Enzymologie - Cours 1ière année Médecine 2024-2025 PDF

Enzymes et coenzymes Cours 1ière année Médecine Biochimie métabolique 2024-2025 Pr Sanae Bouhsain 1 La petite fille de 2 ans ½ diagnostiquée précocement et prise en char...

Enzymes et coenzymes Cours 1ière année Médecine Biochimie métabolique 2024-2025 Pr Sanae Bouhsain 1 La petite fille de 2 ans ½ diagnostiquée précocement et prise en charge à côté de son frère de 11 ans handicapé mental Diet and recipes. In: Lyman FL, ed. Prise en charge diététique de la PCU Un succès thérapeutique indéniable Phenylketonuria. Springfield, IL: Charles C. Thomas; 1963:318.  Objectifs Définir enzymes et comprendre mécanismes d’action Décrire la cinétique des réactions enzymatiques Comprendre mécanismes de régulation des enzymes Définir les co-facteurs et les coenzymes et comprendre leur mécanisme d'action. 4  Plan 1- enzymes : Définitions, structure et propriétés 2- enzymes: Nomenclature et classification 3- Mécanisme de la réaction enzymatique 4- Cinétique enzymatique 5-Régulation des enzymes 6- Co-facteurs et co-enzymes 7- Applications cliniques 5 1- Définitions, structure et propriétés des enzymes 6  Historique Terminologie: Enzyme: Dans Levure Pasteur en 1850: fermentation de sucre en alcool par une substance présente dans levure 1929: 1ère enzyme purifiée, uréase Actuellement plus de 3000 enzymes décrites 7  Enzymes: catalyseurs biologiques protéiques – Transforment substrat en produit – Accélèrent réactions thermodynamiquement possibles (106 à 1016 fois) Existe des catalyseurs Biologiques non protéiques: – Ribozymes: ARN catalytiques (Prix Nobel 1989) Perspectives thérapeutiques: dégradation ARN du virus du SIDA – Abzymes: Anticorps catalytiques Perspectives thérapeutiques 8  Propriétés des enzymes Agissent à faible dose Retrouvées intactes en fin de réaction Douées de spécificité: – De substrat: Absolue (ex: Glucokinase) ou relative (ex: Hexokinase) – De réaction: une réaction ou groupe de réactions du même type (Oxydoréductases, Transférases,…) Soumises à régulation : activation ou inhibition 9  Structure des enzymes Entièrement protéiques: Holoprotéines= autosuffisance Protéique avec une partie non protéique: Hétéroprotéines – Partie Protéique: appelée Apoenzyme, responsable de spécificité – Partie Non protéique: appelée Cofacteur, Effectue réaction chimique Cofacteurs classés en fonction de leur nature chimique et de la force des interactions avec partie protéique: – Cofacteur Métallique: ion activateur (interaction faible), metallo-enzyme ( interaction forte) – Cofacteur Organique ou Coenzymes +++: Cosubstrat (interaction faible), groupement prosthétique ( interaction forte) 10 2- Nomenclature et Classification des enzymes 11  6 Classes d’enzymes Classe d’enzymes Exemples 1 EC1: Oxydoréductases Déshydrogénases, Hydroxylases…… 2 EC2: Transférases Kinases, Transaminases, transméthylases…. 3 EC3: Hydrolases Phosphatase, lipases, protéases… (intervention eau) 4 EC4: Lyases décarboxylases…... ( pas d’intervention d’eau) 5 EC5: Isomérases Isomérase, épimérase…… 6 EC6: Ligases, synthases synthétase Citrate synthase, Acyl-CoA synthétase Création d’un nouveau composé par condensation Synthétase: nécessite ATP 12  Dénomination internationale des enzymes Commission des Enzymes : EC Code EC suivi de 4 chiffres W.X.Y.Z. EC Système numérique de Commission des Enzymes W indique la classe enzymatique (réaction) X indique substrat “général” impliqué (sous classe) Y indique substrat spécifique ou coenzyme (sous sous classe) Z indique le numéro de série de l’enzyme 13 Exemple de dénomination internationale β-hydroxybutyrate déshydrogenase EC.1.1.1.30 Classe 1: Oxydoréductase Sous classe 1:déshydrogénase à coenzyme NAD(P)+ Sous –sous classe 1: β hydroxy butyrate N° 30 dans la liste 14 3- Mécanisme de la réaction enzymatique 15  La réaction enzymatique Fixation substrat au niveau site spécifique de l'enzyme Formation: – Complexe [Enzyme- Substrat] : ES +++ – Complexe [Enzyme- Produit]: EP – Libération Produit: P – Enzyme inchangée fin réaction: E S+E ES EP P+E Complexe ES: considérations stériques et énergétiques 16 Considérations stériques: Site actif de l’enzyme Site actif de l’enzyme: acides aminés regroupés dans zone interne essentiellement hydrophobe Entité tridimensionnelle, 2 parties : – Site de fixation du substrat: Complémentarité conformationnelle Reconnaissance et liaisons faibles non covalentes – Site catalytique: transformation substrat en produit Double spécificité: de substrat et de catalyse 17  Considérations énergétiques S+E ES EP P+E 18  Considérations énergétiques [ES]: Molécules en réaction Énergie d’activation des molécules Fragilisation liaison entre atomes: État de transition instable Transformation substrat en produit P sous forme complexe [EP] Libération produit et enzyme inchangée: E + P Constante d’équilibre de la réaction est inchangée +++ 19 4- Cinétique enzymatique 20  Définition Michaelis et Menten en 1913 Etude Variations de la vitesse des réactions: Disparition du substrat: - d[S]/dt ou Apparition du produit: + d[P]/ dt 21  Cinétique de la réaction [S ou P] mmol/L -dS Apparition de P++ dP Disparition de S t en min dt 22  Étapes d’une réaction enzymatique : 4 phases [ P]: f (t) Phase pré-stationnaire: [S]>>>[P], [ES] Phase stationnaire: [ES] constante et maximale, Effet du produit [EP] Équilibre: ES -> EP = EP -> ES 23 Phase d’une réaction enzymatique [ES]: constante, maximale 24  Phase stationnaire: vitesse initiale [ES]: constante, maximale [S] en excès [P] est faible, [EP] dissociation négligeable K1 K2 E+S ES EP K-1 25 Représentation graphique de Michealis et Menten Pour une enzyme michealienne V0 Représentation directe Vmax Hyperbole Vmax/2 2 Constantes: Vmax et KM 0 [S] Km 26  Signification de Vmax Vitesse maximale initiale: Vitesse initiale d’une réaction enzymatique pour une concentration infinie en Substrat Vmax : Asymptote branche hyperbolique V= f([S]) V0 Vmax Vmax/2 0 [S] Km 27  Signification de KM Concentration en substrat nécessaire pour avoir 50% de Vmax Si [S]= Km, V0 = moitié vitesse maximale V0 Vmax KM = [E][S]/ [ES] Vmax/2 KM Traduit affinité Substrat pour E: – Affinité inversement proportionnelle à KM 0 [S] Chaque enzyme a un KM spécifique pour un Km substrat 28  Équation et représentation de Lineweaver et Burk Pour une enzyme michealienne Détermination précise Vmax et KM ++++ : Représentation des inverses de Lineweaver et Burk 1/v = Km/vmax. 1/[S] + 1/vmax 29  Dosage des enzymes Impossibilité de déterminer concentration massique: – hétérogénéités structurale d’une même enzyme – Intervention de catalyseurs… Détermination activité enzymatique AE AE = Vitesse réaction x volume réactionnel 30  Détermination de l’activité enzymatique AE = Vitesse de la réaction x volume réactionnel Mesure spectrophotométrique : V= - d[S]/dt Application de la loi de Beer-Lambert: proportionnalité entre absorbance et concentration du composé absorbant: Absorbance = ԑ. L. [S] V= - d [Absorbance] / ԑ. L. dt Unités de l’activité enzymatique: – Unité d’enzyme (U): transformation d’1 μmole de S / min la plus utilisée en clinique – Katal : transformation d’1 mole de S / sec 31 5- Régulation des enzymes 32  Objectifs et mécanismes de la régulation Objectifs : – Maintien de l’homéostasie métabolique – Ajustement réactions métaboliques aux situations physiopathologiques: Jeûne, Période alimentaire, Stress , Effort musculaire… Principaux mécanismes : – Effecteurs physiques – Activateurs et Inhibiteurs compétitifs et non compétitifs – Allostérie – Modification de l’enzyme par un mécanisme de phosphorylation et déphosphorylation 33  Effecteurs physiques Température 2 effets opposés: Effet activateur et Thermodénaturation Courbe vitesse en fonction température: Courbe en cloche Température optimale caractéristique 2.0 Enzymatic activity 1.5 1.0 0.5 10 20 30 40 50 60 Temp. (C) 34  pH Charges électriques des acides aminés Modifie charge électrique des radicaux des acides aminés du site actif 100 NH3+ COO- NH3+ 50 COO- Modification structure secondaire ou tertiaire de l’enzyme COOH NH2 Courbe biphasique 4 7 10 pH pH optimum = 7 majorité enzymes – Pepsine du suc gastrique :1.8 – Cholinestérase : 10 35  Force ionique Modification force ionique du milieu Sels monovalents (NaCl, Kcl…) Neutralisation totale ou partielle des charges opposées de résidus ionisables de l’enzyme Modification activité enzymatique: activation ou inhibition 36  Effecteurs chimiques Les activateurs: stimulent activité enzymatique – Activateurs métalliques: ions métalliques – Activateurs organiques: Coenzymes, souvent origine vitam Les inhibiteurs: inhibent activité enzymatique – Inhibiteurs irréversibles: liaison covalente avec E, blocage site actif – Inhibiteurs réversibles: liaison non covalente avec E Inhibiteurs compétitifs Inhibiteurs non compétitifs Inhibiteurs incompétitifs: rares 37  Inhibiteur compétitif Compétition I avec substrat pour site actif Complexes: [ES] et [EI] Affinité enzyme substrat : KM VM n’est pas modifiée – Représentation des inverses: droites se coupent sur axe des Y à la valeur -1/ VM Inhibition levée si excès substrat +++ 38  Inhibiteur non compétitif I Se fixe sur autre site de E 3 complexes:[ES],[EI],[ESI] KM : constante – Représentation des inverses: droites se coupent sur axe des X à la valeur -1/ KM VM diminue Inhibition non levée si excès substrat 39  5- Régulation des enzymes - Effecteurs physiques: pH, T, Force ionique - Effecteurs chimiques: Inhibiteurs compétitifs et non compétitifs - Allostérique - Phosphorylation et déphosphorylation 40  Régulation allostérique Mécanisme qui intervient sur des enzymes non michaeliennes: allostériques « allos »=autre, « stérique »= forme Régulation implique une modification de l’activité de l’enzyme suite à un changement de sa conformation spatiale 41  Définition des enzymes allostériques Organisation oligomérique: n sous unités (nombre pair) Structure généralement quaternaire: 4 sous unités Chaque sous unité possède propre site fixation du substrat Enzymes très actives aux fortes concentrations en substrat à la différence des enzymes Michaeliennes Coopérativité de fixation des molécules de substrat: fixation d’une molécule favorise fixation de la suivante Chaque sous unité possède propre site fixation effecteur 42  Cinétique des Enzymes allostériques Équation de Michaelis menten modifiée: [Sn] et non [S] n: nombre sous unités n Vmax [S] Vo  Km  [S] n Cinétique sigmoïdale non hyperbolique – Enzymes agissent uniquement si forte [S] – Augmentation [S] nécessaire pour obtenir 50% de Vmax – Vmax non modifiée 43  Mécanisme de la régulation allostérique Conformations de l’enzyme: – Conformation Tendue (T) de faible affinité pour substrat – Conformation Relachée (R) de forte affinité pour substrat Forme T Forme R Fixation effecteur allostérique sur site différent du substrat: – Fixation Activateur (effecteur positif) : passage forme T à R – Fixation Inhibiteur (effecteur négatif ): passage R à T 44  Conséquences de la régulation allostérique Fixation activateur : – Enzyme active en présence faible concentration substrat – Fait tendre courbe vers courbe hyperbolique michaelienne Fixation inhibiteur – Fait tendre courbe vers allure sigmoïdale – Si inhibiteur est le produit final = effet feed back ++++ 45  Phosphorylation/déphosphorylation Régulation covalente Phosphorylation par protéine kinase – Estérification par ATP de groupes hydroxyles des résidus d’acides aminés constituant l’enzyme (résidus Sérine et ATP ADP Thréonine) Mg2+ – Fait intervenir Mg2+ phosphorylation protein – Enzyme sous forme Phosphorylée kinase – Mécanisme hormonodépendant: Glucagon E-OH E-O-PO3H2 – Activation ou inhibition enzyme phosphatase Déphosphorylation par phosphatase dephosphorylation – Hydrolyse liaison ester phosphate – Libération phosphate inorganique Pi H2O – Enzyme sous forme déphosphorylé – Mécanisme hormonodépendant: Insuline – Activation ou inhibition enzyme 46 6- Coenzymes 47  A- Définitions Molécules non protéiques permettant à des réactions enzymatiques de se réaliser Majorité ont une origine vitaminique Caractéristiques: – Agissent à faible concentration(comme enzymes) – Régénérés à la fin réaction (comme enzymes) – Faible masse moléculaire (différence enzymes) – Thermostables ( différence enzymes) 48  B- Types de Coenzymes Cosubstrat: Coenzyme libre – S’associe au moment de la catalyse à la partie protéique de l’enzyme ‘’apoenzyme’’ (E) – Complexe fonctionnel apoenzyme-coenzyme – Cosubstrat modifié se détache – Retrouve son état initial grâce à une deuxième réaction mettant en jeu une autre enzyme Groupement prosthétique: associé à l’enzyme par liaison forte ( il fait partie de l’enzyme) – Retrouve son état initial en restant lié à l’apoenzyme 49  C- Classification des coenzymes D’oxydoréduction: transfert protons et électrons NAD/NADH,H+ et NADP/NADPH,H+ FAD/FADH2 et FMN/FMNH2 CoQ/CoQH2 Metalloporphyrines : cytochromes, peroxydases, catalases, …. Protéines Fer-Soufre De transfert de groupement Transfert radicaux monocarbonés: – Biotine, Acide folique, S-adénosyl-métionine (SAM) Transfert radicaux à 2 ou plusieurs carbones: – Thiamine pyrophosphate (TPP), Acide lipoïque, Coenzyme-A (CoA) Transfert autres radicaux : – Groupement phosphate: Nucléosides triphosphates (ATP, CTP, GTP, TTP) – groupement NH2: Phosphate de pyridoxal (PP) 50  Coenzymes d’oxydoréduction Nature Partie réactive Pic d’absorption Coenzyme Et origine Formes réduites vitaminique Co-substrat NAD/NADP Dérive de la Vit B3 Noyau 340 nm ( Nicotinamide ) nicotinamide Groupement FAD/FMN prosthétique Noyau Flavine 450nm Dérive Vit B2 ( Riboflavine ) Co-substrat Noyau Coenzyme Q Pas d’origine ubiquinone 270 nm vitaminique TetraHydrobioptérine Co-Substrat Noyau ptéridine Pas d’origine - BH4 ou THB vitaminique 51  Coenzymes de transfert de groupement Coenzyme Nature Groupement Exemple enzyme Et origine vitaminique transféré Groupement prosthétique Coenzyme A Dérive de vitamine B5 Acétyls et Acyls Complexe Pyruvate (CoA-SH) ( acide pantothénique) déshydrogénase ( cycle de Krebs) Nucléosides Groupement prosthétique Phosphates Hexokinase triphosphate Pas d’origine vitaminique ( métabolisme du (ATP, GTP et UTP) glucose et des acides gras) Thiamine Groupement prosthétique Décarboxylation Complexe pyruvate pyrophosphate (TPP) Dérive vitamine B1 α céto-acides déshydrogénase ( Thiamine) ( cycle de Krebs) Complexe Pyruvate Acide lipoïque Groupement prosthétique Acyls déshydrogénase Pas d’origine vitaminique ( cycle de Krrebs) 52  Coenzymes de transfert de groupement (2) Coenzyme Nature Groupement Exemple Enzyme Et origine vitaminique transféré Biotine Groupement prosthétique, Monocarboné : CO2 Pyruvate carboxylase Dérive de Vit B8 ( métabolisme du glucose, acides gras) S-adénosyl- Groupement prosthétique Méthyl Méthyl transférases méthionine Pas d’origine vitaminique (Synthèse acides nucléiques) Groupement prosthétique, Méthyl ou Formyl Méthyl transférases Folates (Métabolisme des bases puriques Dérive de Vit B9 et pyrimidiques et des AA) Cobalamines Groupement prosthétique Méthyl Méthyl transférases Dérive de vitamine B12 (Métabolisme AA) Phosphate de Groupement prosthétique NH2 Transaminases pyridoxal (PLP) Dérive de vitamine B6 CO2 Décarboxylases ( pyridoxine) (Métabolisme des AA) 53 7- Applications cliniques 54 Exemple de maladie par déficit enzymatique Déficit en phenylalanine hydroxylase  Exemple de maladies par déficit en Coenzymes Béribéri ( déficit Vit B1): – Insuffisance cardiaque et troubles neurologiques Pellagre ( déficit Vit B3): : – Dermatite, diarrhée, démence Anémies mégaloblastiques (déficit Vit B9) Anémies pernicieuses ( déficit Vit B12) FIN 57