Fascicule Biotechnologie Moléculaire PDF (2020-2021)

8 DEPARTEMNT DES SCIENCES BIOLOGIQUES Mastère de Recherche « Biologie Moléculaire et Cellulaire » Module optionnel Biotechnologie Moléculaire Fascicule de Travaux Pratiques et Dirigés...

8 DEPARTEMNT DES SCIENCES BIOLOGIQUES Mastère de Recherche « Biologie Moléculaire et Cellulaire » Module optionnel Biotechnologie Moléculaire Fascicule de Travaux Pratiques et Dirigés Elaboré par : Maha MEZGHANI KHEMAKHEM & Souheila GUERBOUJ KHEDHER Année Universitaire 2020-2021  TP/TD Biotechnologie Moléculaire Lors de ces TP vous allez isoler des locus microsatellites à partir d’une banque génomique enrichie en microsatellites obtenue à partir de l’ADN du puceron Aphis spiraecola. L’objectif est de vous faire découvrir les principales étapes d’isolement de locus microsatellites puis d’analyser vos résultats. Vous devez porter une blouse blanche et aussi mettre des gants. La blouse et les gants vous assurerons une protection lorsque vous manipulerez les réactifs chimiques et les bactéries. En outre, vous éviterez de contaminer les réactifs par les molécules présentes sur vos doigts. Les Travaux pratiques que vous allez faire sont les suivantes : TP1. Extraction de l’ADN plasmidique : Miniprep TP2. Séquençage automatique TP3. Analyse bioinformatique des séquences d’inserts Les Travaux Dirigés : TD1. Le séquençage de l’ADN : Méthode de sanger TD2. Désignation d’amorces pour l’amplification des locus microsatellites TD3. Génotypage par les marqueurs microsatellites TD4. Application des marqueurs microsatellites 2 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  Isolement de locus microsatellites à partir d’une Biotechnologie M1 BMC banque enrichie Moléculaire Principe Dans une première étape l’ADN génomique est digéré à l’aide de l’enzyme RsaI. Les fragments obtenus sont ensuite ligués à des adaptateurs à chaque extrémité puis amplifié par PCR en utilisant les adaptateurs comme amorces. Dans une seconde étape, les produits amplifiés sont hybridés avec trois sondes microsatellites biotinylées correspondant aux motifs microsatellites (CAA)8 ,(TG)12 ,(AG)12 et les séquences ciblées sont capturées grâce à des particules magnétiques recouvertes de streptavidine. Dans une dernière étape, les fragments capturés sont récupérés par PCR en utilisant les adaptateurs comme amorces et le produit obtenu est cloné dans le vecteur pGEM- T Easy. Construction d’une banque enrichie en microsatellites 3 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem 4 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher Guerbouj Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem Mezghani  TP1 : Extraction d'ADN plasmidique (mini-prep) Biotechnologie M1 BMC Méthode de lyse alcaline Moléculaire Principe de la méthode Après clonage, les bactéries recombinantes contenant les inserts d’intérêt sont sélectionnées. L’ADN plasmidique est alors extrait selon la méthode de lyse alcaline. Le principe consiste en l’utilisation d’une solution fortement alcaline qui permet la formation de pores dans la paroi de la membrane bactérienne et entraîne la dénaturation des acides nucléiques. L’ADN plasmidique est ensuite rénaturé en utilisant une solution neutralisante puis précipité à l’isopropanol. Matériels nécessaires - Shaker. - Vortex. - Centrifugeuse de paillasse et centrifugeuse réfrigérée - Bain marie. - Congélateur à - 20°C. - Microtubes 1,5 mL. - Micropipettes et pointes adaptées. Réactifs chimiques - Milieu LB liquide. - Solution GTE : 50mM glucose, 10mM EDTA et 25mM Tris-HCl. - Solution de lyse (0,2N NAOH et 1% SDS). - Solution neutralisante (K-acétate 1M). - Ethanol absolu et éthanol 70%. - TE 10/1 (10 mM Tris pH8; 1 mM EDTA). Mode opératoire 1. Les colonies positives sont préalablement cultivées pendant une nuit à 37°C dans 5ml de milieu LB liquide contenant de l’ampicilline à raison de 100 µ g/ml. 2. Les suspensions bactériennes obtenues sont soumises à une centrifugation à 4500rpm pendant 15min. 3. Le surnageant est éliminé et le culot contenant les bactéries est resuspendu dans 250µl de solution S1 (GTE : 50mM glucose, 10mM EDTA et 25mM Tris-HCl). 4. Le mélange est vortexé vigoureusement puis incubé pendant 5’ à température ambiante. 5. Ensuite on additionne 250µl d’une solution de lyse fortement alcaline S2 (0,2N NAOH et 1% SDS). 6. La solution est mélangée doucement puis on ajoute 350µl d’une solution neutralisante S3. Le tout est mélangé par inversement pendant 10 à 20 secondes. 7. Ensuite, centrifugation à 10000rpm pendant 10min. Cette étape permet d’éliminer les débris insolubles (membranes, ADN génomique). 8. Transférer le surnageant dans un microtube neuf. 9. Ajouter 650 µl d'isopropanol, mélanger par inversion et laisser précipiter pendant 3 min. 10. Centrifuger 10 min à 13 000 g. 11. Aspirer le surnageant à la micropipette en veillant à ce que le culot reste collé au fond du tube. 12. Ajouter 700 µl d'éthanol 70 % et rincer le culot par inversion 13. Centrifuger 5 min à 13 000 g. 14. Vider doucement le surnageant en veillant à ce que le culot reste collé au fond du tube. 15. Retourner le tube ouvert sur une feuille de papier absorbant et laisser sécher le culot 10 min environ. 16. Reprendre le culot dans 30 µl de tampon TE pH 8 (solution 1). 5 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem 6 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem Extraction d'ADN plasmidique (mini-prep) : Méthode de lyse alcaline Au cours de cette séance de Travaux pratiques, vous effectuerez une mini-extraction d’ADN plasmidique à partir d’une culture de bactéries Escherichia coli, en utilisant la technique de la lyse alcaline. Cette méthode permet de récupérer facilement et rapidement une grande quantité d’ADN plasmidique plus au moins pur, c'est-à-dire peu contaminé par de l’ADN génomique, des protéines (nucléases et autres…) ou d’autres composants bactériens. Principe de la lyse alacaline : Rôle des différentes solutions utilisées Le milieu de culture est d’abord éliminé par centrifugation. Le culot de bactéries est ensuite resuspendu dans la solution 1, qui contient du Tris (tamponne le pH) et de l’EDTA. L’EDTA chélate les cations métalliques divalents (majoritairement le Calcium et le Magnésium), ce qui déstabilise la membrane bactérienne, et inactive les DNases. Les bactéries sont ensuite lysées dans la solution 2. Cette solution contient de la soude (NaOH 0.2M) ainsi que du SDS, qui est un détergent. Les parois bactériennes sont fragilisées à pH basique. De plus, à pH basique, les deux brins de l’ADN se séparent. Le chromosome bactérien, très fragile, se linéarise en grands fragments, mais les deux brins des plasmides, beaucoup plus petits, restent circulaires et donc demeurent associés (contrainte topologique). La solution 3, constituée d’acétate de potassium 3M à pH 5.5, permet aux brins d’ADN de se réapparier de façon complémentaire. L’ADN plasmidique se renature très vite car les brins n’avaient pas pu se séparer l’un de l’autre. La renaturation de l’ADN génomique nécessite plus de temps, et finalement ne peut avoir lieu car ces fragments d’ADN simple brin précipitent sous l’effet de la forte concentration en sels. L’ADN double brin reste en solution. Le SDS est lui aussi éliminé par précipitation. L’ADN plasmidique est finalement précipité par addition d’isopropanol ou d’éthanol. Ces alcools mobilisent l’eau du milieu, ce qui diminue la solubilité de l’ADN. Les charges négatives portées par les phosphates de l’ADN sont neutralisées par les ions potassium ajoutés lors de l’extraction.  Biotechnologie M1 BMC TP2 : Séquençage automatique d’ADN Moléculaire Principe de la méthode Le séquençage est effectué grâce à un séquenceur automatique. Ce dernier permet de réaliser des réactions de séquences et de les lire. Le principe utilisé est celui de la méthode de Sanger qui consiste à amplifier les séquences en présence de di-désoxynucléotides (ddNTP). Ces derniers différents des dNTP par l’absence du groupement hydroxyle (OH) à l’extrémité 3’. Lorsqu’un ddNTP est incorporé au cours de l’élongation du brin complémentaire, l’ADN polymérase ne peut plus créer de lien entre la position 3’ de ce nucléotide et le phosphate en 5’ d’un autre nucléotide, ce qui entraîne l’arrêt de la synthèse. Les di-désoxynucléotides utilisés en séquençage automatique sont marqués par 4 fluorochromes de couleurs différentes (fluorescéine, NBD, rouge Texas et tétraméthylrhodamine). La couleur de chaque fragment d’ADN synthétisé dépend donc du ddNTP incorporé (bleu pour le C, rouge pour le T, noir pour le G et vert pour le A). Au terme de la réaction, les différents fragments obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le séquenceur est pourvu d’une source laser qui excite les fluochromes. Lors du passage des bandes au niveau de la source laser disposée en bas du gel, les fluochromes émettent un faisceau lumineux qui sera capté par une cellule photosensible, transformé en signal électrique et acheminé vers un ordinateur qui va traiter l’information. Les résultats se présentent sur l’ordinateur sous forme de courbes présentant des pics de fluorescence correspondants aux nucléotides formant la séquence. 8 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  Biotechnologie M1 BMC TP2 : Séquençage automatique d’ADN Moléculaire Objectif Obtention de séquences d’inserts plasmidiques La réaction de séquence La réaction de séquençage se fait selon la méthode de Sanger et est réalisée grâce au kit BigDye® Terminator v3.1. Il contient non seulement les tampons, les dNTPs, la Taq Polymérase nécessaires à la synthèse des brins d’ADN, mais aussi les 4 ddNTPs essentiels au séquençage, chacun étant couplé à un fluorochrome différent. Ce couplage va permettre la détection des fragments synthétisés en électrophorèse capillaire et ainsi de connaître l’enchaînement des nucléotides composant la séquence d’ADN. Appareils, réactifs et consommables - Micropipettes P10, P20 et P200 - Cônes 10 µL-200µl - H2O milli-Q (eau ultra-pure) - Aliquot de kit BigDye® Terminator V3.1 (Applied Biosystems) conservé au congélateur - 20°C -BigDye Terminator V1.1,V3.1_2,5X Buffer (Applied Biosystems) conservé à 4°C -Amorces 3,3µM -Thermocycleur Mode opératoire La réaction de séquence est réalisée dans un tube de 0.2 ml contenant: Réactifs Volume (µl) Plasmide (300ng à 100ng/µ l) 2 Primer T7 (3,3µ M) 1µ l BigDye Terminator V3.1 0,5µ l BigDye Terminator V3.1 (2,5X Buffer) 3.5µl H2O milli-Q (eau ultra pure) 3 Volume final 10µl T7 : 5’TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG 3' Programme thermocycler 96° 2mn Puis 96° 15sec 50° 7sec 60° 4mn 25 cycles Puis 4° 9 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  Réaction de Séquençage : L’ADN polymérase utilisée dans le kit BDT (BigDye® Terminator v3.1) est la Taq poymérase FS (ABI). Cette enzyme est thermorésistante et permet d’effectuer plusieurs cycles d’élongation successifs. Par conséquent la matrice d’ADN peut être réutilisée plusieurs fois et donc être présente en quantité plus réduite. Cela permet une amplification linéaire du signal. De plus l’utilisation de fortes températures pour la dénaturation de la matrice aide à déstabiliser d’éventuelles structures secondaires. La Taq FS est modifiée génétiquement pour le séquençage (Taq FS pour Fluorescent Sequencing). Elle possède une première mutation au sein de son site actif qui facilite l’incorporation des ddNTP par rapport aux dNTP. La seconde mutation se situe au niveau de son domaine amino-terminal pour éliminer son activité exonucléasique 5’ _3’. La qualité de l’amorce utilisée pour la réaction de séquençage est, elle aussi, déterminante. Elle doit avoir une taille de 17 à 25 nucléotides et une température de fusion (Tm) autour de 50 – 60°C. Il est aussi nécessaire d’éviter certaines structures secondaires pouvant gêner la réaction (répétition de G, épingles à cheveux). Conditions de thermocyclage : On effectue 30 cycles d’amplification sur le thermocycleur dans des conditions spécifiques à la réaction de séquence. Un cycle correspond à : - Une étape de dénaturation de l’ADN à 95°c pendant 10 sec pour obtenir l’ADN sous forme simple brin. - Une étape d’hybridation à 50°c pendant 5sec (température moyenne d’hybridation pour la majorité des amorces utilisées). Elle va permettre la fixation de l’amorce spécifique sur l’ADN matrice monobrin. Cette amorce va permettre l’initiation de l’élongation par la Taq polymérase. - Une étape d’élongation de l’ADN par la Taq polymérase à 60°c pendant 4 min. cette température faible ralentit la Taq et va déplacer l’équilibre pour permettre une meilleure incorporation d’un ddNTP. Il arrive cependant qu’elle se termine ar l’incorporation d’un dNTP. Dans ce cas, l’absence de fluorochromes sur les dNTPs permet de ne pas visualiser ces faux stops. Une fois l’étape de thermocyclage effectuée, il est nécessaire de purifier la réaction de séquence. La qualité des matrices ADN que vous nous donnez est déterminante pour l’obtention de séquences de qualité. Le séquençage par électrophorèse capillaire est très sensible aux contaminations d’échantillons. Ces produits contaminants sont : constituants cellulaires (protéines, ARN), produits PCR non spécifiques, sels, EDTA, composants organiques (phénol, chloroforme, éthanol), détergents, primers de PCR en excès, dNTPs, enzymes et composants des tampons PCR. Leurs éventuelle présence dans votre échantillon diminuera le signal spécifique, augmentera le bruit de fond et réduira la durée de vie de nos capillaires : lors de l’injection éléctrophorétique, tous ces produits contaminant seront préférentiellement injectés et viendront boucher et dégrader le capillaire. Purification de la réaction de séquence : Plusieurs techniques sont possibles comme la précipitation (Acétate de sodium /Alcool), la chromatographie d’exclusion ou encore l’EXOSAP. a) La chromatographie d’exclusion va permettre le piégeage de particules de bas poids moléculaire sur une colonne Séphadex G50 constituée de billes perforées dont les trous ont un diamètre déterminé (ici de 20 à 50µm). les petites particules de diamètre inférieur à ceux –ci entrent et sont piégées. A l’inverse les grosses vont passer autour et être éluées très rapidement. La réaction de séquençage est purifiée par chromatographie pour piéger les ddNTP libres, en excès. En effet ces ddNTP libres non incorporés lors de la réaction pourraient parasiter les signaux de fluorescence spécifiques. Les sels éventuellement présents sont piégés de la même manière que les ddNTP. b) La purification ExoSAP : mélange d’Exonucléase I et d’Alkaline Phosphatase. L’ExoSAP permet de purifier les produits de PCR en éliminant les primers et dNTP en excès. L’enzyme est activée à 37°c (15 minutes) et inactivé à 80°c (15 minutes). Les fragments simples brins inférieurs à 100 pb sont ainsi dégradés.  TP3 : Analyse bioinformatique de séquences Biotechnologie M1 BMC Moléculaire Objectif : Analyses des séquences d’inserts de clones recombinants. Application : Vous disposez de séquences de 4 clones recombinants B8, C3, C10 et F11 obtenus après construction d’une banque enrichie en microsatellites. 1) Visualiser les séquences à l’aide du logiciel chromas et préciser lesquelles contiennent un motif microsatellite en précisant sa position. Clone Motif Position B8 C3 C10 F11 2) A l’aide du logiciel chromas aller à Edit et copier la séquence du clone C3 sous format FASTA. En vous basant sur la figure 2 repérer puis enlever la séquence du plasmide. A partir de l’insert désigner à l’aide du logiciel primer3 disponible sur http://simgene.com/Primer3 , un couple d’amorces permettant d’amplifier le locus identifié dans ce clone (taille entre 150 et 180pb). 12 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  TD1 Le séquençage enzymatique : Méthode de sanger Exercice 1: A G C T Sens de migration L'autoradiogramme du gel de migration ci-dessus représente le résultat du séquençage d’un segment d'ADN monobrin par la technique de Sanger. 1- Donner la séquence nucléotidique lue directement sur ce schéma du film. 2- Donner la séquence réelle du segment d'ADN monobrin correspondant. Exercice 2 : Vous disposez d’un brin d’ADN matrice, d’une amorce, d’une ADN polymérase, des quatre 2’- désoxyribonucléotides (dXTP) et d’un jeu des différents 2’,3’-didésoxyribo-nucléotides (ddXTP). L’amorce est radiomarquée par du phosphore radioactif 32P. L’ADN matrice à séquencer ACGTAATCGC comporte, à son extrémité 3’, une séquence supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé) sur laquelle l’amorce va s’hybrider, créant ainsi le site d’initiation de l’ADN polymérase. Représenter le gel de séquence obtenu en précisant le sens de migration et le sens de lecture de la séquence. Exercice 3 : Le gène BSR1 est un gène impliqué dans une maladie neurologique sévère. Ci-dessous le résultat de séquençage d’une partie de ce gène obtenu chez deux individus I1 et I2. I1 : Sujet sain et I2 : Sujet malade G A T C I1 G A I2 T C Donner la séquence lue sur les deux gels et interpréter les résultats obtenus. 13 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  TD2 Désignation d’amorces pour l’amplification des locus microsatellites Exercice Afin d’étudier la diversité génétique d’une population d’ours noir Ursus americanus par les marqueurs microsatellites, on s’est proposé de construire une banque enrichie. 1- Décriver brièvement les principales étapes de cette méthode (schéma à l’appui). 2- Après construction de la banque enrichie nous avons effectué une mini-prep en utilisant trois solutions S1, S2 et S3. Donner le but de cette étape en précisant le rôle des solutions utilisées. Les inserts des clones recombinants ont été séquencés par la méthode de sanger. Ci- dessous la séquence obtenue à partir du clone As3 après élimination des séquences du vecteur. 1 TTGTAGGGCT AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT 61 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA 121 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT 181 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT 3- Donner le programme de thermocyclage pour réaliser la réaction de séquence. 4- Préciser le motif isolé et désigner un couple d’amorces permettant d’amplifier un allèle de 240pb ainsi que le programme PCR utilisé. 14 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  Le génotypage par les marqueurs microsatellites 15 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhem  TD3 Application des marqueurs microsatellites Exercice Afin d'évaluer d'éventuelles altérations fonctionnelles du système de réparation de mésappariements « MMR » (mismatch repair) dans l'accumulation de mutations génétiques survenant avec l'âge dans les lymphocytes T, nous avons étudié l'instabilité de cinq loci microsatellites (TTTC), (AGAT), (ATTT), (AATG) et (AAAT) dispersés dans le génome. Au total 4 clones ont été testés : les clones 5 et 23 provenant de cellules souches de sujets jeunes (young donor) et les clones 35 et 37 provenant de cellules souches de sujets âgés (old donor). Les loci microsatellites ont été amplifiés à l’aide d’amorces spécifiques à un temps t=0h (cellules non traitées) et à un temps t=48h (cellules traitées aux UV). Les produits d’amplifications ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les résultats sont donnés dans le document 1. 1- Donner le génotype multilocus des 4 clones testés. 2- Interpréter les résultats obtenus. Document 1 18 Document élaboré par Mme Souheila Guerbouj-Khedher et Mme Maha Mezghani-Khemakhe  Par ailleurs, nous avons séquencé une portion du gène hMSH2 qui joue un rôle critique dans la réparation de mésappariements de l’ADN chez les souches traitées (T) et les souches non traitées (N). Les résultats du séquençage sont représentés ci-dessous (document 2). Sachant que le séquençage a été effectué à l’aide de la technique Sanger, 3- Donner le programme de thermocyclage de la réaction de séquence, en justifiant chaque étape. 4- Détailler les méthodes utilisées pour purifier la réaction de séquence. 5- Donner la séquence de la portion analysée de ce gène, chez les souches traitées (T) et non traitées (N). 6- Interpréter les résultats obtenus. Document 2  TD4 Le syndrome de Li-Fraumeni, est défini par la susceptibilité héréditaire de développer certains cancers. Des analyses de liaison, effectuées dans plusieurs familles chez lesquelles ce syndrome est présent, ont montré une très forte liaison avec différents marqueurs microsatellites situés à proximité d'un gène codant une protéine appelée TOTO. Une banque enrichie a été construite à partir de laquelle plusieurs clones recombinants ont été isolés et leurs ADN plasmidique extraits. 1. Donner le principe et les étapes de la méthode utilisée pour l’extraction de l’ADN plasmidique. Les inserts des clones recombinants ont été séquencés par la méthode Sanger. La séquence représentée dans le document 1 correspond à l’un de ces clones. 2. Décrire brièvement le principe de la technique de séquençage selon Sanger. 1 CGGGAATTCG ATTTGTGTGC TTGTTGCAGG ATCTGTAACT ATTCCTATGC GATTCTCTTG 61 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT 121 TGGCTCCAAG TTCTGGAAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA 181 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 241 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 301 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT 361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCCGAGCTCA TAGACTCTGT 421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG 481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG Document 1 : Séquence du clone IS12 Sachant que tous les inserts ont été clonés dans le plasmide pGEM®-T Easy Vector, dont une partie de son site de clonage multiple est représentée dans le document 2, Document 2 : Site de clonage multiple du vecteur pGEM®-T Easy Vector. 3. Donner avec précision les 30 premiers nucléotides de la séquence de l’insert, du côté 5’. 4. Dessiner le gel correspondant à cette première partie de la séquence, en respectant l’ordre de dépôt des bases : A, T, G et C, de gauche à droite. Indiquer le sens de la migration ainsi que celui de la lecture. 5. Désigner une paire d’amorces de 20 nucléotides qui permet d’encadrer les motifs microsatellites et de donner un produit d’amplification de taille 300pb. Déterminer les Tm correspondants. La paire d’amorces désignée a été utilisée dans des réactions d’amplification PCR ciblant ce marqueur microsatellite chez les membres d’une famille présentant le syndrome. Le gel ci-dessous (document 3) présente les résultats obtenus. Piste 1: tissu sain d'un homme non atteint par le syndrome. Piste 2: tissu sain d'une femme atteinte par le syndrome. Piste 3: tissu tumoral d'une femme atteinte par le syndrome, Piste 4: tissu sain de leur enfant également atteint par le syndrome Piste 5: tissu tumoral de leur enfant également atteint par le syndrome. Document 3 : Gel d’électrophorèse montrant les résultats de PCR ciblant le marquer (CA) chez la famille 12. 6. Interpréter ces résultats. 7. Quel allèle du microsatellite est-il associé au développement de tumeurs ? 8. Quelle est la conséquence des « pertes d’hétérozygotie » observées dans les pistes 3 et 5 ? Par ailleurs, l’étude par analyse de liaison, effectuée chez plusieurs familles, a permis de localiser le locus responsable de ce syndrome dans la région 2q21.3. Afin de localiser ce locus plus précisément, les allèles d'un ensemble de marqueurs microsatellites ont été déterminés chez plusieurs personnes atteintes de ce syndrome (document 4). Document 4 : Allèles de marqueurs microsatellites dans la région 2q21.3. Chacun des deux allèles (indiqués par des nombres à 3 chiffres) de chaque marqueur (Marker, D2S1241, D2S114...D2S2385) est donné pour chaque individu (notés K2, K3...K4). nd : non déterminé. 9. Quelle est la caractéristique de la région entourée par les deux traits noirs? Cette caractéristique est- elle en accord avec vos interprétations précédentes ? 10. Interpréter ces résultats.