Culture cellulaire et applications biotechnologiques L3: Biotechnologies et Santé 2020/2021 PDF

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Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene Faculté des Sciences Biologiques Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Culture cellulaire et applications biotechnologiques L3 : Biotechnologies et Santé Dr RAFA 2020/2021  Plan du cours I. Introduction et définitions. II. Méthodes d’obtention des cellules. III.Méthodes de culture. IV. Méthodes d’entretien des cellules en culture. V. Besoins nutritifs des cellules en culture. VI. Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires. VII.La conservation des cellules en culture. VIII.Application biotechnologique.  I. Introduction et définitions En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules en dehors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique. La culture des cellules animales en dehors de l’organisme permet l’observation des cellules vivantes dans des conditions favorables. De plus, une culture cellulaire représente un système expérimental beaucoup plus simple qu’un animal entier et elle fournit un système qui peut être étudié dans des conditions soigneusement contrôlées.  I. Introduction et définitions La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs utilisés aujourd'hui dans les sciences de la vie. La culture de cellules animales appartient à un ensemble technologique intitulé ‘’La culture de tissu’’ qui est constituée de 3 parties essentielles : La culture La culture d’organes De tissus Correspond au maintien en dehors de Correspond au maintien en dehors de l’organisme d’organes ayant conservé l’organisme de tissus d’une manière leur structure et leur fonction. qui permettrait la conservation des fonctions spécifiques de chaque tissu. La culture cellulaire Correspond au maintien en dehors de l’organisme de cellules non organisées en tissu, cependant capables de se diviser et d’exprimer in vitro métabolismes et fonctions spécifiques  I. Introduction et définitions Cette technique récente est liée au développement des biotechnologies. Elle a pour but d'étudier des phénomènes physiologiques, des mécanisme biochimiques sans avoir recours à l'expérimentation in vivo. Exemples d'application: ❖ Biologie cellulaire : - Étude de la différenciation, du vieillissement cellulaires, l’inflammation et les mécanismes des cancers. ❖ Santé : -Diagnostic de maladies (pathologie virales) -Tester des molécules thérapeutiques pharmacologiquement active sur des cellules) ❖ Biotechnologie : - Production des biomolécules à usage thérapeutique (exp : insuline, interférons, cytokines, anticorps monoclonaux, vaccins…)  Tester une molécules thérapeutique et validation 1. Etape 1: Etude in vitro/ ex vivo / in vivo Like (Culture cell) 2. Etape 2: Etude in vivo (Aminal models) 3. Etape3: Essaie cliniques (Plusieurs phases) 4. Etape 4: Validation par la FDA (Food and Drug Adminstration) et production , commercialisation. Production des Biomoélcules exp: Ac monoclonaux 1. Etape 1: Upstream (Culture cell) 2. Etape 2: Downstream 3. Formulation  I. Introduction et définitions Primoculture (culture primaire) : Culture dérivant des cellules, pouvant être d'origine différentes, prélevées directement à partir d’un organisme vivant, sans modification génétique. Les cellules ne sont pas immortelles et la culture va se dégénérer après un certain nombre de génération. Repiquage ou passage : Transfert de cellules d’un flacon de culture à un ou plusieurs autres. Les cellules mises en culture après le premier repiquage forment une culture secondaire. Nombre de repiquages ou passages : nombre de fois où la culture a été repiquée.  I. Introduction et définitions Lignée cellulaire : est un groupe de cellules stables qui proviennent de la même cellule et qui ont une capacité illimité de se diviser. La cellule utilisée est soit une cellule cancéreuse (exemple: HeLa) ou la cellule est rendue cancéreuse par une mutation génétique (cellules transformées). La lignée dérive d’une primoculture au moment du premier repiquage. Caractéristiques : - Cellules qui se divisent indéfiniment - Peuvent avoir un nombre de chromosomes anormal (souvent hétéroploïdie) - Morphologie souvent différente des cellules normales - Pouvoir multiplicatif important  I. Introduction et définitions Obtention de lignées pérennisées : plusieurs possibilités: Evènement spontané à partir de cultures cellulaires primaires (évènement rare) A partir d’un prélèvement de tumeur (les cellules tumorales sont déjà pérennisées) Par fusion cellulaire (ex : hybridomes) Induction par des virus transformant (virus SV40 ; virus EBV pour lymphocytes B), agents chimiques ou physiques Les lignées sont des cellules différentes des cellules de départ mais encore utilisables pour de nombreuse manipulations : gardent leurs spécificités cellulaires. Rq: Il existe actuellement des banques de cellules. Ex: ATCC (American type culture collection).  I. Introduction et définitions Souche cellulaire : dérivée d’une primoculture ou d’une lignée cellulaire par sélection ou clonage des cellules possédant des propriétés ou des marqueurs spécifiques. Clone cellulaire : population de cellules dérivant d’une seule cellule par division Hybridome : cellule résultant de la fusion in vitro d’une lignée maligne de plasmocytes, capable de se multiplier indéfiniment et de lymphocytes B provenant de la rate d’un animal préalablement immunisé par un antigène.  II. Méthodes d’obtention Deux types de cellules sont à distinguer : Les cellules en Les cellules libres cohésion/ (circulantes) adhérentes (organisées en tissu) Ex: PBMC, Monocytes, Lymphocytes,,, Ex: cellules dendritique, Macropahes, hépatocytaires,épithéliales,,, Cette différence implique l’utilisation de méthodes d’obtention différentes.  II. Méthodes d’obtention et purification Pour les cellules circulantes, elles sont obtenues par les techniques habituelles de prélèvement suivie de centrifugation / gradient de densité (Ficoll d=1,077). Pour les cellules organisées en tissu, leur isolement fera appel soit aux méthodes de dissection, soit aux méthodes enzymatiques  II. Méthodes d’obtention et purification Exemple 1: Les PBMC (cellules mononuclées du sang périphérique) Dilution du culot Récupérer le plasma Tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) pH 7,4  Dilution du culot Récupérer le plasma Tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) pH 7,4  Verser délicatement le sang dilué sur le ficoll Ficoll d=1,077  Verser délicatement le sang dilué sur le ficoll Ficoll d=1,077 II. Méthodes d’obtention et purification  Test de viabilité Bleu de Trypan: colorant Test MTT (A détailler en TD) vital Méthodes de culture en suspension : Mettre les Méthodes de culture PBMC en culture / suspension (RPMI1640, cellulaire : 37°C, 5%CO2, 100% humidité Microplaques: Support non traité par des molecules d’adhésion  II. Méthodes d’obtention et purification Exp 2: Monocytes à partir des PBMC Adhérence non spécifique Après l’incubation: plusieurs Incubation 1hr 30 à 37°C lavages lavages au PBS Cellules non adhérentes PBMC (lymphocytes) Support traité par des moléculs d’adhésion Les monocytes adhèrent au support  Trypsination (Enzyme: Trypsine) Monocytes en suspension Monocytes adhérentes aux support Test de viabilité Mettre les monocytes en culture / suspension: RPMI-1640, 37°C, 5%CO2, 100% humidité Monocytes Les molecules d’adhésion Support Trypsine 1, Etude de l’effet d’une molecule thérapeutique x sur les monocytes : en absence des lymphocytes Lym Effet indirect X Moncoytes Effet direct TNF-α Mode d’action  2, Différenciataion des monocytes en macrophages et cellules dendritiques Auto-immune and Cancer inflammatory disease Immunogenic or Tolerogenic DC proinflammatory DC  7j Cytokines IL-4 GM-CSF Cellules monocytes dendritiques GM-CSF, IL-4, IL-1b, IL-6, GM-CSF , IL-4 TNF-alpha Mature iDC Monocytes Immature DC 6 days CD83 low 2 days CD83high CD80low CD80high CD86inter CD86high  II. Méthodes d’obtention Le tri par billes magnétiques (MACS - Magnetic-Activated Cell Sorting) est une méthode couramment utilisée pour isoler et purifier les cellules à partir d’une population cellulaire mixtes de cellules, comme les PBMC. Cette technique est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques couplées à des billes magnétiques pour marquer et séparer les cellules d'intérêt. Le processus est relativement simple et permet d'obtenir des populations cellulaires hautement pures avec une manipulation minimale des cellules. Cette méthode est largement utilisée en recherche et en clinique pour diverses applications, notamment les études immunologiques et le développement de thérapies cellulaires. Exp 3: Lymphocytes B CD19 à partir des PBMC PBMC Lym B CD19+ Exp 4: Lymphocytes T CD4+ à partir des PBMC PBMC Lym T CD4+ Vérifier la pureté des cellules isolées par cytométrie en flux : ustilisation des Ac fluorescent LYM TCD4+ (antiCD19, antiCD14, antiCD8),,,,,,,lym TCD4+ CD3+CD4+ CD3+CD4- 98% CD3-CD4- CD3-CD4+ Test de viabilité et mise en culture en suspension  II. Méthodes d’obtention Deux types de méthodes d’obtention existent : Les méthodes de dissection Les méthodes enzymatiques  II. Méthodes d’obtention - La méthode de dissection proprement dite (méthode des explants) Le tissu est coupé en fragments de 1 à 2 mm3. Ces derniers sont encore réduits à l’aide de pinces puis placés dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif : les cellules vont migrer à partir des différents fragments. Il est nécessaire de mettre les explants dans un récipient de culture ne contenant qu’un très faible volume de milieu pour affleurer les fragments. Cela évite la flottaison des explants. Ce phénomène conduirait à l’incapacité de migration cellulaire à partir des explants isolés. Après quelques heures, quand l’explant a suffisamment adhéré au support, la quantité convenable de milieu est ajoutée. - La méthode mécanique II. Méthodes d’obtention C’est une méthode utilisée pour les organes mous comme le foie, le thymus et la rate. Elle consiste à dissocier mécaniquement et délicatement les cellules, par une série d’aspiration refoulement par passage à travers l’aiguille d’une seringue. L’organe peut aussi être frotté sur une grille, permettant la libération des cellules qui subissent par la suite une filtration et une centrifugation. ❖ Les méthodes enzymatiques: II. Méthodes d’obtention Les enzymes utilisées sont protéolytiques : Elles digèrent la trame protéique entourant les cellules. La trypsine est la plus couramment utilisée. Il faut noter que la trypsine brute ou cristallisée est utilisée à une concentration de 0,5 à 2,5 g /l dans une solution saline types Hanks ou PBS sans Ca+2 et Mg+2. Pour certains tissus riches en collagène, on utilise la collagénase à différentes concentrations (0,1-2g /ml). Les techniques utilisant la trypsine sont nombreuses mais celle de Fernanades est la plus couramment utilisée (1958) : EDTA: chélateur de Mg+2 Ca+2  II. Méthodes d’obtention Dissection du tissu Trypsination dans une solution effectuée sous saline + antibiotique agitation lente pendant 3 à 5 min resuspendre le culot Inactivation de la cellulaire dans du trypsine par des milieu de culture Centrifugation lavages avec du suivi d’une filtration milieu de culture + pour éliminer les SVF ou un amas avant la mise inhibiteur trypsique en culture de Soja. (stationnaire)  II. Méthodes d’obtention Avantages et inconvénients:  III. Méthodes de culture boîte stériles en polystyrène : elles ne présentent pas de toxicité pour les cellules et permettent d'observer parfaitement les cellules en microscopie optique  III. Méthodes de culture Les flacons peuvent être munis de bouchons fermés (système clos) ou ventilés (système semi-clos). Ces derniers sont les mieux adaptés à la culture cellulaire. III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture  III. Méthodes de culture La culture cellulaire nécessite des conditions de stérilité absolues, toute contamination microbienne entraîne la lyse des cellules. De plus lorsque l'on fait de la production, le produit obtenu doit être stérile. C'est pourquoi on manipule dans des sales réservées à cet effet, isolées par des sas et dans laquelle les mouvements sont réduits. On utilise de hottes à flux laminaires équipées de système de filtration d'air permettant d'obtenir une zone de manipulation stérile. III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture III. Méthodes de culture  III. Méthodes de culture Le but est de maintenir les cellules en suspension. Il faut donc éviter l’adhésion au support et l’agrégation cellulaire. Le support utilisé pour la culture en suspension est un support non traité et stérile. Exp : PBMC, Lymphocytes. Microplaques de 96 puits  III. Méthodes de culture Le principe de ces cultures est basé sur l’affinité des cellules mises en culture pour le support utilisé. Au début, le verre était très utilisé mais à l’heure actuelle, les matières plastiques traitées ont remplacé le verre. La matière plastique est traitée au Collagène, fibronectine, protéoglycanes, poly-D Lysine. L’adhésion au support comporte 4 étapes : 1. L’adsorption (liaisons ioniques réversibles) 2. Le contact 3. L’attachement 4. L’étalement (pendant la phase de division des cellules)  III. Méthodes de culture Lorsque les cellules organisées en tissus sont prélevées d’un organisme et placées dans un environnement de culture approprié, elles adhèrent au support, se divisent et prolifèrent formant une nappe confluente (tapis cellulaire confluent).  IV. Méthodes d’entretien des cellules en culture. ❑ Les méthodes d’entretien des cellules en culture : 1. Changement du milieu de culture appauvri par du milieu neuf (l’épuisement de milieu en éléments nutritifs est traduit par le changement du pH, la variation de pH est suivi par un indicateur de pH ‘rouge de phénol’ introduit dans le milieu). pH acide: Jaune, pH basique: violet, neutre (physiologique): rose fréquence de changement de milieu chaque 2à 3j 2. Repiquage des cellules adhérentes, après formation de la nappe confluente dans de nouveaux contenants. Cette opération nécessite le détachement des cellules de leur support et leur séparation les unes des autres soit par: - Grattage mécanique. - Action enzymatique (Trypsine et collagénase).  III. Méthodes de culture Méthodes de cultures en système Transwell Les inserts Transwell sont des récipients avec des supports perméables à base de membrane qui permettent aux cellules adhérentes de développer une polarité et d'acquérir la capacité d'exprimer des fonctions spéciales telles que le transport.  Chimiotactisme: Interaction cellullaire Tests de chimiotactisme Dans nos tests de chimiotactisme, nous utilisons un Transwell contenant une membrane avec une taille de pores définie. Les cellules sont ensemencées au- dessus de la membrane et peuvent migrer vers un chimioattractant dans la chambre inférieure. Endothelial cell transmigration and invasion assays: exp; migration des cellules cancéreuses Endothelial cell transmigration and invasion assays: exp; migration des cellules cancéreuses Cellules endothéliales: test de perméabilité cellulaire Ce test permettra de déterminer si les molécules sélectionnées dans la chimiothèque présentent une toxicité éventuelle pour les cellules endothéliales. Ce test consiste à mesurer la perméabilité de monocouches de cellules HUVEC en suivant la diffusion d'un traceur du compartiment supérieur vers le compartiment inférieur des unités Transwell. HUVEC: cellules endothéliales  III. Méthodes de culture Méthodes de co-cultures Cette méthode est utilisée pour étudier quelques interactions entre deux types de cellules distincts à des fins thérapeutiques par exemple. Exp: cellules dendritique tolérogènes et TCD8+ In vitro: Ligneés cellulaires Ex vivo: cellules primaires, In situ: culture des explants In vivo-like: 3D  Culture cellulaire 3D Les cellules normales du corps humain vivent dans un environnement à trois dimensions, entièrement entourées d’autres cellules, de membranes, de couches fibreuses et de protéines d’adhésion. Les matrices extracellulaires, les échafaudages et les protéines, présentent une morphologie comparable à la fonction in vivo et des environnements physiologiques pour obtenir une biologie cellulaire plus réaliste et améliorer les interactions intracellulaires. Il existe plusieurs systèmes 3D: 1- Formation sphéroïde: Système permettant la culture en 3 dimensions grâce à l'aimantation des cellules par des micro-billes magnétiques. Les cellules peuvent être regroupées par la force magnétique pour former des modèles 3D structurellement représentatifs de l’in vivo. -Reproduction d’environnement tissulaire natif -Formation de modèle 3D en quelques heures après incubation avec les billes aimantées -Aucun équipement spécialisé, ni milieu ou substrat artificiel -Facile à manipuler Billes magnétiques; -Billes de 50 nm de diamètre se liant aux membranes cellulaires de manière non spécifique, interactions électrostatique - Biocompatibles, sans effet sur le métabolisme, sur la prolifération et sur le stress inflammatoire Aimant Aimant 2- Extracellular Matrix (ECM) Scaffolds: (Echafaudage/ Matrice extracellulaire): -Composés de plusieurs proteines telles que: Collagène, fibronectine,,,,, - Avec incorporation des facteurs de croissance,,,, 3- Hydrogel: -l’hydrogel le plus utilisé: le polyéthylène glycol (PEG). Les hydrogels PEG sont biologiquement inerte, Systèmes microfluidiques / Microfluidic device : Organ-on-chip (sur une puce) La combinaison entre la culture 3D et la technologie microfluidique Exp: evaluer l’efficacité de la thérapie cellulaire adoptive T cells / cancer  V. Besoins nutritifs des cellules en culture A. Le milieu de culture : Un milieu de culture doit couvrir tous les besoins des cellules en culture en reproduisant aussi fidèlement que possible in vitro, les conditions d’environnement trouvées in vivo. Le milieu de culture doit donc : - Etre vecteur d’éléments nutritifs - Maintenir les constantes physicochimiques (pH, osmolarité). Les premiers milieux utilisés étaient des liquides biologiques : la lymphe, le plasma, les liquides d’ascite… Actuellement, tous les milieux sont synthétiques de composition plus ou moins complexe.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture On distingue deux principaux types de milieux synthétiques : Le milieu empirique ‘classique’: il est composé de sels minéraux, métaux, glucose, acides aminés, vitamines, d’un indicateur de pH, des tampons, Le milieu définis : il contient les mêmes constituants que le milieu empirique mais tout est quantifié de manière précise. Ces milieux sont généralement formulés spécifiquement pour supporter la culture d’un seul type cellulaire. Il est cher car tous les constituants sont hautement purifiés.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture Un milieu de culture = Milieu de base + Additifs Dit milieu minium, assure uniquement la survie des cellules in vitro Sérum (facteurs de croissance), antibiotiques.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture i. Milieu de base : ❑ Maintien des constantes biologiques: un apport des minéraux, métaux, substances énergétiques (sucres, acides cétoniques, acides aminés) et des vitamines. - Les sels minéraux: 7 ions sont indispensables (Na+, k+, Ca++, Mg++, PO4--, Cl-, Carbonate CO3-). Ces minéraux constituent la base de toutes les solutions salines comme celles de Hanks, tampon Eagle. - Ces minéraux jouent un rôle dans le maintien de la pression osmotique, transport membranaire (canaux et pompes) et les métabolismes (Ca++ active certaines enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire). Na+, k+, Ca++, Mg++ jouent un rôle fondamental dans le maintien des potentiels membranaires. Ca++, Mg++ sont des cofacteurs de nombreuses réactions enzymatiques et ils interviennent dans l’attachement et l’étalement des cellules à leur support de culture.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture - les métaux : certains milieux contiennent des métaux à l’état de traces qui semblent indispensables à certaines réactions enzymatiques (Fer, Sélénium, Cadmium, Lithium). Fer : chaine respiratoire. Sélénium : indispensable au fonctionnement de la glutathion- peroxydase qui permet la dégradation des peroxydes toxiques métabolisés par la cellule. - Les molécules énergétiques : principale source d’énergie in vitro. Elles alimentent la néoglucogénèse. Sucre : Glucose à 1g /l concentration semblable au sérum humain. Il peut être remplacé par le galactose, mannose, fructose. Acides cétoniques : acide α cétoglutarique, acide pyruvique. Acides aminés : 12 acides aminés sont indispensables (8 essentiels; les cellules in vitro sont incapables de les synthétiser + lysine, Tyrosine, Histidine, Arginine et la L glutamine).  V. Besoins nutritifs des cellules en culture - Les vitamines : les besoins en vitamines sont variables selon les types cellulaires. Certains chercheurs considèrent que huit vitamines sont nécessaires aux cellules en culture in vitro : Choline, acide folique, pyridoxal, riboflavine, thiamine, inositol, acide nicotinique, acide panthothénique.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture i. Milieu de base : ❑ Maintien des constantes physiso-chimiques : - Le pH: Il doit être identique au pH sanguin [7,2 et 7,4] mais l’optimum dépend des lignées cellulaires. Les variations de pH sont contrôlées par un indicateur de pH inclus dans le milieu « le rouge de phénol ». Ce dernier change de couleur avec le pH du milieu. pH acide pH neutre pH alcalin Jaune Rouge orangée Violet La prolifération des cellules en culture va conduire à l’acidification du milieu de culture du fait de la dégradation des sucres. Le milieu devient donc jaune et doit être changé par du milieu neuf (repiquages).  V. Besoins nutritifs des cellules en culture - Le pH: Il est clair que toute modification du pH du milieu de culture entraine un blocage métabolique ainsi qu’une toxicité cellulaire. C’est pour cette raison que la régulation du pH tout au long de la culture cellulaire est obligatoire. Ceci est assuré par l’utilisation de systèmes tampons dans le milieu de culture tel que le bicarbonate (HCO3-). HCO3- est maintenu en équilibre avec 5% de CO2 dans l’atmosphère du système d’incubation. Le CO2 présent en volume prédéterminé (5%), se dissout dans le milieu de culture tamponné au bicarbonate et prévient son alcalinisation, toxique pour les cellules.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture - L’environnement gazeux : Azote, O2 (21%), CO2 (5%), Vapeur d’eau (% d’humidité). Dans l’étuve (Incubateur), l’atmosphère est constituée de 95% d’air et 5% de CO2. Le rôle de CO2: il intervient dans l’équilibre de pH (système HCO3-) mais également dans la prolifération cellulaire par son intervention dans la biosynthèse des bases puriques et pyrimidiques. La vapeur d’eau: prévient l’évaporation du milieu et l’augmentation de son osmolarité qui peuvent être causées par la température de 37°C - La température: La régulation de la température est obligatoire. Les cellules doivent être mises dans un milieu où la température est identique à celle de l’hote à partir duquel elles ont été obtenues.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture ii. Additifs : ❑ Le sérum: contient des facteurs nécessaires à la division et la différentiation des cellules en culture. Notamment: hormones, facteurs de croissance, molécules d’adhésion et protéines de transport (albumine, transferrine). Le % de sérum utilisé varie de 2 à 20 % selon le type cellulaire. Le sérum doit provenir de donneurs jeunes, plusieurs travaux ont montré que l’effet cytostimulant est inversement proportionnel à l’âge de donneur. Le sérum le plus utilisé est le SVF (sérum de vœu fœtal). Ce dernier ayant les meilleures performances. Le sérum de veau fœtal (SVF) est préparé à partir de sang prélevé de fœtus enlevés chez les vaches qui, au moment de l'abattage, sont gestantes. Le fœtus de veau est enlevé lors de l'éviscération et le sang est prélevé par ponction cardiaque sans anesthésie.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture Toutefois la présence de sérum est un facteur limitant car : Les sérum d’animaux peuvent être contaminés par des virus, champignons. En effet, ces derniers peuvent perturber le métabolisme des cellules. Les concentrations d’hormones et de facteurs de croissance sont instables dans les sérum et varient selon les donneurs. Ces deux paramètres peuvent engendrer une instabilité du pouvoir prolifératif attendu par le sérum en déstabilisant la régulation des métabolismes cellulaires. Ces inconvénients ont amené les chercheurs à mettre au point des milieux synthétiques définis sans sérum constitués d’un milieu de base auquel on rajoute différents additifs sélectionnées en fonction du types cellulaires.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture Remarque importante: Le SVF utilisé en culture cellulaire doit toujours être décomplémenté avant utilisation. La Décomplémentation du SVF permet d'inactiver le complément qui pourrait détruire les cellules dans le cas où le SVF contiendrait des Ac pouvant reconnaître les cellules cultivées (activation de la voie classique). La décomplémentation du sérum est réalisée par chauffage pendant 30 minutes à 56°C puis centrifugation afin d'éliminer les éventuelles protéines dénaturées qui ont précipité. ❑ Les antibiotiques : sont utilisés afin d’inhiber la croissance des contaminants bactériens et fongiques lors de la culture cellulaire (Pénicilline, Streptomycine, Fungizone..).  V. Besoins nutritifs des cellules en culture B. Les facteurs de croissance: Les facteurs de croissance sont des molécules polypeptidiques régulatrices qui, présentes en petites quantités, contrôlent la prolifération, la différenciation et la survie des cellules eucaryotes. Ce sont des signaux qui participent à toutes les étapes de la physiologie mais également de la physiopathologie comme les cancers. Selon James et Bradshaw (1984), un facteur de croissance doit répondre aux critères suivants : - La majorité de la structure est de nature polypeptidique. - Son action sur la cellule cible pour initier la réponse cellulaire ne s’effectue que si le facteur s’attache à un récepteur membranaire d’où la formation d’un complexe spécifique.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture La formation du complexe facteur de croissance-récepteur engendre : Une réponse hypertrophique (augmentation de la taille des cellules). Une réponse hyperplasique (augmentation de la population cellulaire). Dans certains cas, ce complexe induit ou bloque une étape de la différenciation. Le facteur de croissance et son récepteur sont éliminés de la surface de la cellule par endocytose.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture Les principaux facteurs de croissance caractérisés à ce jour : ❖ EGF (Epidermal Growth Factor ou facteur de croissance de l’épiderme) : Mis en évidence par S Cohen en 1959. l’EGF est un mitogène pour les cellules épidermiques et épithéliales in vivo et in vitro. ❖ IGF (Insuline Like Growth Factor) : Ce facteur a des effets similaires à l’insuline sur les tissus adipeux in vivo et in vitro (Froesh en 1963). L’IGF a une activité mitogène sur les fibroblastes. Il en existe deux types (IGF1 et IGF 2). Il existe 70% d’identité de séquence entre les deux sous types et 50% d’identité de séquence avec l’insuline.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture ❖ NGF (Nerve Growth Factor) : C’est un facteur qui augmente la survie et la différenciation des cellules gliales sensorielles. ❖ PDGF (Platelet derived growth factor) : le PDGF a été isolé à partir de plaquettes. Plusieurs types de cellules portent le récepteur du PDGF. Ce récepteur présente une activité Tyrosine- kinase. Le PDGF est un agent mitogène des cellules mésenchymateuses et des cellules vasculaires du muscle lisse. ❖ FGF (Fibroblast growth factor) : il a une activité mitogénique sur des cellules isolées de tissus : cerveau, hypothalamus, rétine. Le récepteur membranaire du FGF a été mis en évidence. Il a été particulièrement caractérisé sur des cellules de rein de hamster. Le récepteur existe également sur les cellules épithéliales du cristallin et les myoblastes. Le FGF stimule in vitro la croissance des cellules d’origine mésodermique, ectodermique, cellules épithéliales du cristallin, myoblastes.  V. Besoins nutritifs des cellules en culture ❖ TGF (Transforming growth factor) : il constitue un large groupe de facteurs de croissance secrétés par des cellules tumorales ou transformées in vitro. Cette famille englobe deux sous groupes: TGF-α et TGF-β qui sont capables de conférer un phénotype transformé à des fibroblastes normaux de reins de rats. Le TGF-α a été isolé d’une lignée métastasique de mélanome humain. Il présente 30% d’homologie avec l’EGF de souris. Le TGF-β, a été isolé de différents tissus d’origine normale ou néoplasique, il semble être un inhibiteur de la prolifération cellulaire. Son action est analogue à d’autres facteurs inhibiteurs TIF (Tumor inhibitory factor). VI. Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires Contrôle fonctionnel de la culture cellulaire: L’objectif de la culture cellulaire est de préserver les fonctions spécifiques des cellules tout en assurant leur prolifération. Nous devons donc prendre en considération les critères suivants afin d’assurer la bonne marche de la culture I. Contrôle de mise en route (de démarrage): Ce contrôle est effectué avant de mettre les cellules en culture. Il consiste à : - Assurer des conditions d’asepsie. - Réaliser un test de viabilité, permettant de situer l’état de départ des cellules. - Il est impératif de vérifier la morphologie des cellules au microscope à phase inversée. - Dans certains cas, il est nécessaire de vérifier leur ultrastructure au microscope électronique. VI. Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires I.1. Test de viabilité: a. Test de viabilité au bleu de Trypan: La coloration au bleu de trypan est une méthode de coloration des cellules mortes. Il a tendance à entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue. VI. Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires II. Contrôle de routine : Ce contrôle est effectué quand la culture est en route, l’objectif de contrôle est d’établir des conditions optimales pour la culture cellulaire. Il repose sur le changement de milieu. La fréquence du changement de milieu dépend des cellules mais en règle générale, la fréquence est de 2-3 jours. Le renouvellement du milieu doit se faire même quand les cellules ne sont plus en phase de prolifération car elles continuent à métaboliser des molécules néfastes à leur survie tels que les protéases. Quand et comment faut-il changer le milieu ? Le paramètre physico-chimique à contrôler est le pH. Les cellules vivantes exigent un pH neutre. A pH< 6.5, la viabilité est menacée. La modification du pH est indiquée par les indicateurs que contient le milieu. La forte concentration des cellules tend à l’acidification du pH du milieu. Le contrôle de l’état de confluence des cellules doit être fait tous les 2 jours. VI. Contrôle fonctionnel et contrôle des contaminations des cultures cellulaires Contrôle des contaminations des cultures cellulaires: La qualité des résultats de recherche dépend de la qualité des cultures cellulaires et dans cet axe, le manipulateur doit être vigilant face aux divers contaminants, soit d’origine biologique ou chimique. Qu’ils soient visibles ou non, destructeurs ou non, les contaminants agissent sur la croissance, altèrent les caractéristiques et les fonctions cellulaires et influent sur la qualité des résultats. Parfois, certains agents ne sont pas toxiques individuellement mais peuvent le devenir, soit par leur forte concentration ou combinés avec un autre agent. Egalement, certains types cellulaires sont plus sensibles que d’autres. VI. Contrôle fonctionnel etVI. contrôle Contrôle desdes contaminations contaminations desdes cultures cultures cellulaires cellules Deux types de contaminations Chimique Biologique - Endotoxines - Levures, moisissures, bactéries - Ions métalliques Milieu, sérum, eau - ATB - Traces de détergents chimiques - Résidus de germicides ou turbidité, changement de pH, mort pesticides utilisés pour cellulaire désinfecter les incubateurs, Cependant, les mycoplasmes et les comptoirs virus sont très difficiles à détecter - Impureté du CO2 de visuellement et nécessitent des l’incubateur méthodes de détection spécifiques.  VI. Contrôle des contaminations des cultures cellulaires ▪ Contrôles des mycoplasmes : Le mycoplasme est le plus dévastateur et le plus répandu des contaminants. On le surnomme le cancer des cellules. Aussi appelé PPLO (PleuroPneumonialike Organisme), il en existe de nombreuses souches. Ce sont des bactéries dépourvues de paroi, adhérant fortement aux cellules. La contamination des cultures de cellules par des mycoplasmes est une préoccupation récurrente des laboratoires. En effet, de par leur nature, ces microorganismes sont très difficiles à détecter et à éliminer. Aucun signe visible lorsqu’on observe les cellules, sauf dans le cas où elles meurent ou bien changent de morphologie.  VI. Contrôle des contaminations des cultures cellulaires La détection des mycoplasmes se fait par deux voies : Voie directe Voie indirecte Test de croissance en culture: Ce test consiste à faire pousser en culture les éventuels mycoplasmes qui contaminent une culture. C'est un test microbiologique classique, consistant à réaliser des cultures sur des milieux appropriés pendant 28 jours. le milieu de culture utilisé est un milieu liquide qui comprend un bouillon de base : Sérum de cheval Extrait de levure Arginine Glucose Indicateur de Ph. Ce test est long et complexe à mettre en place et à interpréter, notamment parce qu'il nécessite la mise en culture d'un témoin positif. Il n'est pas recommandé de le mettre en place comme test de routine dans un laboratoire.  VI. Contrôle des contaminations des cultures cellulaires La détection des mycoplasmes se fait par deux voies : Voie indirecte Test de coloration de l'ADN: Ce test consiste à « marquer » l'ADN des mycoplasmes grâce à un intercalant pour ensuite le visualiser au microscope à fluorescence. Cette coloration est la méthode la plus sensible et la plus économique pour détecter les Mycoplasmes. Le fluorochrome utilisable est le Diamido- Phenylindole (DAPI), qui se lie à l’ADN. En microscopie à fluorescence, les cellules non infectées présentent une fluorescence du noyau et les cellules infectées, un noyau fluorescent ainsi qu’une fluorescence extranucléaire due à l’ADN des Mycoplasmes.  VII. La conservation des cellules en culture A. Intérêts de la conservation des cellules : Constitution d’une réserve. Protection des cellules contre : Les modifications de leur patrimoine génétique Le vieillissement in vitro Les contamination La conservation des cellules est indispensable pour les cellules à durée de vie limitée et pour les cellules difficiles à entretenir.  VII. La conservation des cellules en culture B. Historique « Les débuts de la cryobiologie » : 1912 : Alexis Carrel établit les bases scientifiques de la conservation à basse température des tissus humains et d’origine animale. Les tissus sont conservés dans les réfrigérateurs (+4°C) en chambre humide (peau, cornée).  VII. La conservation des cellules en culture La cryogénie s’est développée au 19ème siècle à partir d’expériences scientifiques sur la liquéfaction des gaz permanents. Parmi les gaz permanents connus, l’oxygène et l’azote, comme principaux constituants de l’air, sont les plus importants. Pour la liquéfaction des gaz, le chimiste écossais James Dewar (1842–1923) a joué un rôle important. C’était lui qui, en 1892, réalisa la première bouteille isotherme pour la conservation et le transport de gaz liquides. Ce genre de bouteilles sous vide est toujours en usage et certaines continuent de porter le nom de leur inventeur Dewar.  VII. La conservation des cellules en culture C. La cryoconservation : La cryoconservation est un procédé où des cellules ou tissus entiers sont conservés en les refroidissant à très basse température, entre −180 °C et −196 °C. À ces températures extrêmement basses, toute activité biologique est suspendue, y compris les réactions biologiques qui provoqueraient la mort cellulaire. La conservation de longue durée se réalise donc dans de l'azote liquide à -180°C. La conservation de court durée se réalise à -20°C. Si la matière conservée n’est pas bien protégée contre la formation de glace en dehors des cellules, la déshydratation ou la formation de glace dans les cellules, elle sera souvent affectée durant le processus de congélation et/ou de fonte ce qui influe négativement sur sa viabilité. Les cryoprotecteurs et la congélation progressive sont des moyens et mécanismes pour réduire les dommages causés par le gel aux cellules.  VII. La conservation des cellules en culture D. Réactifs: L’Azote liquide Les cryoprotecteurs DMSO (Dimethyl sulfoxyde) Glycérol  VII. La conservation des cellules en culture Les cryoprotécteurs : 1. Le glycérol: Découverte importante à Cambridge (Royaume-Uni) en 1949. Polge, Smith et Parkes découvrent l’action cryoprotectrice du glycérol. Ces auteurs ne voyaient pas encore la signification pratique de leurs travaux et le mécanisme d’action du glycérol n’était pas encore bien élucidé. Aujourd’hui, il est bien établi que le glycérol pénètre dans les cellules animales et protégerait contre la cristallisation de l’eau intra et extracellulaire. Cependant, le pouvoir pénétrant du glycérol est faible et lent. Le taux de viabilité cellulaire après décongélation serait faible.  VII. La conservation des cellules en culture Les cryoprotécteurs : 2. Le DMSO (diméthylsulfoxyde): Découvert par Lovelock et Bishop 1959, le DMSO serait plus efficace que le glycérol. En effet, son pouvoir pénétrant est plus important et plus rapide. Son mécanisme d’action serait le même que celui du glycérol; il protégerait contre la cristallisation de l’eau intra et extracellulaire. Actuellement, le DMSO est très utilisé dans la conservation des cellules notamment les cellules souches..Bien que le taux de viabilité des cellules serait plus important avec le DMSO, ce dernier s’avère être toxique pour les cellules. En général, le DMSO devient toxique au-delà de 1,5M  VII. La conservation des cellules en culture E. Matériel utilisé : Ampoules Cryotubes  VII. La conservation des cellules en culture F. Méthode de congélation : 1. Déterminer la viabilité de la population cellulaire, attendre la fin de la phase exponentielle de croissance pour entamer la conservation. Pour bien réussir la congélation de ses cellules, il est TRÈS important que les cellules soient en phase exponentielle, pas trop confluentes (dans le cas des cellules adhérentes). Elles doivent être en bonne santé, le pH du milieu bien rouge, pH 7.2-7.4, pas trop acide. 2. Centrifuger afin d’éliminer toute trace d’enzyme utilisée pour le détachement (le cas des cellules adhérentes). Donc s’il s’agit de cellules adhérentes, on procède d’abord à une trypsination. On procède comme pour faire un passage. A la fin on centrifuge pour récupérer les cellules.  VII. La conservation des cellules en culture 3. Bien disperser les cellules dans leur milieu de culture à une densité de 106-107 cellules/ml + 5 à 10% de cryoprotecteur. 4. Repartir la suspension dans des cryotubes qui doivent porter les caractéristiques suivantes : -Type cellulaire -Nombre de passage ou étape de la culture -Date de la congélation 5. On procède à un abaissement progressif de la température en utilisant des boites de congélation contenant de l’isopropanol (-80°C pendant une nuit). Ensuite, on les transfère rapidement dans l’azote liquide (- 180°C). La congélation doit être progressive et non brutale.  VII. La conservation des cellules en culture Cette méthode est très efficace, elle permet la conservation des cellules et de leurs fonctions pendant de nombreuses années. Des cellules congelées dans l’azote devraient, théoriquement, se conserver 5 ans et à –70°C, un an pas plus. Il est nécessaire de renouveler le stock à l’occasion.  VII. La conservation des cellules en culture G. Méthode de décongélation : Contrairement à la congélation qui doit être progressive, la décongélation doit être rapide. 1. Placer l’ampoule ou le cryotube à 37°C (bain marie) pendant 1 min jusqu'à décongélation complète. 2. Stérilisation du tube par l’alcool avant de l’introduire sous la hôte à flux laminaire. 3. Transfert et dispersion de la suspension cellulaire dans un tube contenant du milieu de culture approprié 4. Centrifugation pour éliminer les traces d’agents cryoprotecteurs. 5. Resuspension du culot cellulaire dans du milieu frais. Remarque : Un test de viabilité est effectué systématiquement.  VII. La conservation des cellules en culture H. Incidences d’une mauvaise congélation ou décongélation : - Formation de cristaux de glace intracellulaires. - Variation de la pression osmotique. - Diminution du rendement, déviation des activités métaboliques.