Introducere în Tehnologia Culturilor in Vitro PDF

INTRODUCERE IN TEHNOLOGIA CULTURILOR IN VITRO Biotehnologie (gr. bios = viaţă, techne = artă) Biotehnologia: ramură a biologiei care se ocupă de elaborarea unor procedee tehnice pentru obţinerea diverselor bunuri necesare omului, folosindu-se de particularitaţile metabolice ale divers...

INTRODUCERE IN TEHNOLOGIA CULTURILOR IN VITRO Biotehnologie (gr. bios = viaţă, techne = artă) Biotehnologia: ramură a biologiei care se ocupă de elaborarea unor procedee tehnice pentru obţinerea diverselor bunuri necesare omului, folosindu-se de particularitaţile metabolice ale diverselor sisteme vii, în particular ale celulelor de diverse provenienţe (Soran, 1993). Fig. 1: Biotehnologii vegetale Cultura de ţesuturi vegetale (cultura in vitro) este ştiinţa cultivării celulelor, ţesuturilor sau a organelor prelevate din plata mamă, pe un mediu sintetic (artificial) în condiţii aseptice. Fig. 2: Plantule obţinute in vitro Metaboliţi secundari farmacologic activi obţinuţi prin biotehnologii vegetale:  Taxolul – un complex de alcaloizi diterpenici din scoarţa speciilor de Taxus;  Latexul din mac (Papaver somniferum) – sursă comercială de analgezice: morfina şi codeina;  Berberina – alcaloid izochinolinic prezent în rădăcinile de Coptis japonica şi în scoarţa de Berberis vulgaris, Phellodendron amurense;  Diosgenina – substanţă cunoscută ca precursor în sinsteza chimică a steroidelor;  Capsaicina – alcaloid obţinut din fructele ardeiului iute (Capsicum ssp.), folosit în principal ca şi condiment;  Vincristina şi vinblastina – alcaloizi indolici, substanţe valoroase în chemoterapie datorită activităţii antitumorale împotriva leucemiilor şi tumorilor solide. 1  Metaboliţii secundari sunt molecule care nu sunt necesare pentru creşterea şi reproducerea plantei. Sunt adesea implicaţi în interacţiuni între plantă şi mediul biotic sau abiotic. Avantajele cultivării in vitro a celulelor ce sintetizează metaboliţi secundari farmacologic activi: - Obţinerea de niveluri calitative şi cantitative constante ale acestora - Evitarea influenţei condiţiilor climatice nefavorabile - Evitarea atacului patogenilor - Costuri scăzute - Se evită distrugerea plantelor producătoare (rizomi, rădăcini, scoarţă). Cultivarea in vitro se realizează în anumite condiţii:  Condiţii aseptice: - Lipsă de contaminare (bacterii, fungi, virusuri) - Mediu sterilizat  Condiţii fizice controlate de temperatură, lumină, umiditate.  Mediu de cultură nutritiv artificial (solid sau lichid) Tehnicile de cultivare in vitro se referă la prelevarea (excizarea) de celule, ţesuturi sau organe (explante) din cormofitele intacte şi creşterea lor în condiţii aseptice, pe medii de cultură sintetice care conţin un amestec complex de nutrienţi. Astfel de medii vor permite, în funcţie de alcătuirea lor, ca celulele, ţesuturile sau organele cultivate să se dezvolte şi să dea naştere la noi plante identice cu planta de la care au fost prelevate ţesuturile sau la alte tipuri de culturi. Obţinerea plantelor în aceste condiţii se bazează pe totipotenţa celulară care reprezintă proprietatea celulelor de a-şi menţine întregul genom, chiar dacă în celulele diferenţiate sau specializate funcţionează numai anumite gene, restul fiind represate de către histone. Astfel, celulele vegetale individuale, nucleate, au capacitatea genetică de a regenera un organism vegetal întreg, structural şi funcţional, în mod direct sau prin intermediul calusului. Fig. 3: Surse de explante În dotarea laboratorului de culturi in vitro trebuie să existe: - Instrumentar, ce cuprinde sticlărie specifică pentru orice laborator de chimie sau biochimie (pipete, cutii petri, flacoane Erlenmeyer, etc), micropipete, pense, bisturie, foarfeci, balanţă, agitator ş.a.; - Masă cu flux laminar - pH-metre - Aparate de sterilizat instrumentarul şi mediile nutritive: etuvă, autoclav. 2  Asepsizarea  vasele de cultură cu mediul nutritiv se sterilizează prin autoclavare (căldură umedă), temperatură de 121oC, timp de 20-25 min.;  instrumentarul se sterilizează la etuvă (160oC) timp de 1 h şi prin încălzire la roşu.  materialul vegetal se imersează în soluţii dezinfectante (ex: hipoclorit de sodiu, apa oxigenată, clorura de mercur). Alcătuirea mediului nutritiv  Nutrienţi anorganici: - apa bidistilată - săruri minerale: o macroelemente: N, K, Ca, P, S şi Mg o microelemente: Fe, Mn, Zn, I, B, Mo, Cu, Na, Co.  Nutrienţi organici: - Sursă de carbon: compuşi glucidici (zaharoza este cea mai utilizată), alcooli, acizi organici. - Vitamine: tiamina (B1), piridoxina (B6), acidul nicotinic şi inozitolul. - Hormoni vegetali: auxine, citochinine, giberelina, etilena, acidul abscizic. Sunt substanţe moleculare mici sintetizate în alte locuri decât organele ţintă cu rol important în procesele de creştere şi diferenţiere celulară (Tab. I) Se mai adaugă: extracte vegetale iar în funcţie de de consistenţa mediului, agenţi de solidificare (agar, gerlit). Principalele tipuri de mediu utilizate în culturile de celule in vitro sunt MS (Murashighe-Skoog) şi B5 (Gamborg). Tab. I: Hormonii de creştere şi rolul lor în cultura in vitro Tipul de hormon Numele produsului Rolul în cultura in vitro Auxine Acid indolil acetic (AIA) Formează rădăcini adventive (conc. crescute) Acid indolil butiric (AIB) Formează lăstari adventivi (conc. scăzute) Acid α-naftalen acetic (ANA) Induce embriogeneza somatică Acid 2,4 diclorofenoxiacetic Formează calus şi creşterea Picloram Stimulează diviziunea celulară Inhibă formarea mugurilor axilari Inhibă elongarea rădăcinilor Citochinine 6-benzilaminopurina Stimulează elongarea lăstarilor Zeatina Inhibă formarea rădăcinilor 6,6-γ,γ-dimetilalilaminopurina (2iP) Promovează diviziunea celulară Kinetina Modulează iniţierea calusului şi creşterea Tidiazuron (TDZ) Stimulează apariţia mugurilor axilari şi creşterea Inhibă elongarea lăstarilor Inhibă senescenţa frunzelor 3  Gibereline Acid giberelic Stimulează elongarea lăstarilor Scoate seminţele, embrionii şi mugurii apicali din dormanţă Inhibă formarea rădăcinilor adventive Acid abscizic Acid abscizic Stimulează formarea bulbilor şi tuberculilor Stimulează maturarea embrionilor Scoate ţesuturile din dormanţă Poliamine Putresceina Promovează formarea rădăcinilor adventive Promovează embriogeneza somatică Promovează formarea lăstarilor TIPURI DE CRESTERE IN CULTURILE IN VITRO Tehnicile şi metodele de cultivare in vitro permit obţinerea a două tipuri de creştere:  Creşterea materialului vegetal în formă neorganizată (culturi de calus, suspensii celulare, cultura de protoplaşti, cultura de antere).  Creşterea materialului vegetal în formă organizată (culturi de ţesuturi, organe). Creşterea neorganizată nu este foarte răspândită în natură dar poate fi realizată cu uşurinţă în condiţii in vitro. Ţesutul rezultat acestui tip de creştere conţine numai un număr limitat de celule diferenţiate sau specializate. Astfel, ele pot fi menţinute, prin transfer repetat pe un mediu nutritiv, o perioadă de timp îndelungată.  Cultura de calus – obţinerea unei mase mari de celule neorganizate, nediferenţiate, care rezultă din creşterea coordonată sau dezorganizată la nivelul unor explante. Este nevoie de un mediu agarizat care să susţină masa celulară în creştere. Periodic trebuie sa fie fragmentat şi subcultivat pe medii proaspete, altfel intră în senescenţă şi se necrozează. Fig. 4: Cultură de calus După o perioadă de cultură, în masa calusului apare o citodiferenţiere spontană. În funcţie de balanţa hormonală şi de condiţiile de mediu, morfologia calusului se poate schimba rezultând organe şi plantule. 4  Fig. 5: Obţinere de plantule prin intermediul calusului (schemă) Fig. 6: Inducerea de calus şi organogeneza indirectă  Cultura de suspensii celulare – obţinerea de populaţii de celule sau agregate mici, dispersate într-un mediu lichid. Se impune agitarea continuă pe agitator rotativ orizontal. Fig. 7a: Suspensie celulară Fig. 7b: Agregate celulare (MO) Fig. 7c: Curba de creştere pentru suspensii celulare 5  Fig. 8: Procedeul de obţinere a digoxinei din suspensiile celulare de Digitalis lanata  Cultura de protoplaşti – cultura celulelor vegetale izolate ca urmare a îndepărtării peretelui scheletic prin mijloace mecanice sau enzimatice. Tehnica prezintă importanţă deoarece:  Ajută la îmbunătăţirea culturilor prin hibridizare somatică şi transformare celulară. În urma fuziunii protoplaştilor se pot obţine noi plante hibride şi se pot realiza tehnici de inginerie genetică pentru a obţine plante cu proprietăţi dorite;  Prin cultivare pot conduce la regenerarea în întregime a plantelor. Fig.9: Protoplaşti Fig. 10: Hibridarea somatică a protoplaştilor 6   Cultura de microspori (grăunciori imaturi de polen) – cultivarea anterelor întregi care conţin microspori imaturi de polen, având ca scop obţinerea de plate haploide (n cromozomi) prin formarea embrionilor somatici direct din polen. Fig. 10: Căile de dezvoltare a microsporilor in vivo şi in vitro Creşterea organizată constă în crearea sau obţinerea unei culturi vegetale definite. Creşterea organizată care duce la formarea unor organe de novo, se numeşte organogeneză (formarea organului vegetal) sau morfogeneză (dezvoltarea formei). Tipuri de culturi de organe:  Cultura de meristeme – domul meristematic este izolat din planta mamă şi crescut pe mediu. Acest tip de cultură duce la formarea unei singure plante.  Cultura de noduri – se excizează un mic fragment de tulpină cu 1-2 muguri laterali ce duce la formarea a 1-2 lăstari.  Cultura de lăstari – iniţiată din mugurii laterali sau vârfurile ramificaţiilor laterale ce duce la formarea lăstarilor multipli.  Cultura de rădăcini izolate – presupune cultivarea rădăcinilor pe medii nutritive separat de planta mamă şi conduce la formarea unui sistem radicular ramificat. Fig. 11: Cultură de rădăcini izolate  Cultura de embrioni zigotici presupune disecţia aseptică a seminţelor fertilizate sau nefertilizate şi creşterea lor pe medii nutritive până la stadiul de plantulă. 7   Regenerare prin embriogeneză somatică. Embrionii somatici sunt formaţi din celule sporofitice cu excepţia zigotului. Aceştia pot fi obţinuţi pe cale directă, dintr-un ţesut organizat cât şi indirect prin intermediul calusului. Direct, embriogeneza somatică se obtine uşor pornind de la protoplaşti sau microspori, ovule, lăstari tineri. Fig. 12 : Regenerare prin embriogeneză somatică din culturi de Eleutherococcus sessiliflorus A : embrioni somatici direct din hipocotil (1 lună) B : embrioni somatici direct din cotiledon (1 lună) C : calus embriogenic friabil (mediu cu 2,4-D) D: embrioni globulari (mediu fără 2,4-D) E : embrioni formati din suspensii celulare F : embrioni inoculaţi pe mediu solid G : germinarea embrionilor somatici pe mediu cu GA3 H: plantule după transfer APLICAREA SISTEMULUI DE CULTURA IN BIOREACTOR I: plante aclimatizate Sistemul de cultură în bioreactor este o alternativă pentru obţinerea principiilor farmacologic active, compuşi care în mod normal sunt extraşi din plantele intacte. Cultivarea in vitro pe scară largă a celulelor reprezintă un sistem de creştere a celulelor vegetale în recipiente cu o configuraţie, mod de funcţionare şi volum diferite de cel al vaselor Erlenmeyer. Avantaje: - Posibilitatea monitorizării şi controlării condiţiilor de cultură. - Aplicabilitate la nivel industrial. În prezent, sunt cultivate în bioreactoare câteva specii: Lithospermum erythrorhizon (şiconine), Nicotiana tabacum (nicotina), Coptis japonica (alcaloizi berberinici), Morinda citrifolia (antrachinone), Coleus blumei (acid rozmarinic), Aralia cordata (antociani). Fig. 13: Cultivarea embrionilor somatici în sistem bioreactor 8