Enzymologie 2024-2025 Cours PDF

ENZYMOLOGIE 2024 - 2025 12h CM (T. Noguer) 9h TD (P. Comella) 9h TP (T. Noguer) : Etude de la ß-galactosidase (3 séances)  Contenu et objectifs du cours En CM et TD, les étudiants reçoivent une formation en catalyse...

ENZYMOLOGIE 2024 - 2025 12h CM (T. Noguer) 9h TD (P. Comella) 9h TP (T. Noguer) : Etude de la ß-galactosidase (3 séances)  Contenu et objectifs du cours En CM et TD, les étudiants reçoivent une formation en catalyse et cinétique des enzymes de type Michaelien. Après une description des principaux paramètres physico-chimiques influençant l'activité enzymatique, est abordée l'étude des grands types d'inhibitions (réversibles et irréversibles), illustrée par des exemples d'inhibiteurs utilisés en thérapeutique ou en phytopharmacie. Une dernière partie du cours décrit les différents systèmes de régulation de l'activité enzymatique, plus particulièrement l'étude des enzymes allostériques, mais également la modification covalente, la protéolyse, les isozymes et les protéines régulatrices.  ENZYMOLOGIE 2024-2025 Modalités de contrôle des connaissances 1 contrôle continu sur les TDs (exercices) : 7 points 3 comptes-rendus de TP : 6 points 1 contrôle sur le cours : 7 points  COURS D’ENZYMOLOGIE T. NOGUER 2024-2025 Ouvrages de référence : Biochemistry (Biochimie), 3ème édition, Garrett & Grisham, Ed. Thomson (2007) Enzymologie et Applications - Parcours LMD, J.-P. Sine, Ed. Ellipses (2010) Enzyme kinetics, I.H. Segel, Ed. Wiley (1975)  Plan du cours I - Introduction & définitions I.1 - Enzyme a - Définition b - Notion de Spécificité c - Classification et nomenclature d - Principales applications des enzymes I.2 - Substrat I.3 - Produit I.4 - Ligand I.5 - Cofacteur I.6 - Coenzyme II – Notion de site actif III- La réaction enzymatique III.1 - Ecriture de la réaction III.2 - Méthodes de mesure IV - Cinétiques enzymatiques IV.1 - Notion de Vitesse Initiale IV.2 - Influence de la concentration en enzyme IV.3 - Influence de la concentration en substrat IV.4 - Modèle de Michaelis-Menten IV.5 - Signification et détermination des constantes IV.6 - Expression de l’activité enzymatique IV.7 - Représentations graphiques linéaires V- Influence des facteurs physico-chimiques V.1 – Influence de la température V.2 – Influence du pH VI - Effet des Inhibiteurs – Grands types d’inhibitions VI.1 - Inhibition réversible VI.2 - Inhibition irréversible VI.3 - Inhibition par excès de substrat VII - Enzymes allostériques VIII – Modification covalente d’enzymes IX – Autres modes de régulation de l’activité enzymatique I - Introduction & définitions I.1 - Enzyme a - Définition Une enzyme est une protéine catalysant une réaction biochimique. L’enzymologie est l’étude des enzymes. b - Historique Dès le XIXème siècle, on avait constaté que plusieurs réactions chimiques semblaient ne pouvoir se produire que dans les êtres vivants. Exemple : transformation du sucre en alcool, impossible sans utiliser des microorganismes (levures ou bactéries). La théorie vitaliste postulait alors que les êtres vivants devaient posséder une énergie vitale qui leur était propre. La découverte des enzymes allait porter un dur coup à cette théorie qui est aujourd'hui complètement abandonnée. Quelques dates… 1783 : Lazzaro Spallanzani observe la liquéfaction de la viande de veau par le suc gastrique de faucon, et l’effet de la température. 1833 : Première découverte d'une enzyme : Anselme Payen et Jean-François Persoz isolent une substance labile à la chaleur qui hydrolyse l'amidon. Ils ont appelé cette fraction « diastase » (du grec « séparation »), puisqu’elle séparait le sucre soluble de l'amidon insoluble. On sait maintenant qu’il s’agissait de l’amylase. 1834 : Theodor Schwann obtient le premier agent actif d'origine animale (la pepsine) qu'il a partiellement purifiée en traitant par l'acide la paroi stomacale de poulets. 1838 : Charles Cagniard de Latour montre que le processus de fermentation est dû à des organismes vivants. 1858 à 1871 : Les travaux de Louis Pasteur confirment cette idée. Pasteur émet l'hypothèse révolutionnaire que les changements chimiques lors de la fermentation résultent de l’activité de micro- organismes (levures). 1860 : Marcellin Berthelot fait macérer de la levure et obtient une fraction capable de convertir le sucrose (saccharose) en glucose et fructose. Il conclut que l’« invertase » est l'un des multiples « ferments » présents dans la levure. 1878 : Wilhem F. Kühne proposa le nom d'enzyme (du grec "dans le levain") pour qualifier ces ferments. Le suffixe « ase » fût proposé par Duclaux en 1898. 1894 : Hermann Emil Fischer propose le concept de reconnaissance enzyme – substrat de type « clé - serrure » 1897 : Gabriel Bertrand observe que certaines enzymes requièrent des facteurs dialysables pour leur activité : il les nomma "coenzymes". 1902 : Victor Henri et Adrian Brown suggèrent indépendamment que la formation d'un complexe enzyme - substrat est un intermédiaire obligatoire de la réaction enzymatique. Henri est le premier à décrire l'équation mathématique reliant l'effet de la concentration du substrat à la vitesse de catalyse. 1913 : Leonor Michaelis et Maud Menten redécouvrent l'équation de V. Henri et établissent l'équation de Michaelis - Menten (en toute rigueur Henri - Michaelis - Menten) qui décrit la vitesse de la réaction enzymatique 1926 -1930 : Premières cristallisation de l'uréase (James Sumner), de la pepsine, la trypsine et la chymotrypsine (John H. Northrop) 1940-1950 : Purification et cristallisation de centaines d'enzymes, élucidation de dizaines de voies métaboliques. 1955 : Frédéric Sanger publie la séquence complète en acides aminés de l'insuline (masse molaire 6000 Da). 1957 : John Kendrew obtient la première structure cristallographique d'une protéine (la myoglobine), déduite de la diffraction des rayons X (Nobel 1962). Années 60 : Publication de la première séquence d'une enzyme (la ribonucléase, 13700 Da) 1963 : William W. Cleland proposa une procédure claire et uniforme pour écrire les équations des cinétiques des systèmes enzymatiques à plusieurs substrats. 1965 : Jacques Monod, Jeffries Wyman et Jean-Pierre Changeux proposent un modèle cinétique (modèle MWC) pour les enzymes allostériques. 1966 : Daniel Koshland, Nemethy et Filmer généralisèrent le modèle MWC en incluant la notion d'ajustement induit proposé par Koshland en 1959 (modèle KNF). 1972 : Prix Nobel de Chimie décerné à Christian Anfinsen (1916- 1995) pour avoir démontré le lien entre la séquence en acides aminés et la conformation biologiquement native- active de la ribonucléase et à Stanford Moore (1913-1982) et William Stein (1911-1980) pour avoir démontré le lien entre la structure chimique et l’activité catalytique du centre actif de la ribonucléase. Depuis 1980 : Travaux sur l’acquisition de la forme native d’une chaîne polypeptidique : – Découverte des protéines dites « chaperonnes » (Ron Laskey, 1978 ; John Ellis, 1987). Ces protéines aident au repliement d’autres protéines ou les maintiennent dans la conformation native quand la cellule est soumise à certains stress. – Découverte des protéines dites intrinsèquement (ou nativement) non structurées. Ces protéines n’ont pas de structure tridimensionnelle à l’état libre et acquièrent leur structure fonctionnelle quand elles interagissent avec leur(s) partenaire(s) cellulaire(s). Emergence de moyens informatiques et de méthodes de modélisation des protéines puissants Fort développement des « omiques », notamment la transcriptomique et la protéomique. Bases de données Depuis 1971, les archives de la Protein Data Bank (PDB) servent de référentiel unique d'informations sur les structures 3D des protéines, des acides nucléiques et des assemblages complexes. https://www.rcsb.org Depuis 1987, BRENDA est la principale collection de données fonctionnelles enzymatiques disponible pour la communauté scientifique. www.brenda-enzymes.org c - Rôle Dans les organismes vivants, toutes les réactions chimiques sont catalysées par des enzymes. Elles sont les agents du métabolisme. Exemple : le glucose, « carburant » universel des cellules, est utilisé pour produire de l’énergie : Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O ∆G0’ = -2870 kJ/mol Dans la cellule, cette réaction est rendue possible grâce à des enzymes qui abaissent l’énergie d’activation de la réaction. Les systèmes vivants utilisent des enzymes pour accélérer et contrôler la vitesse de réactions biochimiques vitales. Les enzymes sont généralement utilisées en séquences (cascades), certaines ont un rôle régulateur de voies métaboliques. Exemple de voie métabolique: la dégradation du glucose en pyruvate au cours de la Glycolyse  b - Notion de Spécificité - Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, elle catalyse toujours la même transformation. - La spécificité est liée à une relation de type structure-activité, elle est déterminée par l’accessibilité du site actif de l’enzyme (problème de conformation) et par la réactivité des espèces mises en jeu. - La spécificité d’une enzyme peut donc être plus ou moins étroite. - Elle peut être illustrée par 2 modèles : le modèle clé-serrure (Fischer, 1894) et le modèle de forme induite (Koshland, 1958). Modèle clé-serrure (Fischer, 1894) H. E. Fischer (1852-1919)  D. Koshland Modèle de forme induite (Koshland, 1958) (1920-2007) Dans ce modèle, qui dérive du modèle clé-serrure, il est postulé que l’association enzyme-substrat est permise après une modification de la conformation de l’enzyme induite par l’entrée partielle du substrat. La structure tridimensionnelle fonctionnelle de l’enzyme, c’est-à- dire sa forme active, n’existe donc qu’en présence de son substrat. Ce modèle introduit la notion de réorganisation moléculaire et de dynamique lors de la reconnaissance enzyme - substrat. c - Classification et nomenclature Les noms des enzymes sont généralement des noms triviaux construits en ajoutant le suffixe « ase » au nom du substrat de l’enzyme. ex : urée → uréase, proteine → protéase… 1956 : Codification internationale établie par la Commission internationale sur les Enzymes (Enzyme Commission, EC) Le principe du classement est le suivant : Les enzymes sont classées de façon hiérarchisée, essentiellement en fonction de la description du type de réaction catalysée, pas en fonction des caractéristiques structurales de l'enzyme. A chaque enzyme est associée un "numéro" de classification appelé "EC number". Il est construit ainsi : [numéro de la classe] = type de réaction (6 classes) [numéro de la sous-classe] = type de fonction du substrat métabolisé [numéro de la sous-sous-classe] = type d’accepteur [numéro d’ordre] (dans la sous-sous classe) Les 6 classes de réactions : - 1 : Oxydoréductases (réactions d’oxydo-réduction) Ex : Alcool déshydrogénase (EC 1.1.1.1) alcool + NAD+ → aldéhyde + NADH - 2 : Transférases (transfert d’un groupement) Ex : Hexokinase (EC 2.7.1.1) hexose + ATP → hexose-6-P + ADP - 3 : Hydrolases (hydrolyse de liaisons) Ex : ß-galactosidase (EC 3.2.1.23) lactose + H2O → glucose + galactose - 4 : Lyases (coupure et élimination) Ex : pyruvate décarboxylase (EC 4.1.1.1) 2-oxoacide → aldéhyde + CO2 - 5 : Isomérases (changements structuraux ou géométriques) Ex : glucose isomérase (EC 5.3.1.5) glucose → fructose - 6 : Ligases (liaison entre 2 molécules en présence d’ATP) Ex : pyruvate carboxylase (EC 6.4.1.4) pyruvate + HCO3- + ATP → oxaloacétate + ADP + PO4- Associée au classement et au "EC number", existe la nomenclature des noms systématiques : Le nom systématique est formé par [le(s) nom(s) du(es) substrats] [le nom de la nature de la réaction] puis le suffixe ase ; Soit l'enzyme « alcool déshydrogénase » Réaction : alcool primaire + NAD+ → aldéhyde + NADH,H+ appartient à la classe des oxydoréductases (classe 1) ; sous-classe des oxydoréductases utilisant -CH-OH comme donneur d'électrons (= sous-classe 1) ; sous-sous-classe des oxydoréductases utilisant NAD + ou NADP+ comme accepteur d'électrons (= sous-sous-classe 1) ; numéro de série attribué = 1. → d'où le "EC number" EC 1.1.1.1 Nom systématique : alcool:NAD+ oxydoréductase Autres noms : alcool déshydrogénase (accepté) … d - Principales applications des enzymes - Détergents (lessives) : protéases, amylases, lipases, cellulases. - Industrie de l’amidon : -amylases, amyloglucosidase… - Domaine agroalimentaire : Alimentation humaine : - Industrie laitière : présure (et fromagère), lysozyme, ß-galactosidase… - Panification : -amylases, xylanases, oxydases… - Brasserie : amylases, protéases, hemicellulases, papaïne - Obtention de prébiotiques : hydrolyse enzymatique de polyholosides végétaux ou synthèse enzymatique d’oligosaccharides. Alimentation animale: - Compléments alimentaires : phytases, glycosidases - Chimie fine et santé - Applications analytiques, diagnostic et biocapteurs - Dosages enzymatiques et immunoenzymatiques. I.2 - Substrat Le substrat (noté S) est une molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action d’une enzyme. Une enzyme peut avoir un ou plusieurs substrats. I.3 - Produit Le produit (noté P) est la molécule qui apparaît à l’issue de la réaction catalysée par une enzyme. Une même réaction peut générer un ou plusieurs produits. I.4 - Ligand Le terme « ligand » qualifie tout corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine. Il existe au moins un site de fixation spécifique du ligand sur la protéine. I.5 - Cofacteur Un cofacteur est un corps chimique (atome ou molécule) indispensable à une réaction enzymatique. Il n’est pas transformé de manière définitive par la réaction. Quelques éléments minéraux servant de cofacteurs enzymatiques 1.6 - Coenzymes Un (ou une) coenzyme est une molécule biologique intervenant comme cofacteur dans la catalyse enzymatique d’une réaction : - Les coenzymes libres interviennent de manière stœchiométrique, leur concentration doit être du même ordre que celle du substrat. exemples : Phosphotriose déshydrogénase glycéraldéhyde-3-P + NAD+ + Pi glycérate-1,3-diphosphate + NADH + H+ Alcool déshydrogénase ethanol + NAD+ ethanal + NADH + H+ Structure des formes oxydées et réduites du NAD Déshydrogénases XH2 + NAD+ X + NADH + H+ Substrat Produit (réduit) (oxydé) - Les coenzymes liés (groupements prosthétiques) interviennent de manière catalytique, leur concentration est du même ordre que celle de l’enzyme. exemple : Succinate déshydrogénase-FADH2 Succinate déshydrogénase-FAD Succinate Fumarate FAD lié à une histidine de la sous-unité 1 Succinate déshydrogénase Structure du FAD (hétérotétramère) II. Notion de Site actif Région de l’enzyme où les molécules de substrat se lient et subissent la réaction chimique. Le site actif est constitué de résidus d'acides aminés qui forment des liaisons temporaires avec le substrat (site de liaison) et de résidus qui catalysent une réaction de ce substrat (site catalytique). Il se compose généralement de trois à quatre acides aminés, tandis que d'autres acides aminés de la protéine sont nécessaires pour maintenir la structure tertiaire des enzymes. Organisation-type de la structure Exemple du lysozyme (en noir le d’une enzyme substrat peptidoglycane) Exemple : site actif du lysozyme, enzyme qui hydrolyse les liaisons covalentes (β1→4) de la paroi bactérienne composée de peptidoglycane (a) (b) (c) Structure primaire (a) et tertiaire (b) du lysozyme de poulet. Site actif avec les acides aminés responsables de l'activité lysozyme (c). Réaction catalysée par le lysozyme Remarque : Certaines maladies sont dues à des mutations affectant le site actif d’enzymes Exemple : La phénylcétonurie, maladie génétique grave due à des mutations de la phénylalanine hydroxylase (PAH) La phenylalanine La PAH catalyse l’hydroxylation de la hydroxylase est un phenylalanine en tyrosine : tetramère → Quand la PAH ne fonctionne pas →Chez les sujets malades Glu dans cela entraîne une suraccumulation le site actif est muté en Lys de phénylalanine et un retard mental grave dès l’enfance Sujet sain :... Tyr Asn Pro Glu Pro Asp... Sujet Malade :... Tyr Asn Pro Lys Pro Asp...  Les triades catalytiques interviennent dans le site actif de certaines hydrolases et transférases telles que des peptidases, des amidases, des estérases, des lipases et des β-lactamases Ex: sérine Substra t Ex: histidine Ex: acide aspartique ou glutamique Mécanisme réactionnel d'une triade catalytique : un résidu d'acide aminé acide, généralement de l'aspartate ou du glutamate, aligne et polarise un Exemples de combinaisons d'acides aminés formant résidu basique, généralement de l'histidine, ce qui différentes triades catalytiques. réduit le pKa et active un résidu nucléophile, généralement de la sérine ou de la cystéine, parfois de la thréonine, qui peut ainsi catalyser la réaction.  Exemple de triade catalytique Ser/His/Asp : Mécanisme d’action des sérine protéases. La triade catalytique agit de manière concertée et clive la liaison peptidique en deux étapes. III - La réaction enzymatique II.1 - Ecriture de la réaction Enzyme Substrat Produit E S P Si on change le sens d’une réaction enzymatique réversible, le produit devient substrat et vice-versa. Phases de la réaction enzymatique k1 E+S E-S (complexe enzyme-substrat) k-1 k2 E-S k-2 E-P k3 E-P E+P k-3 où k1, k2 et k3 sont les constantes de vitesse des réactions directes et k-1, k-2 et k-3 sont les constantes de vitesse des réactions inverses. II.2 - Méthodes de mesure L’activité enzymatique est généralement mesurée par évaluation de la vitesse initiale d’apparition d'un produit de la réaction ou (plus rarement) de la vitesse de disparition d’un substrat. Les méthodes de mesure sont généralement des méthodes spectrophotométriques (UV-visible). D’autres méthodes peuvent être utilisées : fluorimétrie, conductimétrie, électrochimie (potentiométrie ou ampérométrie) …. Les méthodes spectrophotométriques sont utilisées lorsque la réaction génère ou consomme des espèces colorées (colorimétrie), ou absorbant dans le domaine de l’UV. Ces méthodes sont basées sur la loi de Beer-Lambert : A = Absorbance à l donnée A=εlC ε = coefficient d’absorbance C = concentration (mol/L) l = trajet optique (cm) IV - Cinétiques enzymatiques IV.1 - Notion de Vitesse Initiale La concentration d’enzyme doit être négligeable par rapport à la concentration en substrat. - représentation graphique des phases de la réaction : E + S  ES EP E + P [P] Effet du Equilibre Produit ES EP [EP] Phase Stationnaire [S]>>>[P] Phase t (min) pré-stationnaire (formation rapide de [ES]) État stationnaire : point où la vitesse de formation des intermédiaires égale leur vitesse de disparition. La vitesse initiale d’une réaction est mesurée à l’état stationnaire (partie linéaire de la courbe). Dans ces conditions, où la concentration de produit augmente linéairement en fonction du temps, la vitesse initiale de la réaction enzymatique peut être calculée comme suit : vi = -dS/dt = dP/dt La dimension de la vitesse est une concentration par unité de temps, l’unité officielle étant M.s-1 Pour des raisons pratiques les biochimistes l’expriment souvent en µM.min-1 IV.2 - Influence de la concentration en enzyme Pour une concentration de substrat donnée, la vitesse initiale de la réaction enzymatique est proportionnelle à la concentration d’enzyme utilisée. [S] fixe >> [E] [E1] < [E2] < [E3] [P] [E3] [E2] [E1] t (min) IV.3 - Influence de la concentration en substrat Pour une quantité d’enzyme donnée, la vitesse initiale de la réaction enzymatique augmente avec la concentration de substrat : [P] [E] fixe >>>> KM Dans ce cas, lorsque [S]→ ∞ alors v → Vmax Graphiquement Vmax est l’asymptote de la courbe de saturation v= f[S] (rappel : v est en fait la vitesse initiale vi)  k1 k2 E+S ES E+P k-1 La constante de Michaelis KM (ou Km) est définie par le rapport : KM = (k-1+ k2)/k1 L’affinité de l’enzyme pour son substrat est d’autant plus grande que la constante de Michaelis KM est petite. Détermination du KM : - Lorsque [S] est égal au KM l’équation v = Vmax [S] / (KM + [S]) devient v = Vmax [S] / ([S] + [S]) donc pour [S] =KM alors v = Vmax / 2  → Détermination graphique du Vmax et du KM v Vmax ½ Vmax [S] KM La constante catalytique kcat (k2) est une constante de vitesse du premier ordre, d’unité s-1, correspondant à une fréquence. Elle correspond à la fréquence à laquelle l’enzyme travaille lorsqu’elle est saturée en substrat. On utilise souvent le terme anglais « turnover ». Elle caractérise l’efficacité de l’enzyme. Son expression mathématique est kcat= Vmax /[Et] On peut déduire de 1/kcat la durée du cycle catalytique. La constante de spécificité correspond au rapport kcat/KM IV.6 - Expression de l’Activité enzymatique Unité Internationale (UI)= quantité d’enzyme permettant de catalyser la transformation d’une micromole de substrat en une minute. Activité spécifique (UI/mg): L'activité spécifique d'une enzyme correspond à la quantité de produit (en µmole) formé par minute et par mg de protéine. C'est une mesure du degré de pureté de l'enzyme. Sa valeur augmente au cours de la purification et atteint une valeur maximale quand l'enzyme est pure. Katal (Système International)= quantité d’enzyme permettant de catalyser la transformation d’une mole de substrat en une seconde. Généralement les activités mesurées sont exprimées en microkatal ou en nanokatal. IV.7 – Représentations graphiques linéaires En raison de sa nature hyperbolique, la représentation de Michaelis- Menten n’est pas utilisée pour déterminer les paramètres KM et Vmax → utilisation de régressions linéaires. a. Représentation de Lineweaver & Burk (en double-inverse) v = Vmax [S] / (KM + [S]) Utilisation de l’équation réciproque 1/v = 1/Vmax + KM/(Vmax[S]) 1/v Pente = KM/Vmax 1/Vmax -1/KM 1/[S] Représentation pratique mais peu adaptée aux faibles valeurs de [S] et de v, acceptable pour [S] élevées. b. Représentation de Eadie & Hofstee v = Vmax [S] / (KM + [S]) donc v (KM + [S]) = Vmax [S] En divisant par [S] on a : v = Vmax - KM(v/[S]) v Vmax Pente = -KM Vmax/KM v/[S]  c. Représentation de Hanes & Woolf v = Vmax [S] / (KM + [S]) , donc v/[S] = Vmax/(KM + [S]) D’où [S]/v = [S]/Vmax + KM/Vmax [S] / v Pente = 1/Vmax KM/Vmax -KM [S] Cette représentation conduit généralement à une détermination plus précise des paramètres KM et Vmax. d. Représentation de Eisenthal & Cornish-Bowden On porte en ordonnée les valeurs de v et en abscisse les valeurs négatives de [S], puis chaque couple est relié par une droite. L’extrapolation des droites obtenues donne un point d’intersection dont les coordonnées donnent KM (en abscisse) et Vmax (en ordonnée). v Vmax v5 v4 v3 v2 v1 -S5 -S4 -S3 -S2 -S1 0 KM -[S] Cette représentation conduit généralement à une détermination précise des paramètres KM et Vmax. V- Influence des facteurs physico-chimiques V.1 - Influence de la température Généralement la vitesse d’une réaction chimique double lorsque la température augmente de 10°C. C’est le cas également pour les réactions catalysées. Toutefois, dans le cas des enzymes, une élévation de température peut induire un perte partielle ou totale d’activité par dénaturation. La courbe d’activité en fonction de T résulte du recoupement de 2 phénomènes : l’augmentation de la vitesse et la dénaturation de l‘enzyme : Vitesse  Activité relative Dénaturation Température  Extrêmozymes = enzymes d’environnements extrêmes Certains organismes, principalement des microorganismes, se sont adaptés à des conditions extrêmes. Leurs enzymes ont une activité optimale décalée par rapport aux « mésophiles » : - Vers les faibles températures (cryophiles ou psychrophiles) (mers polaires, abysses, sols gelés, glaciers…) - Vers les températures élevées (thermophiles) ou très élevées (hyperthermophiles) (sources hydrothermales et volcaniques terrestres ou sous marines…) Activité relative Applications des enzymes 94-98°C thermophiles et hyperthermophiles 20-30 sec - La PCR (Polymérase Chain 50-65°C Reaction) : technique 20-40 sec d‘amplification in vitro de l’ADN : Taq Pol : 72° utilisation d’ADN polymérases isolées de bactéries hyperthermophiles (Thermus aquaticus, Thermus thermophilus…) Applications des enzymes thermophiles et hyperthermophiles - Industrie de l’amidon : solubilisation et hydrolyse en monomères de glucose -amylases de Bacillus licheniformis ou de Bacillus strearothermophilus : hydrolyse des liaisons 1-4 (5-10 min à 105°C, puis 2 h à 95°C) → production de maltodextrines Amyloglucosidase d’Aspergillus niger : hydrolyse des liaisons 1-4 à partir des extrémités non réductrices (40-72 h à 60°C) et des liaisons 1-6 (plus lent). → Obtention de glucose V.2 - Influence du pH Le pH du milieu conditionne l’état d’ionisation des acides aminés (des protéines) et également du substrat. Dans la plupart des cas, la courbe d’activité en fonction du pH montre un profil en cloche : VI - Effet des Inhibiteurs – Grands types d’inhibitions Inhibiteur = ligand non transformé par la réaction enzymatique, qui modifie le comportement de l’enzyme et en diminue l'activité. L'inhibition des enzymes joue un rôle important dans le contrôle des mécanismes biologiques, et notamment dans la régulation des voies métaboliques. Applications : - de nombreux médicaments, pesticides (herbicides, fongicides, insecticides) sont des inhibiteurs enzymatiques. -en enzymologie, les inhibiteurs sont très utilisés pour déterminer le mécanisme d'action d'une enzyme. Toutes les molécules se liant à une enzyme ne sont pas des inhibiteurs, les activateurs enzymatiques existent également et accroissent l'activité de l'enzyme. L’inhibition enzymatique peut être réversible ou irréversible. -Les inhibiteurs réversibles se lient de façon non covalente, différents types d'inhibition en résultent selon que ces inhibiteurs se lient à l'enzyme, au complexe enzyme-substrat (ES) ou aux deux. - Les inhibiteurs irréversibles réagissent généralement avec l'enzyme et la modifient chimiquement. Il se fixent de manière covalente et modifient des acides-aminés indispensables à l'activité enzymatique. VI.1 – Inhibiteurs réversibles Liaisons de faible énergie entre l’enzyme et l’inhibiteur a. Inhibiteurs compétitifs - Ressemblance structurale avec le substrat - Compétition pour se fixer sur le même site enzymatique (=effet isostérique). La réaction enzymatique est bloquée, soit parce que l'inhibiteur ne possède pas le groupement chimique transformé par l'enzyme, soit parce que la position de groupement chimique sur l'inhibiteur rend impossible sa reconnaissance par le site actif.  Inhibition compétitive La vitesse maximale de la réaction reste inchangée, mais l'affinité de l'enzyme pour le substrat diminue car ce dernier ne peut pas se lier au complexe enzyme-inhibiteur. Le KM va donc augmenter avec la concentration de l’inhibiteur d’un facteur  = 1+([I]/Ki). Le nouveau KM obtenu en présence d’inhibiteur est appelé KM apparent, noté KM app. Il est possible de lever l'inhibition en saturant l'enzyme en substrat. On a donc : [I] KM app =  KM = KM 1 + Ki L’expression de la vitesse devient donc : Vmax [S] vi=  KM + [S] D’où l’équation réciproque : 1  KM 1 1 = + vi Vmax [S] Vmax Représentation de Michaelis-Menten d’une inhibition compétitive Représentation de Lineweaver-Burk d’une inhibition compétitive Détermination de la constante d’inhibition Ki KM [I] KM app = + KM Ki KM app Pente =KM /Ki KM -Ki [I] Exemple d’inhibition compétitive : Inhibition de la succinate déshydrogénase (cycle de Krebs) par le malonate. Le malonate se fixe sur la SDH par analogie avec le succinate mais ne peut être déshydrogéné. Exemples d’inhibition compétitive : Inhibition par le Méthotrexate de la dihydrofolate réductase (DHFR), enzyme impliquée dans la biosynthèse du tétrahydrofolate, coenzyme important notamment dans la biosynthèse des bases azotées (acides nucléiques). Acide dihydrofolique (dihydrofolate) Méthotrexate (anticancéreux) NADPH/H+ Dihydrofolate réductase NADP+ Tétrahydrofolate Analogie structurale substrat / inhibiteur compétitif Acide dihydrofolique = substrat Dihydrofolate réductase (DHFR) humaine Méthotrexate = inhibiteur Des antibiotiques sont aussi des inhibiteurs compétitifs Inhibiteurs de la de cette voie métabolique : dihydroptéroate synthase (DHPS) Analogues du pABA (vit B10) : pABA Sulfamethazine Acide para-amino (sulfonamides) salicylique Inhibiteurs de la Dihydrofolate réductase (DHFR) Analogue du dihydrofolate : Trimethoprime Exemples d’inhibition compétitive : Le Glyphosate (herbicide) (Roundup®) Inhibition de la 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), enzyme impliquée dans la synthèse de l’EPSP, un précurseur des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryptophane). Glyphosate Modèle structural de l’EPSPS obtenu par diffraction des rayons X S3P = shikimate-3-phosphate S3P = shikimate-3-phosphate FMT (formiate) « Analogues » du PEP GPJ = glyphosate et PO43- Exemple d’inhibition compétitive : Inhibiteurs compétitifs de l’acétylcholinestérase Inhibiteurs compétitifs de l’acétylcholinestérase (traitement de la maladie d’Alzheimer) AChE de Torpedo Galanthamine) Galanthus nivalis californica complexée à la (perce-neige) galanthamine Donépézil (Aricept ) AChE de Torpedo californica complexée Huperzine A au Donézépil (gauche) et à l ’Huperzine (droite) Huperzia serrata b. Inhibiteurs non compétitifs - L’inhibiteur se lie au complexe enzyme-substrat et à l’enzyme libre. Inhibition non compétitive ou mixte - La fixation d'un inhibiteur non compétitif diminue la vitesse maximale de la réaction, mais ne modifie pas l'affinité de l'enzyme pour le substrat, car ce dernier se lie aussi bien à l'enzyme libre qu'au complexe EI. - Une inhibition non compétitive ne peut pas être levée par une augmentation de la concentration en substrat, puisque l'inhibiteur se lie aussi bien sur l'enzyme libre que sur le complexe ES. L’inhibition se traduit par une diminution de Vmax La fixation de I sur l’enzyme ne modifie pas le KM [I] On a donc : Vmax app = Vmax /  avec  = 1+ Ki L’expression de la vitesse devient donc : Vmax [S] vi=  KM + [S] D’où l’équation réciproque : 1 KM [I] 1 1 [I] = 1+ + 1+ vi Vmax Ki [S] Vmax Ki Représentation de Michaelis-Menten d’inhibition non compétitive Représentation de Lineweaver-Burk d’une inhibition non compétitive Détermination de la constante d’inhibition Ki 1 1 1 = [I] + Vmax appVmaxKi Vmax 1/V max app Pente =1/(KiVmax) 1/Vmax [I] -Ki Exemple : Inhibition de l'anhydrase carbonique par l’acétazolamide, médicament utilisé pour le traitement du glaucome, de l’épilepsie, du mal des montagnes… Anhydrase carbonique H2O + CO2 HCO3- + H+ Acétazolamide Anhydrase carbonique complexée à l’Acétazolamide c. Inhibiteurs incompétitifs - L’inhibiteur se lie au complexe enzyme-substrat, mais pas à l’enzyme libre Inhibition incompétitive - La vitesse maximale de la réaction diminue, mais l'affinité apparente de l'enzyme pour le substrat augmente - Cette inhibition ne peut être levée en augmentant la concentration du substrat. L’inhibition est due à une diminution de la constante catalytique, elle se traduit par une diminution de KM et de Vmax d’un facteur  = 1+([I]/Ki). L’affinité apparente de l’enzyme de son substrat augmente mais la Vmax diminue. On a donc : [I] KM app = KM /  = KM/ 1 + Ki et Vmax app = Vmax /  L’expression de la vitesse devient donc : Vmax [S] vi=  K M + [S]  D’où léquation réciproque : 1 KM 1  = + vi Vmax [S] Vmax Représentation de Michaelis-Menten d’inhibition incompétitive Représentation de Lineweaver-Burk d’une inhibition incompétitive Détermination de la constante d’inhibition Ki 1 1 1 = [I] + KM app KMKi KM 1/KM app Pente =1/(KiKM) 1/KM [I] -Ki VI.2 - Inhibiteurs irréversibles et inhibiteurs suicide : - Les inhibiteurs irréversibles se fixent de manière covalente et modifient des acides-aminés indispensables à l'activité enzymatique - L'inhibiteur peut se placer sur le site catalytique de l'enzyme ou ailleurs. E + I → EI Exemple : Inhibition de la cyclooxygénase par les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) Structure de quelques AINS - L'aspirine et autres AINS comme l’ibuprofène inhibent la cyclooxygénase (PGH2 synthase), enzyme impliquée dans la biosynthèse de prostaglandines (inflammation, fièvres, douleurs…) Fixation covalente de l’aspirine sur la PGH2 synthase Réactions catalysées par la PGH2 synthase Exemple : L’orlistat (tétrahydrilipstatine) est un médicament utilisé contre l’obésité, c’est un inhibiteur de la lipase pancréatique, l’enzyme responsable de l’hydrolyse (digestion) des triglycérides alimentaires. Il agit en se fixant de manière irréversible sur une sérine du site actif de l’enzyme Orlistat Réaction catalysée par la lipase pancréatique Exemple : Les organophosphorés (insecticides et gaz de combat) sont des inhibiteurs irréversibles de l ’acétylcholinestérase (AChE). Structure de quelques inhibiteurs de l’AChE Insecticides : Chlorpyrifos Paraoxon Gaz de combat : Missile au sarin Tabun Sarin  Mode d’action des organophosphorés (OP) neurotoxiques. L’acétylcholinestérase hydrolyse l ’acétylcholine Les OPs inhibent l’acétylcholinestérase : accumulée dans l ’espace intersynaptique accumulation d’acétylcholine Fixation covalente des OPs sur l’acétylcholinestérase - L'inhibition suicide est un mécanisme où l'inhibiteur forme un complexe stable avec l'enzyme qui l'inactive de façon permanente. - L'enzyme reconnaît l'inhibiteur comme son substrat et entame le processus de modification de ce dernier. - L'inhibiteur modifié devient très réactif et se lie de façon très stable à l'enzyme. L'enzyme contribue ainsi à sa propre inactivation irréversible d'où le nom d'inhibition « suicide ».  Exemple : La pénicilline est un inhibiteur suicide de la transpeptidase intervenant dans la synthèse du peptidoglycane, composant de la paroi des bactéries. Une pénicilline : l’Amoxicilline Structure des pénicillines ➀ et céphalosporines ➁ Réaction et inhibition de la glycopeptide transpeptidase Le cycle bêta-lactame étant très labile, il réagit avec le site actif de l'enzyme. La pénicilline se fixe alors de façon très stable à l'enzyme au niveau de ce dernier. Transpeptidase de Streptomyces avec pénicilline G fixée Fixation covalente de la pénicilline sur la glycopeptide transpeptidase Remarque : de plus en plus de souches bactériennes deviennent résistantes aux pénicillines. Cette résistance est due à la production d’une β-lactamase qui hydrolyse le cycle bêta-lactame de ces antibiotiques : Afin de pallier ce problème, l ’amoxicilline est souvent associée à l’acide clavulanique, qui est un inhibiteur irréversible de la β-lactamase Acide clavulanique VI.3 - Inhibition par excès de substrat Dans certains cas, le substrat peut former des complexes du type ESS, non réactifs car le substrat n'est pas disposé correctement dans le site actif. Cela conduit à une vitesse qui passe par un maximum quand la concentration de S augmente, au lieu de tendre vers Vm. KM E + S ES E + P [E] [S] [ES] [S] KM = Ki = +S Ki [ES] [ESS] ESS Equation de conservation K [S] KM[ES] [ES] [S] [ES] 1 + M + [Et] = [E] + [ES] + [ESS] = + [ES] + = Ki [S] Ki [S] Equation de vitesse vi [ES] Vmax[ES] Vmax K [S] = vi = vi= 1 1 1+ M + [Et] KM [S] = Vmax [Et] vi Vmax [S] Ki 1+ + [S] Ki Exemple de l ’acétylcholinestérase : - sc = site catalytique (estérasique) - sfaq = site de fixation de l’ammonium quaternaire VII - Enzymes allostériques Cinétique Michaelienne : l’activité de l’enzyme est régulée par la concentration en substrat. Métabolisme : in vivo la régulation par [S] est insuffisante car il faudrait de trop grandes variations de [S] Rappel : v = Vmax [S] / (KM + [S]) - Pour avoir v = 0,1 Vmax il faut que [S] = KM /9 - Pour avoir v = 0,9 Vmax il faut que [S] = 9 x KM → Pour accroître (ou diminuer) la vitesse d’un facteur 9 il faudrait accroître (ou diminuer) [S] d’un facteur 81!! Allostérie (Monod, 1963) : changement d’activité enzymatique due à la fixation d’un ligand (ou effecteur) sur un site différent du site actif : moyen de régulation des voies métaboliques (Allostérie = Action sur ”un autre site”)  Les Enzymes catalysant des étapes clefs de voies métaboliques sont modulées par des effecteurs allostériques. Elles jouent un rôle clef dans la régulation du métabolisme. Ces effecteurs sont généralement produits au cours d’une autre réaction de cette voie Ils peuvent être des activateurs ou des rétro-inhibiteurs E1 E2 E3 E4 E5 Ex de rétro-inhibition: A → B → C → D → E → F Les courbes v vs [S] obtenues à partir d’enzymes allostériques ont souvent une allure sigmoïde (“en S”)  Les enzymes allostériques possèdent plusieurs sous-unités, elles sont oligomériques. Leurs protomères (monomères) sont arrangés de manière symétrique. Pyruvate kinase : Aspartate transcarbamoylase : 2 sous-unités identiques 2X3 sous-unités catalytiques (bleu et violet) + 3X2 sous unités régulatrices (rouge et jaune)  VII.1. Modèles a. Modèle concerté ou modèle de Monod, Wyman, Changeux (MWC) (1965) Modèle: les protéines allostériques existent sous deux états : relaxé (R) ou tendu (T), Dans ce modèle, toutes les sous-unités d’un oligomère doivent être dans le même état, L’état T prédomine en absence du substrat S, S se fixe avec plus d’affinité à R qu’à T. b. Modèle séquentiel ou modèle de Koshland, Nemethy et Filmer (KNF) (1966) La fixation du ligand peut induire un changement conformationnel au sein d’une même sous-unité Ce changement conformationnel induit le même changement au niveau d’une sous-unité adjacente, qui facilite la fixation du ligand. (notion d'ajustement induit proposé par Koshland en 1959) Modèle MWC Modèle KNF Relaxée Tendue Majoritaire en absence de substrat Majoritaire en présence de substrat VII.2. Effets allostériques On distingue les effets (ou allostéries) - homotropes = dus au substrat (ou cosubstrat) lui-même - hétérotropes = dus à un composé n’ayant aucune ressemblance structurale avec le substrat. Ces effets peuvent être positifs ou négatifs. Effet homotrope positif : activation d’une enzyme par son substrat : +S +S Forme T Forme R Forme R Forme T = tendue (faible affinité) Forme R = relaxée (forte affinité) Effet homotrope positif Ex : la pyruvate kinase, dernière enzyme de la glycolyse catalyse la réaction : phosphoénolpyruvate (PEP) + ADP → Pyruvate + ATP La fixation d’une molécule de PEP provoque un changement conformationnel qui favorise la fixation des suivantes : fixation coopérative → Courbe v = f([S]) sigmoïdale : [PEP] (mM) Système V : l’activation ou l’inhibition se traduisent par une augmentation ou une diminution du VM. K0,5 n’est pas affecté. Effets hétérotropes : - Système K : la régulation se traduit par une variation du Km, appelé généralement K0,5 dans le cas des enzymes allostériques (cinétique non Michaelienne). - un modulateur positif (activateur) abaisse le K0,5 - un modulateur négatif (inhibiteur) augmente le K0,5 - Système V (plus rare) : la régulation se traduit par une modification de la vitesse maximale Vmax (sans modifier le K0,5) - un modulateur positif (activateur) augmente la Vmax - un modulateur négatif (inhibiteur) abaisse la Vmax Exemple de Système V : l'acétyl-coenzyme A carboxylase (ACCase) est une enzyme très répandue chez les êtres vivants. Elle intervient dans la première étape de la synthèse des acides gras. + acide citrique (1er produit du cycle de Krebs) + acide palmitique (Acide gras)  Glucose (1) Malonyl-CoA ACIDES ATP GRAS Glycolyse AcétylCoA carboxylase Pyruvate (2) AcétylCoA Inhibition Activation Oxaloacétate Citrate Cycle de Inhibition Krebs Malat Isocitrate e Chaîne respiratoire ATP NADH/H+ Fumarate FADH2 -cétoglutarate Succinate Si [ATP] élevée → inhibition allostérique du cycle Succinyl-CoA de Krebs → Accumulation du citrate → Activation de l’Acetyl-coA carboxylase → synthèse d’acides gras (stockage de graisses et donc d’énergie GTP potentielle) Système K : l’activation ou l’inhibition se traduisent par un diminution ou une augmentation du K0,5. Vm n’est pas affectée. Effet hétérotrope positif : activation allostérique C = sous-unité catalytique, R = sous-unité régulatrice Effet hétérotrope positif Exemple : La pyruvate kinase, dernière enzyme de la glycolyse, est activée par le fructose 1,6-diphosphate, produit en amont dans la glycolyse (« feed-forward » activation) : Phosphoénolpyruvate (PEP) + ADP → Pyruvate + ATP + fructose 1,6-diphosphate K0,5 (PEP) (mM) La glycolyse Effet hétérotrope négatif : inhibition allostérique Exemple : La rétro-inhibition de la thréonine déhydratase par l’isoleucine.  Effet hétérotrope négatif : Ex : Le CTP est un inhibiteur allostérique de l’Aspartate transcarbamoylase (ATCase) L’ATCase catalyse la première étape de biosynthèse des pyrimidines (C, T et U). Elle est régulée par les concentrations cellulaires de pyrimidines et de purines, plus particulièrement par le CTP et l’ATP. Bases pyrimidiques C, T , U En présence de CTP 0,8 mM, l’activité de l’ATCase est inhibée, la biosynthèse des pyrimidines est ralentie. L’inhibition est réversée en présence d’ATP 0,6 mM. CTP 0,8mM + ATP 0,6mM CTP 0,8mM  Effet hétérotrope négatif : inhibition allostérique Exemple : La phosphofructokinase, troisième enzyme de la glycolyse, est inhibée de fortes concentrations d’ATP Fructose-6-phosphate + ATP → fructose-1,6diphosphate + ADP La glycolyse La phosphofructokinase est en réalité contrôlée par plusieurs paramètres, c’est le principal point de régulation de la glycolyse. VIII – Modification covalente d’enzymes Certaines enzymes peuvent être régulées via la modification covalente de certains acides aminés. Ces modifications sont réversibles, les groupements chimiques sont ajoutés ou supprimés par des enzymes différentes. Les groupements chimiques introduits sont des groupements phosphates, adénine, uridine, méthyl, et ADP. Exemple d’anénylylation de la glutamine synthase (GS)  La phosphorylation est un type de régulation très fréquent : chez les eucaryotes, entre 30 et 50% des protéines sont phosphorylées. La phosphorylation des protéines est catalysée par des enzymes appelées protéines kinases, leur déphosphorylation est catalysée par des enzymes appelées protéines phosphatases. La phosphorylation de certains acides aminés introduit un groupement chargé et encombrant qui modifie fortement les propriétés de la protéine (enzyme). Exemple : La glycogène phosphorylase (EC 2.4.1.1), une enzyme régulée par allostérie et par modification covalente : - 2 sous unités identiques (Homodimère) - Chaque sous-unité contient un site actif, un site de fixation d’un effecteur allostérique et un site de phosphorylation sur une sérine. - Réaction : phosphorolyse du glycogène Glycogène phosphorylase Régulation allostérique de la glycogène phosphorylase : ATP = inhibiteur allostérique AMP = activateur allostérique Modification covalente de la glycogène phosphorylase : L’activation de la glycogène phosphorylase est le résultat d’une cascade de réactions enzymatiques activée par une hormone hyperglycémiante : l’adrénaline ou le glucagon. (messager principal) (enzyme membranaire) (second messager)  Glycogène Régulation allostérique Glycogène IX – Autres modes de régulation de l’activité enzymatique IX-1 – La protéolyse Certaines protéines sont biosynthétisées sous forme de précurseurs inactifs appelés proenzymes ou zymogènes. Ces protéines n’acquièrent leur activité qu’après clivage spécifique d’une ou plusieurs de leurs liaisons peptidiques. Ce procédé est irréversible. - Exemple de l’insuline (hormone protéique) Exemple des protéases du tube digestif : - Enzymes protéolytiques synthétisées par le pancréas sous formes de zymogènes - Permettent l’hydrolyse des protéines alimentaires - Ex : le chymotrypsinogène, constitué d’une chaîne de 245 acides aminés comprenant 5 ponts disulfures est clivé en 3 polypeptides par la trypsine et la -chymotrypsine. IX-2 – Les isozymes Les isozymes sont des enzymes pouvant exister sous différentes formes quaternaires, différant par les proportions relatives de sous-unités catalytiques distinctes. Ex : la lactate déshydrogénase existe sous 5 différent isozymes ayant des affinités relatives différentes. Les 5 isozymes de la LDH et leur fréquence dans différents tissus : La LDH musculaire favorise la conversion du pyruvate en lactate, tandis que la LDH de cœur favorise l’oxydation du lactate en pyruvate. IX-3 – Les protéines régulatrices Protéines se fixant sur des enzymes et influençant leur activité. Ces enzymes sont constituées de sous-unités catalytiques et de sous-unités régulatrices qui suppriment l’activité de l’enzyme. La dissociation de ces sous-unités régulatrices permet l’activation des sous-unités catalytiques, ce phénomène est réversible.