbios y su penetración. El resultado de una técnica de asepsia correcta es la esterilización. Concepto de antisepsia: etimológicamente significa "contra la putrefacción". Método que consiste en combatir o prevenir los padecimientos infecciosos, destruyendo los microbios que los causan. El procedimiento de antisepsia es la desinfección. 6 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. La esterilización es un procedimiento que consiste en destruir todos los gérmenes que existen en una muestra u objeto que se quiera tener libre de forman completa. Es un fenómeno que, a diferencia de la desinfección, es total. Según el procedimiento de esterilización que se utilice, se puede clasificar en físicos y químicos. PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÓN FISICOS: a) POR CALOR HUMEDO: Se realiza por calentamiento en un líquido (normalmente agua), utilizando su vapor. Este puede ser: ABIERTO: No se ejerce presión en donde se realiza. El material que desea esterilización se sumerge en agua a ebullición durante el tiempo necesario. CERRADO O A PRESION: Se utiliza un aparato llamado “AUTOCLAVE”, en el cual se introduce el material dentro y cerrando el equipo (se suele esperar hasta que la presión interior y exterior sea de 2 atm aproximadamente) se espera un tiempo determinado y definido. (Por ejemplo, 2horas hasta los 120°C o 15 minutos hasta los 110°C). La acción conjunta de la temperatura y el vapor produce la desnaturalización de las proteínas de los microorganismos, las cuales son las encargadas de la reproducción de los mismo. TYNDALIZACION: Consiste en un calentamiento a baño maría en forma discontinua o en intervalos. Por ejemplo: Se calienta el producto a 100°C durante 2 minutos y se repite esta operación durante 3 o más veces con pausas de tiempo. Este procedimiento se puede realizar cada 24 horas. b) POR CALOR SECO: Se utiliza la llama directa de un mechero o aire caliente (estufas, hornos, etc.…). RADIACIÓN: puede ser utilizada como agente para la inactivación de microorganismos por su efecto sobre los ácidos nucleicos principalmente (por ejemplo, radiación gamma) IONIZANTES: son altamente penetrantes, lo que permite esterilizar grandes volúmenes. Éstas actúan ionizando moléculas a su paso y no producen aumento de temperatura, por lo que también se llaman esterilizaciones en frío. c) PASTEURIZACION (SE VERÁ MÁS ADELANTE EN EL CAPITULO DE PRODUCTOS LACTEOS) d) POR FILTRACIÓN: Especialmente indicado en el caso de líquidos, pudiendo utilizarse también en gases. Se utiliza este proceso cuando el líquido no puede existir sin descomponerse por la acción de la temperatura. La filtración se puede realizar por presión o por aspiración en aparatos denominados filtros, cuya parte principal es el elemento poroso construido de diversos materiales: porcelana porosa, amianto, asbesto, arena, etc. Generalmente como paso previo se realiza la centrifugación, para separar el sólido. e) POR ULTRA FILTRACIÓN: Se realiza a través de membranas o materiales coloidales. f) ELECTROFILTRACION: Se utiliza la filtración, pero con energía eléctrica (electroósmosis o electrodiálisis), no dejando pasar la partícula, virus o bacteria por una membrana semipermeable con gasto o sin gasto de energía, dependiendo el caso. METODOS QUIMICOS: Entre los métodos químicos podemos nombrar como el más utilizado el de sustancias llamadas bactericidas, que actúan sobre los microorganismos frenando el crecimiento (inhibición). Entre ellos podemos nombrar: Sustancias gaseosas, Coagulantes, oxidantes, alterantes, deshidratante, sustancias que provocan acción oleodinámica de los metales. Estas sustancias que actúan en la esterilización pueden encontrarse en cualquiera de los tres estados 7 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. de la materia.También como método de esterilización se pueden nombrar los métodos mixtos, los cuales son el uso simultaneo o combinados de ambos. TINCIONES: Para observar las bacterias teñidas es necesario, en primer lugar, hacer un frotis de las bacterias y fijarlo. La tinción simple es la tinción en que se utiliza un solo colorante. Como colorantes se utilizan el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza básica. Esta técnica permite observar la morfología y tamaño de las bacterias, así como los tipos de agrupaciones que forman. La tinción de Gram es la tinción diferencial más utilizada en Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:  Primer colorante. Es un colorante básico que, en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta. -Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados. Suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo – yoduro, llamada lugol. -Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, etanol-acetona (1:1) o etanol únicamente. -Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina o la fucsina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias Gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias Gram negativas, las recubre una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula. Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras que las Gram- negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la reacción es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas. 8 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. Crecimiento bacteriano: El crecimiento bacteriano se da en cuatro etapas bien definidas: 9 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. EL MICROSCOPIO Es un instrumento que permite observar elementos muy pequeños e invisibles a simple vista. El aumento de un microscopio va desde 25 a 1500 veces. ¿Qué es lo que puede observar usted con el microscopio? Aquí indicaremos algunos ejemplos: CELULAS: Es la uunidad anatómica fundamental de todos los organismos vivos, generalmente microscópica, y está formada por varias organeras. Se clasifican en células eucariotas (Aquellas que poseen núcleo) y procariotas (Aquellas que poseen no poseen núcleos), animal o vegetal dependiendo de su procedencia. GLOBULOS ROJOS: Componente de la sangre que se encarga de transportar sustancias importantes para el cuerpo. MICRORGANISMOS: Son todos aquellos seres vivos que están conformados por una sola célula(unicelulares) y solo pueden observarse al microscopio (ej.: bacterias) ELEMENTOS QUE COMPONEN AL MICROSCOPIO: PARTE MECANICA: 10 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. 1-TUBO: Es un tubo hueco que separa los dos grupos de lentes (ocular y objetivo) 2-TORNILLO MACROMETRICO O DE ENFOQUE: Acerca o aleja rápidamente el objetivo a la preparación para hacer un enfoque aproximado. Se usa solo con un objetivo de menor aumento. 3-TORNILLO MICROMETRICO: Permite enfocar con precisión, moviendo muy lentamente el objetivo. 4- BRAZO: Se utiliza para trasladar el microscopio e inclinarlo. 5-PLATINA: Sobre ella se coloca el preparado, sujeto por pinzas metálicas. 6-PIE: Sostiene el microscopio. PARTE OPTICA: 7-OCULAR: lente ubicada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos. 8-OBJETIVO: lente ubicada en el revólver. Amplía la imagen. 9-REVOLVER PORTA OBJETO: Permite colocar en posición de trabajo a los distintos objetos. 10-DIAFRAGMA: Permite graduar la luz. 11-ESPEJO: Refleja la luz que ilumina el preparado. 12: CONDENSADOR: Es un sistema de lentes situado debajo de la platina que concentra la luz sobre la preparación, consiguiéndose así una iluminación más intensa. NORMAS PARA EL USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1.-Quitar la funda protectora del microscopio. 2.-Enchufar/encender el microscopio. 3.-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de una panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior. 4.-Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente. 11 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. 5.-Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetándola con las pinzas/guías. 6.-Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo macro métrico. 7.-Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir observando a mayor aumento. 8.-Cambie al objetivo de mediano aumento (20 X) y para lograr el enfoque siga moviendo lentamente el tornillo macro métrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son para focales, es decir, una vez logrado el primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superior la imagen queda en un foco aproximado y solo se debe realizar un ajuste. 9.-Realice la observación y haga sus anotaciones. Determine cuál es la estructura que va a observar a mayor aumento y colóquela en el centro del campo. 10.-Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el objetivo anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar girando única y lentamente el tornillo MICROMÉTRICO. NUNCA se debe utilizar el tornillo macro métrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo. 11.-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación moviendo constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra o cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Haga sus observaciones. 12.-Una vez finalizada la observación, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de menor aumento. 13.-Retire la muestra. 14.-Limpie la lente objetiva si usó medio de inmersión, apague la/s lámpara/s. 15.-Cubra el microscopio con la funda protectora. 16-Mantenga siempre limpio el equipo. Recomendaciones para un uso adecuado: 1- NUNCA dañar, rayar, dejar caer las lentes u otros componentes ópticos. 2- NUNCA forzar los controles de foco. 3-NUNCA tocar las superficies ópticas. DETERMINACION DE AUMENTO Para conocer el aumento total se multiplica el aumento del objeto (grabado en la montura del lente) por el aumento del ocular (También indicado en la montura). Esto sique una serie de código de colores En los microscopios que usted está utilizando... COLOR:.................................. AUMENTO:........................................... COLOR:.................................. AUMENTO:........................................... COLOR:.................................. AUMENTO:........................................... La resolución de un objetivo depende de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica del objetivo. La relación exacta entre estos parámetros es la siguiente: 12 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. POR EJEMPLO: Si el aumento del ocular es 20 X y el del objetivo es de 10 X el aumento total será de 200x (Solo debe realizar 20x10) TIPOS DE MICROSCOPIOS: No todos los microscopios se utilizan de la misma manera y sirven para los mismos ensayos. A continuación, haremos una breve descripción de los distintos tipos que existen: MICROSCOPIO OPTICO: En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto significa que existe un foco de luz apuntando hacia la muestra. Esa misma luz es conducida a través del objetivo y del ocular hasta llegar a formar la imagen en el ojo del observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución está limitada por la difracción de la luz. El máximo aumento que se puede obtener con este tipo de microscopio alcanza alrededor de 1500x. ¿COMO FUNCIONA ESTE TIPO DE MICROSOPIO? El funcionamiento del microscopio óptico se basa en un SISTEMA DE DOS LENTES (OBJETIVO Y EL OCULAR.) DONDE EL RAYO DE LUZ ATRAVIESA LA LENTE CREANDO UNA IMAGEN MÁS AMPLIADA Y VIRTUAL DE LA MUESTRA (ANTE CUALQUIER DUDA REVISE LOS CONCEPTOS DE FISICA VISTOS DURANTE 3° AÑO EN OPTICA) MICROSCOPIO ELECTROINICO En este tipo de microscopio la muestra no es iluminada con luz, sino que se utilizan ELECTRONES. Los electrones impactan contra la muestra dentro de una CÁMARA DE VACÍO. Existen diferentes tipos de microscopio electrónico pero su principio de funcionamiento se basa siempre en capturar los electrones dispersados u omitidos por la muestra y así poder reconstruir una imagen. La ventaja principal de este tipo de microscopio es que puede obtenerse un nivel de AUMENTO MUY SUPERIOR al del resto de microscopios. Sin embargo, es necesario preparar la muestra y colocarla en una cámara de vacío de modo que no es posible observar muestras biológicas vivas. Los dos tipos de microscopio electrónicos principales son el MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO y el MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN. MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA: 13 Prof. Fernando A. Trinidad E.T N° 8 D.E 13 R. V “PAULA A. DE SARMIENTO” TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. También conocido como MICROSCOPIO PETROGRÁFICO. Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos POLARIZADORES. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar ESTRUCTURAS CRISTALINAS de rocas y minerales. MICROSCOPIO FLUORESENCIA LOS MICROSCOPIOS DE FLUORESCENCIA SON AQUELLOS QUE UTILIZAN LAS PROPIEDADES DE FLUORESCENCIA PARA GENERAR UNA IMAGEN DE LA MUESTRA. ESTE MICROSCOPIO PERMITE OBSERVAR SUSTANCIAS QUE EMITEN LUZ PROPIA CUANDO SON ILUMINADAS CON UNA LONGITUD DE ONDA DETERMINADA. PARA ELLO LA MUESTRA ES HABITUALMENTE ILUMINADA CON UNA LÁMPARA XENÓN O CON UNA LÁMPARA DE VAPOR DE MERCURIO. ESTOS MICROSCOPIOS INCORPORAN ADEMÁS FILTROS DE LUZ PARA AISLAR LA LUZ CORRESPONDIENTE A LA MUESTRA. MICROSCOPIO DIGITAL Son aquellos que capturan una IMAGEN DIGITAL de la muestra. Esto se consigue conectando una cámara digital en lugar del ocular. Existen microscopios digitales con distintas configuraciones. Habitualmente deben conectarse al ORDENADOR para poder transmitir las imágenes y a continuación visualizarlas. También es cierto que existen microscopios digitales con una PANTALLA INCORPORADA. Estos permiten ver la muestra en la pantalla y almacenar imágenes que pueden transmitirse a continuación a un ordenador mediante CONEXIÓN USB o TARJETA SD. MICROSCOPIO CAMPO OSCURO: Esta técnica de microscopía consiste en iluminar la muestra oblicuamente. De este modo los rayos de luz que llegan al objetivo no provienen directamente del foco de luz, sino que han sido dispersados primero por la muestra. Esta técnica permite ver muestras que de otro modo no serían visibles debido a su transparencia. También tiene la ventaja que no requiere teñir la muestra para aumentar su contraste y poder observarla. MICROSCOPIO CAMPO CLARO Este es muy sencillo de utilizar y es uno de los más utilizados en las distintas industrias. Los objetivos pueden visualizarse debido a los diferentes contrastes que presentan en comparación con el medio. Es muy utilizado en las técnicas de tinciones, por ejemplo, para la clasificación de bacterias. Se utilizan objetivos de 10X, 40 X o 100X.También los microscopios pueden clasificarse de acuerdo a la cantidad de oculares que posee. (Simples o dobles). 14 Prof. Fernando A. Trinidad  6°1° T.T- AÑO……. TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. INTRODUCCIÓN ALUMNO ET N° 8 DE 13 “PAULA A. DE SARMIENTO”  TP TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA (TEORIA) 6°1° T.T - INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS BROMATOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS Los análisis bromatológicos son la evaluaciones físico-químicas de la materia que compone a los nutrientes, pues etimológicamente se puede definir a la Bromatología como Broma, ‘alimento’, y logos, ‘tratado o estudio’, es decir, que la Bromatología es la ciencia que estudia los alimentos, sus características, valor nutricional y adulteraciones. Para ello se realizan diversos análisis en laboratorio para establecer si los resultados obtenidos, cumplen o no con los diversos parámetros establecidos por el código alimentario argentino (C.A.A). DETERMINACIONES Y ENSAYOS REALIZADOS EN BROMATÓLOGIA Dentro de un gran número de determinaciones que pueden realizarse en el laboratorio, las más frecuentes son los análisis de determinación de nutrientes, o factores químicos como por ejemplo determinación de cenizas y posterior análisis cualitativo de la misma, Determinación de grasas ( Extracción o método soxhlet), Determinación de nitrógeno volátil en productos de alto contenido de proteínas, Porcentaje de acidez (Utilizando la volumetría como técnica más empleada), para la determinación de cantidad de un ácido presente, etc. También es muy importante la realización de parámetros físicos como densidad, determinación de humedad, entre otros. No debe dejar de mencionarse que también estas determinaciones se pueden realizar mediante instrumental tales como el refractómetro, polarímetro, cromatógrafo ( HPLC), espectrofotómetro de absorción atómica o uv vis, etc. PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA REALIZACION DEL ANALISIS Para la realización de los análisis de control de calidad de los alimentos, deben seguirse rigurosas reglas en la preparación y cuidado de las muestras. -La muestra del alimento a analizar debe ser homogénea y representativa del lote del que fue extraída, pues uno de los errores comunes es enviar al laboratorio de bromatología una muestra no representativa. -Debe estar rotulada correctamente indicando n° de lote, Fecha de vencimiento, Partida, Fecha en la que se realizó la extracción y el analista que realiza dicho proceso. -Debe realizarse en condiciones adecuadas de seguridad e higiene, evitando diversas alteraciones físicas, químicas y/o biológicas. -La muestra debe ser tratada con los materiales adecuados y deben realizarse todos los ensayos por triplicado como mínimo, para un resultado confiable y seguro. RESULTADOS OBTENIDOS DE LOS ENSAYOS - Los resultados obtenidos deben estar estrictamente correctos, respetando los parámetros establecidos y teniendo en cuenta los límites de tolerancia para su aprobación, debiendo figurar al lado la técnica empleada, con su norma correspondiente. Los ensayos a realizar se regirán generalmente bajo la FARMACOPEA o técnicas empleadas por organismos pertinentes, que aseguren la calidad a la hora de realizarlos. INTRODUCCIÓN A LA INDUSTRIA ALIMENTARIA (NORMATIVA) La preocupación por la seguridad sanitaria de los alimentos ha sido una constante desde la edad media, como lo demuestran las diferentes medidas legislativas que han sido tomadas para prevenir la venta de alimentos adulterados, en mal estado o contaminados. Para ello se logró realizar un sistema que permita durante los procesos de elaboración de alimentos, poder verificar en las distintas etapas del proceso si existe un peligro de contaminación o algún factor que altere la producción del mismo. Para ello se utilizan los denominados análisis de puntos de control crítico (APPCC) y puntos de control critico (PCC). Un Punto de Control Crítico (PCC) es un punto, operación o etapa que requiere un control eficaz para eliminar o minimizar hasta niveles aceptables un “peligro para la seguridad alimentaria”. A continuación, mencionaremos una serie de terminologías utilizadas para poder entender con mayor claridad lo planteado anteriormente. Peligro: Es una propiedad biológica, física o química de un producto alimenticio que tiene potencialmente, capacidad para originar daño al consumidor o afectar su salud. 1  TP TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA (TEORIA) 6°1° T.T - Contaminación: Se define así a la alteración de cualquier materia prima o producto terminado, cuyas propiedades organolépticas, físicas, químicas o bacteriológicas se encuentran modificadas y no se ajustan a las normas mínimas legales vigentes de seguridad alimentaria, calidad y nutrición. Contaminación cruzada: Es la contaminación que se traslada por un operador, materia prima, producto o equipamiento hasta otro operario. Este tipo de contaminación suele ocurrir muy a menudo, causando la suspensión de la producción. Por ejemplo, si un operario manipula alimentos crudos y luego productos cocidos sin lavarse las manos, trasladará todos los microorganismos del primero al segundo, existiendo un peligro biológico. Calidad: Es la condición en que un alimento especifico satisface los deseos del consumidor o conjunto de consumidores, respetando los patrones de sanidad, nutrición, tipificación y variedad, luego de haberse certificado la misma. Consumidor: Es toda persona o grupo de persona que procure alimentos para consumo propio o de terceros. ETAPAS DEL PROGRAMA APPCC a) TIPOS DE PELIGROS: Los peligros pueden ser clasificados en tres categorías diferentes: De origen biológico: Se suelen asociar a microorganismos (generalmente bacterias patógenas) que originan infecciones e intoxicaciones transmitidas por los alimentos. De origen químico: Se da por la utilización de diversos productos químicos para la producción de alimentos. Suele ser el caso de los pesticidas (en frutas y verduras principalmente), aditivos (en alimentos de elaboración industrial) o la utilización de sustancias no permitidas por la normativa vigente. Para ello se establece una concentración máxima de utilización. Algunos ejemplos pueden ser: Presencia de metales como plomo, cadmio, cobre o mercurio, disolventes u otras sustancias. De origen físico: Los peligros de origen físico son originados por materiales extraños que pueden entrar a formar parte del producto alimenticio en cualquier etapa desde el procesado de la materia prima hasta el consumo del producto. Los materiales extraños pueden ser macroscópicos o microscópicos, los cuales suelen encontrarse disueltos o dispersados en el producto. Por ejemplo, presencia de plásticos, metales, etc. También puede decirse que un peligro es físico si se logra alterar algún factor exterior que cause perdida en las propiedades del alimento. Un caso muy conocido es la perdida de la cadena de frio en algunos alimentos como los lácteos. b) ORIGEN DE LOS PELIGROS: La contaminación de los alimentos puede producirse en un gran número de situaciones. El conocimiento previo de los peligros potenciales y su origen puede ser útil para controlar tales peligros. Los mismos pueden proceder de cinco fuentes principales: La materia prima, las diferentes etapas del proceso, la maquinaria o equipamiento utilizado durante el proceso, la manipulación de los alimentos o los ingredientes y las condiciones ambientales. 1. Materias primas: Las materias primas son la fuente primaria de contaminación. Un fallo en el cumplimiento de los principios básicos de garantía de la calidad en las materias primas puede dar lugar a productos alimenticios que sean inseguros para el consumo. Los procedimientos habituales que se emplean para garantizar la calidad de las materias primas están relacionadas con: – La identificación y el mercado. – Las condiciones de almacenamiento. – Los requisitos de manipulación. – La preparación y el procesado. – El aislamiento de las materias primas no aptas. En general debido a la composición de las materias primas, las más peligrosas suelen ser las carnes (Derivadas de todo tipo) y los productos lácteos. 2. Etapas del procesado: 2  TP TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA (TEORIA) 6°1° T.T - La falta de control de las operaciones de procesado puede dar lugar a situaciones peligrosas. Los fallos en el mantenimiento de las condiciones de procesado, como las variables temperatura/tiempo, los retrasos en el procesado, la utilización de formulaciones o procedimientos incorrectos, son alguno de los ejemplos de peligros durante un proceso. 3. Maquinaria Un equipo sucio o no higienizado puede favorecer fácilmente el crecimiento de microrganismos u otro tipo de peligro. Los fallos en el mantenimiento de la esterilidad del equipo cuando esta se establece como requisito, dan lugar por ejemplo a contaminación microbiana. Durante la elaboración de un producto, el mantenimiento de cada una de las maquinarias es un aspecto muy importante en un programa de gestión de la seguridad sanitaria, el cual reduce considerablemente el potencial peligro. 4. Manipulación de alimentos: Con la introducción de maquinaria de alta velocidad y muy automatizada, se procesan, almacenan y transportan a los centros de distribución y las cadenas de venta enormes cantidades de productos alimenticios. Por lo tanto, la seguridad sanitaria de los alimentos depende no solo de las características de procesado, sino también de la manipulación durante el transporte y almacenamiento y consumición del producto. Los mismos pueden darse mediante una higiene incorrecta de las manos, como de los medios de manipulación de alimentos, aumentando el riesgo de que exista peligro y contamine los mismos. 5. Condiciones ambientales: Los peligros debido a las condiciones ambientales pueden afectar a las materias primas, el procesado y la maquinaria. La contaminación por ejemplo del agua, suelo o mismo del ambiente de trabajo, producto de sustancias no deseadas, puede ocasionar resultados alarmantes a lo largo de la cadena alimentaria, ocasionando daños inmediatos tanto al personal como al consumidor. ¿Qué medidas pueden tomarse para el control de peligros? Determinando el origen previamente de un posible peligro, para cada uno se deberá tomar una medida diferente. Veamos un ejemplo: ¿Qué recaudos deben tenerse para la manipulación correcta de la materia prima?, Pues bien, suponiendo que fuera carne cruda, una medida correcta seria mantener la zona lo más higienizada posible, utilizando productos permitidos para la desinfección de la maquinaria y evitando el contacto de la carne cruda con la cocida. Esto se puede realizar teniendo separadas las zonas de áreas de trabajo, y que no tengan en ningún momento contacto entre sí, como así tampoco su personal durante el proceso de elaboración y/o control. Un programa de APPCC, debe tener en cuenta los potenciales peligros de contaminación en todas las etapas de la producción, distribución, venta y consumición del alimento. Para ello, en cada una de las etapas , debe realizarse los controles pertinentes como así también tenerse en cuenta los recaudos necesarios para reducir el riesgo de peligro. Para ello se debe realizar: – Controles y ensayos antes, durante y posterior al proceso, determinando parámetros físicos, químicos y biológicos. – Higienización de cada una de las zonas de trabajo. – Vigilancia de la manipulación de cada uno de los productos. – Que el alimento, en caso de ser envasado, contenga todos los datos sobre la partida elaborada (N° lote, fecha de elaboración y caducidad, componentes y sustancias declaradas) – Garantizar un transporte adecuado según el alimento. PCC (Puntos críticos de control) Un punto de control es un sistema que se utiliza para establecer parámetros, que por fuera de ellos da lugar a un inaceptable riesgo para la salud. Para ello, se establece una clasificación determinada, siendo la misma PCC1 y PCC2. El primero se establece como un paso o una etapa en un sistema de procesado de alimentos que por si mismo es 3  TP TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA (TEORIA) 6°1° T.T - eficaz, mientras que el segundo es una etapa del sistema de procesado de alimentos que contribuye al control de un peligro, pero que no garantiza su eliminación total. Varios aspectos claves a considerar en la determinación de puntos críticos son: 1. No restringir los PCC en un número máximo y mínimo. 2. Un PCC es específico de un producto y un proceso. 3. Los PCC no deben duplicarse. 4. Los PCC deben ser determinados siempre con asesoría de experto cuando existe alguna duda sobre un proceso o producto. REVISIÓN, AUDITORIA Y PROCESO DE RETIRADA DE UNA PARTIDA DE ALIMENTOS El programa de APPCC tiene un sistema de gestión de calidad muy dinámico y es por ello que se realizan exhaustivos controles para asegurar la calidad del mismo. Parte del proceso consiste en la revisión y auditoria del cumplimiento de los mismos, esto significa que una persona física deberá controlar que todas las etapas del proceso se estén cumpliendo de forma favorable y dejarlo expresado por escrito el cumplimiento del mismo. Para ello se trabaja con documentos legales que dejan constancia de los mismos. En caso que se observe el no cumplimiento de alguno de los parámetros establecidos de calidad, se procede directamente a la retirada de la venta del producto en cuestión, estableciendo las causas de retiro del mismo. Para ello, debe tenerse en cuenta los siguientes datos: – Nombre y tipo de producto. – Tamaño y envase, realizándose una descripción del mismo. – Cualquier otro detalle de la retirada del mismo. – El motivo de la retirada. – La necesidad de identificar y poner dicho producto en cuarentena. – El procedimiento para la eliminación. _ Si el peligro para el consumidor es grave indicando los síntomas clínicos, los cuales deben estar abalados por un profesional de la salud. Una vez retirado el producto del mercado, debe comunicarse mediante documento oficial hacia todos los consumidores, la siguiente información: – El nombre y el producto, con su tamaño de envase. – El motivo de la retirada. – La/s causa/s del problema. ¿Cuáles son los principales organismos en Argentina de control y auditorias en alimentos? - La Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) creada en el año 1992, y es tomada como el ente madre en controles y auditorias de alimentos dependiente del ministerio de la salud. -Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) -El Instituto Nacional de Alimentos (INAL). ¿Cuáles son las principales razones por las cuales se retira una partida de un alimento de la venta al público? - Que el alimento se encuentre con parámetros fuera de los establecidos según C.A.A - Que el alimento no cumpla con parámetros según la clasificación a la cual pertenece, en este caso puede hablarse de alimento falsificado. 4 TP TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA (TEORIA) 6°1° T.T - - Adulteración de algún componente o agregado intencionado de sustancias prohibidas (Aditivos o conservantes). A continuación veremos un ejemplo extraído de la página de la ANMAT, sobre el retiro de una partida: La ANMAT informa a la población alérgica a la soja que la empresa HOJALMAR S.A (RNE Nº 02- 030.432/02-032.454) se encuentra realizando el retiro preventivo del mercado de los siguientes productos: Bizcochos dulces de hojaldre, nombre de fantasía: Snack matero azucarado, “Hojalmar”, peso neto: 180 g, RNPA Nº 02-588.258. Bizcochos de hojaldre, nombre de fantasía: Snack matero salado, “Hojalmar”, peso neto: 180 g, RNPA Nº 02-710.207. Esta medida se debe a que los productos no cuentan con la adecuada declaración de alérgenos (Art. 235 7° del Código Alimentario Argentino), ya que no incluyen la frase de advertencia “PUEDE CONTENER SOJA” en sus rótulos. 5