Curs Enzimologie PDF

CURS 1:Enzimologie Generalități Studiul proceselor enzimatice ce stau la baza transformărilor metabolice a făcut posibilă înțelegerea acestor transformări, a mecanismelor lor de reglare precum și diagnosticul, profilaxia și tratamentul bolilor ereditare și a altor afecțiuni patologice....

CURS 1:Enzimologie Generalități Studiul proceselor enzimatice ce stau la baza transformărilor metabolice a făcut posibilă înțelegerea acestor transformări, a mecanismelor lor de reglare precum și diagnosticul, profilaxia și tratamentul bolilor ereditare și a altor afecțiuni patologice. Aceleași studii asupra enzimelor au contribuit și la marile descoperiri în domeniul acizilor nucleici și al biosintezei proteinelor. Def.: Partea integrantă a biochimiei, enzimologia, se ocupă cu studiul răspândirii și localizări enzimelor în organismele vii, a structurii lor chimice, a cineticii reacțiilor enzimatice, a mecanismelor de acțiune și reglării activității enzimelor precum și a utilizării lor practice. Primele date științifice care au condus mai târziu la definirea noțiunii de enzimă au apărut în 1833 când 2 cercetători au obținut un principiu activ din germenii de orz capabil să hidrolizeze amidonul. Prin precipitare cu etanol, cei doi cercetători reușesc să purifice acest principiu sub forma unei pulberi pe care o numesc diastază. În perioada 1834-1837, Berzelius elaborează conceptul de cataliză chimică și sugerează faptul că diferite procese biologice cum ar fi digestia și fermentația pot fi realizate de o serie de catalizatori specifici lumii vii, diferiți de catalizatorii chimici. În perioada imediat următoare, această teorie prin descoperirea pepsinei gastrice, a emulsinei din migdale, a invertazei/zaharază din drojdii, a lipazei și tripsinei pancreatice. Pentru toate aceste substanțe s-a propus în 1877 denumirea de enzimă în aceeași perioadă, utilizându-se și termenul de ferment însă termenul de enzimă a fost acceptat de majoritatea biochimiștilor. Prima enzima purificata sub forma cristalina a fost ureaza, obținută in 1926 din soia, când i se demonstrează și structura sa proteica. A urmat apoi o perioada de intense cercetări când au fost purificate, cristalizate si studiate zeci de enzime din cele mai diverse surse biologice in paralel cu studiul cineticii reacțiilor enzimatice care a culminat cu cercetările lui Michaelis si Menten care au pus bazele matematice ale interpretării reacțiilor enzimatice. 1  Astăzi sunt cunoscute câteva zeci de mii de enzime iar enzimologia devine ramura cea mai importanta a biochimiei deoarece toate transformările metabolice care au loc in organismele vii sunt procese catalizate enzimatic. Mai mult de atât, o serie de transformări realizate in vitro sunt procese enzimatice. In ultimul timp, observându-se o utilizare din ce in ce mai mare a enzimelor in cele mai diverse domenii ale activității umane. Organizarea intracelulara a enzimelor Enzimele sunt compuși biologic activi întâlniți in toate organismele vii unde reacțiile catalizate de către acestea alcătuiesc metabolismul substanțelor si energiei care asigura creșterea si dezvoltarea viețuitoarelor. Dpdv al localizării in organismele vii enzimele se împart in 2 categorii: a) enzime solubilizate in lichidele biologice; b) enzime fixate pe membranele biologice; a) ENZIMELE SOLUBILE se găsesc sub forma solubila in mediile apoase intracelulare, in lichidul interstițial, plasma sanguina, urina, lichidul cerebrospinal, limfa, etc. b) ENZIMELE MEMBRANARE reprezintă cantitativ cea mai importanta categorie de enzime, acestea sunt fixate pe/in diferite membrane biologice făcând parte integranta din structura acestora. Din aceasta cauza ele nu pot fi extrase prin solubilizare directa in apa sau in diferite soluții tampon. Pentru obținerea enzimelor membranare este nevoie mai întâi de o omogenizare a țesutului pentru dezintegrarea membranelor celulare, separarea diferitelor fracțiuni membranare, dezintegrarea membranelor prin tratarea cu ultrasunete prin tratare cu detergenți etc si precipitare fracționată a enzimelor. La rândul lor, enzimele membranare se împart in mai multe grupe in funcție de tipul membranei. La nivel celular exista enzime atât solubile, cat si membranele care se întâlnesc in doua sau mai multe organite subcelulare, precum si enzime specifice unui singur organit. Acestea din urma reprezintă enzime marker pentru organitul subcelular in care se găsesc. Localizarea intracelulara a enzimelor este direct dependenta de secvențele si căile metabolice ce se desfășoară in fiecare compartiment celular in parte: 2 1. Enzime nucleare – Compoziția in enzime a nucleelor este data de funcțiile lor biologice. Fracțiunile înalt purificate de nuclee conțin aproximativ 1% din activitatea enzimatica totala a omogenatului tisular inițial in ceea ce privește: succinat-dehidrogenaza, citocrom-oxidaza, uricaza, glucozo-6-fosfataza si glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza. In cadrul enzimelor nucleara, enzimele marker/indicator pentru nuclee sunt: nicotinamid- mononucleotid-adenil-transferaza si ARN-polimeraza-ADN-dependenta se găsesc doar la nivelul nucleului. 2. Enzimele lizozomale Lizozomii conțin aproximativ 60 de enzime si anume oxido-reductaze, esteraze, endo- si exo- glicozidaze, endo- si exo- peptidaze etc. Enzima specifica, cea mai răspândita, lizozomilor este fosfataza acida, deși aceasta este prezenta si in alte particule subcelulare, precum si in citosol. S-a observat ca beta-glicero-fosfatul (substratul caracteristic) este hidrolizat foarte rapid sub acțiunea enzimei lizozomale si mult mai lent decât celelalte fosfataze acide. În lizozomi se mai găsesc o serie de endo-proteinaze tisulare, dintre care cele mai importante sunt catepsinele G, B, H, L. Rolul acestora consta in degradarea hidrolitica a proteinelor constituitive in cadrul procesului complex a reînnoirii materialului celular. 3. Enzime mitocondriale Dat fiind faptul ca mitocondriile reprezintă sediul metabolismului oxidativ, aceste organite sunt foarte bogate in enzime. Pe de alta parte, structura lor complexa si specializarea înaltă explică existenta enzimelor tipice pentru membrana externa, spațiul intermembranar, membrana interna si matricea mitocondriala. →Membrana externă-enzime tipice conține: mono-amin-oxidaze; chinurenin-hidroxilaza; tio-kinazele acizilor grași; →Spațiul intermembranar adenilat-kinaza; 3  nucleozid-difosfo-kinaza; creatin-kinaza; →Membrana internă enzimele catenei respiratorii; enzime implicate in biosinteza de ATP-diferite de hidrogenaze si translocaze/transportori; →Matricea mitocondrială citrat-sintaza; aconitaza; izocitrat dehidrogenaza; fumaraza; 4. Enzime peroxizomale -peroxizomii sunt bogați in peroxidaze, catalaze precum si enzimele implicate in reacții cuplate cu acestea. 5. Enzime microzomale -enzima tipica pentru microzom: citocrom-C-oxidaza, microzomii mai conținând diferite alte oxigenaze si hidroxilaze. 6. Enzimele din citosol -se găsesc sub forma solubila numeroase enzime implicate in metabolismul majorității biomoleculelor. Cele mai importante sunt enzimele implicate in activarea si degradarea acizilor grași, apoi in biosinteza acizilor grași, enzimele activării si transportului ARN-ului de transfer, aminoacil-ARNt-sintetazele, enzimele secvenței glicolitice si ale ciclului pentozo fosfaților, enzimele implicate in biosinteza glutationului, unele dehidrogenaze. CURS 2. Nomenclatura si clasificarea enzimelor Clasificarea enzimelor Cea mai simpla reacție enzimatica poate fi reprezentata prin schema: 4 E+S  ES → P+E E – enzima; S - substanța asupra căreia reacționează E pentru a o modifica si care se numește substrat; ES - complexul super reactiv dintre enzima si substratul sau; P - produsul reacției enzimatice; Enzimele se clasifica in funcție de mai multe criterii cum ar fi: Structura lor chimica; Tipul de reacție pe care o catalizează; Se împart in 6 clase, fiecare clasa împărțindu-se la rândul sau in subclase si subsubclase 1. Oxidoreductaze – care reprezintă enzime ce catalizează reacțiile de oxidare si reducere biologica 2. Transferaze – sunt enzime ce catalizează reacții de transfer a unor atomi sau grupe atomi de la un substrat la altul fără ca aceste grupări sa existe libere in timpul procesului; 3. Hidrolaze – sunt enzime ce catalizează scindarea hidrolitica a diferitelor legături covalente C-C sau C-heteroatom din molecula substratului; 4. Liaze – sunt enzime ce catalizează reacții de eliminare sau de adiție a unor atomi sau grupe de atomi ce pot fi si grupe funcționale fără participarea apei; 5. Izomeraze – sunt enzime ce catalizează diferite reacții de izomerizare a substratelor; 6. Ligaze/Sintetaze – enzime ce catalizează reacții de formare a unor noi legături covalente C-C sau C-heteroatom, fiind implicate cu precădere in căile de biosinteza, aceste reacții fiind cuplate de obicei cu reacții de clivare a moleculelor de ATP in vederea procurării de energie; Împărțirea in subclase si subsubclase se face pe baza altor criterii specifice fiecărei clase in parte, de ex. Oxidoreductazele se împart in subclase astfel: scls 1.1 cuprinde enzime ce acționează asupra grupărilor de tipul -CH2-OH ale donorilor; scls 1.2 cuprinde enzime ce acționează asupra grupărilor de tip carbonil ale donorilor; 5  scls 1.3 cuprinde enzime ce acționează asupra grupărilor >CH-CH- ale donorilor; scls 1.4 cuprinde enzime ce acționează asupra grupărilor >CH-NH2 ale donorilor; scls 1.5 cuprinde enzime ce acționează asupra grupărilor >CH-NH- ale donorilor; șamd Fiecare subclasa se împarte in subsubclase ca de exemplu subclasa 1.1 a oxidoreductazelor cuprinde subsubclasele: *1.1.1 – enzime cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor; *1.1.2 – enzime cu un citocrom drept acceptor; *1.1.3 – enzime cu O2 drept acceptor... 1.1.99 – enzime cu alți acceptori; In fiecare subsubclasa enzimele sunt aranjate in ordinea cronologica a descoperirii lor. Odată cu creșterea impresionanta a numărului de enzime cunoscute s-a ivit necesitatea unei nomenclaturi sistemice științifice a acestora. De aceea, comisia de enzimologie a stabilit ca denumirea științifică a enzimelor sa cuprindă doua părți: Prima parte – denumirea substratului/produsului A doua parte – arata natura reacției catalizate la care se adaugă sufixul -aza si codul numeric EX: catalaza are denumirea sistemica științifică: peroxid de hidrogen H2O2: oxidoreductaza , EC 1.11.1.6; 6  dihidro-orotaza – are denumirea sistemica de tipul L-5,6-dihidroorotat-amino- hidrolaza EC 3.5.2.3; aldolaza – denumirea științifică de tipul D-fructozo-1,6-difosfat-D- gliceraldehid-3-fosfat-liaza EC 4.1.2.13; Nomenclatura precursori Exista multe enzime care se sintetizează in organismele vii sub forma unor precursori inactivi dpdv catalitic. Atunci când necesitățile organismului o cer, acești precursori inactivi suferă o serie de transformări enzimatice, de cele mai multe ori de natura hidrolitica trecând in enzime active. Nomenclatura precursorilor enzimatici activi se face prin adăugarea prefixului pro- sau a sufixului -ogen la numele enzimei corespunzătoare. EX: Tripsinogen ,prorenina ,proprombina ,pepsinogen etc. CARACTERIZAREA CLASELOR DE ENZIME I. Caracterizarea clasei oxidoreductazelor Oxidoreductazele sunt enzime implicate in procesele de oxidare biologica conform reacției oxidare A A+ + e- reducere Cum electronii cedați nu sunt abandonați in mediu ci sunt acceptați de un alt substrat care se reduce, enzima acționează in mod obligatoriu asupra a doua substrate: Ared Aox + e- Box + e- Bred Ared + Box Aox + Bred Substratul care se oxidează este considerat donorul de electroni iar cel ce se reduce este acceptor de e-. 7  O enzima importanta din aceasta clasa este lactat-dehidrogenaza cu denumirea sistemica L-lactat: NAD+ oxidoreductaza EC 1.1.1.27. Ea catalizează reacția de conversia a acidului lactic in cel piruvic. Aceasta reacție este implicata in fermentațiile lactice precum si in procesul anaerob de degradare al glucidelor prin glicoliza. Determinarea activității aceste enzime in sânge este utilizata in practica medicala pentru diagnosticul infarctului de miocard, a hepatitei virale, a anemiei pernicioase, etc. Un alt reprezentat al acestei clase este alcool-dehidrogenaza (alcool: NAD+ oxidoreductaza). Si in aceasta reacție, NAD+ este acceptorul de protoni H, deci unul dintre substrate dar este si coenzima (vezi coenzime) Alcool-DH joaca un rol important in procesele de fermentație alcoolică când se formează etanol. Aceasta înseamnă ca echilibrul reacției catalizate de enzima din drojdii este deplasat puternic spre stânga in timp ce in cadrul enzimei hepatice echilibrul este deplasat in sensul oxidării etanolului. In practica medicala, aceasta enzima se utilizează la dozarea extrem de exacta a alcoolului etilic in sânge si urina. In metabolismul glucidic acționează enzima numita gliceraldehid-fosfat-dehidrogenaza a cărei denumire sistemica este D-gliceraldehid-3-fosfat: NAD+ oxidoreductaza fosforilantă EC 1.2.1.12; Acțiunea aceste enzime este extrem de complexa deoarece înafară de implicarea sa in procesul redox propriu zis are si o acțiune secundara de fosforilare a substratului conform reacției. 8 Subclasa 1.15 a oxidoreductazelor cuprinde enzima numita superoxid-dismutaza SOD 1.15.1.1 care catalizează reacții de dismutație a radicalilor superoxidici O-2 + O-2 + 2H+ O2 + H2O2 SOD Aceasta enzima este o metaloproteina cunoscuta si sub denumirile de eritro-cupreină, hemo- cupreină sau cito-cupreină. Reacțiile enzimatice catalizate de oxidoreductaze care poseda in calitate de coenzima NAD+ sau NADP+ sunt de obicei reacții reversibile si sunt conjugate cu alte reacții de regenerare a coenzimei; In prima reacție, coenzima care are rol si de cosubstrat se reduce, iar in reacția conjugata se regenerează forma oxidata a coenzimei. Aceste reacții conjugate prezinta o deosebita importanta pentru procesele redox ce au loc in celulele vii deoarece permit refacerea continua a acceptorilor de hidrogen(H) 9  II. Caracterizarea clasei transferazelor In reacțiile catalizate de transferaze, o grupa de atomi R ce poate fi si grupare funcțională este detașată din molecula unui substrat AR si este fixata pe molecula celui de-al doilea substrat notat B A-R + B A + B-R transferaza Transferazele sunt enzime ce catalizează reacții de transfer ale unor grupe de atomi de la un compus, substrat numit donor la altul numit acceptor, iar denumirea sistemica a acestora este de tipul donor: acceptor-transferaza incluzându-se si denumirea grupei transferate. O problema speciala o prezinta reacția de transaminare care implica transferul unei grupe amino de la un alfa-AA pe molecula unui alfa-cetoacid cu formarea unui nou AA si a unui nou cetoacid. Transaminarea reprezintă o etapa importanta a căilor metabolice de degradarea a AA. Fiecărui AA in parte ii corespunde o aminotransferază specifica. Dpdv medical, mai importante sunt doua transaminaze: →aspartat-aminotransferaza (L-aspartat:alfa-cetoglutarat-aminotransferaza EC 2.6.1.1) →alanin aminotransferaza →L-alanin: alfa-cetoglutarat – aminotransferaza EC2.6.1.2 10  Determinarea activității acestor enzime in sânge este extrem de utila pentru diagnosticul hepatitelor al leziunilor hepatice toxice, cirozelor, infarctului de miocard etc. In metabolismul glucidic, este implicata o transferaza importanta numita transcetolaza cu denumirea sistemica D-sedoheptulozo-7-fosfat: D-gliceraldehid-3-fosfat- glicolaldehidtransferaza EC 2.2.1.1 ce catalizează reacția dintre sedoheptulozo-7-fosfat si gliceraldehid-3-fosfat cu formarea a doua pentoze si anume ribozo-5-fosfat si xilulozo-5- fosfat. III. Caracterizarea clasei hidrolazelor Hidrolazele sunt enzime ce catalizează reacții de scindare a substratelor cu formarea unor compuși mai simpli si cu participarea elementelor apei. In aceste reacții are loc ruperea unor legături covalente de tipul C-C, C-O, C-N din structura substratului in prezenta apei A-R + H2O A-OH + R-H hidrolaze 11  O serie de hidrolaze catalizează nu numai scindarea hidrolitica a unui substrat ci si transferul grupelor clivate la o molecula acceptor Așa se întâmpla, de ex, in cazul hidrolazelor ce acționează asupra legăturii esterice, glicozidice, peptidice, amidice, etc. In funcție de natura legăturii scindate hidrolazele se împart in 11 subclase. Dintre acestea prima subclasa(3.1) cuprinde enzime care poarta denumirea generica de esteraze deoarece acționează asupra diferitelor tipuri de esteri: *3.1.1 – cuprinde enzime care acționează asupra esterilor – COOH *3.1.2 - cuprinde enzime care acționează asupra tio-esterilor; *3.1.3 - cuprinde enzime care acționează asupra monoesterilor acidului fosforic *3.1.4 - cuprinde enzime care acționează asupra diesterilor acidului fosforic...etc O hidrolaza foarte bine studiata este esteraza lipaza cu denumirea sistemica triacilglicerol-acil hidrolaza EC 3.1.1.3 Principala particularitate a acestei enzime este aceea ca ea acționează asupra unor substrate emulsionate, viteza inițială de reacție fiind in funcție de numărul de molecule enzimatice absorbite la interfaza. Determinarea activității lipazei sanguine se utilizează in practica medicala pentru diagnosticul pancreatitelor cronice sau a cancerului de pancreas. Principala aplicație industriala a lipazei o constituie fabricarea biodetergenților. In metabolismelor fosfoesterilor diferitelor biomolecule sunt implicate doua esteraze numite fosfataze: a) orto fosfat: monoester fosfohidrolaza cu pH optim alcalin EC 3.1.3.1 b) orto fosfat: monoester fosfohidrolaza cu pH optim acid EC 3.1.3.2 12  Se mai folosesc denumirile uzuale de fosfomonoesteraza alcalină, respectiv acida. Aceste enzime catalizează hidroliza a numeroși esteri fosforici, ai majorității biomoleculelor ce conțin grupări alcoolice fosforilate. In practica medicala se determina activitatea fosfatazei alcaline in sânge pentru diagnosticul litiazelor canalelor coledoc sau a icterului prehepatic, si post hepatic. Activitatea fosfatazei acide serice se determina pentru diagnosticul maladiilor prostatei. O subclasa importanta a hidrolazelor o constituie subclasa 3.4 ce conține enzimele care acționează asupra legăturii peptidice si care poarta denumirea generica de peptid- hidrolaze sau peptidaze = −C−N− H Nomenclatura si clasificarea acestora se face foarte dificil întrucât ele catalizează in esență același tip de reacție. Cu toate acestea, peptidazele se împart in 5 subclase astfel: *3.4.1 – peptidaze ce scindează/hidrolizează un rest de AA de la capătul N-terminal; *3.4.2 – peptidaze ce scindează un rest de AA de la capătul C-terminal; *3.4.3 – peptidaze care acționează asupra dipeptidelor; *3.4.4 – enzime care scindează unități dipeptidice de la capătul N-terminal; *3.4.5 – enzime care scindează unități dipeptidice de la capătul C-terminal; 13  Proteinazele/enzimele proteolitice acționează asupra proteinelor native. Din clasa hidrolazelor mai face parte o grupa importantă de enzime cunoscute sub denumirea de fosfolipaze sau fosfatidaze si sunt implicate in catabolismul glicerofosfolipidelor si in special al lecitinelor. Astăzi sunt cunoscute 4 fosfolipaze notate cu A, B, C, D ce se deosebesc intre ele prin mecanismul de acțiune. → fosfolipaza A se întâlnește in veninul de cobra, pancreas, timus, prostata, glande salivare, splina. Ea acționează asupra fosfatidin colinelor scindând restul de acid gras din poziția alfa cu formare de lizo-lecitine. →fosfolipaza B se găsește in microorganisme, ficat si pancreas; scindează ambele resturi de acid gras cu formare de glicerol-fosforil-colina. →fosfolipaza C se întâlnește in creier, dar si in rinichi si scindează restul de fosfocolina, formând alfa, beta diacil-glicerol →fosfolipaza D se găsește numai in plante si clivează restul de colina cu formare de acid L- alfa-fosfatidic Din aceeași clasa a hidrolazelor fac parte si enzimele colinesteraza, respectiv acetilcolinesteraza a căror acțiune este strâns legata de transmiterea impulsului nervos. Acetilcolinesteraza scindează hidrolitic acetilcolina la nivelul sinapselor, iar colinesteraza eritrocitară hidrolizează esterii colinici cu diferiți acizi 14  Amilazele sunt hidrolaze implicate in catabolismul polizaharidelor. Ele scindează legăturile alfa-1,4-glicozidice din alfa glicanii de tipul amidonului si glicogenului. In funcție de modul de acțiune, amilazele sunt de 3 tipuri: alfa, beta, gama. →α-amilaza →hidrolizează legăturile α-1,4 glicozidice cu formare de oligozaharide si o cantitate mica de maltoza. Este o endoamilază. →β-amilaza→hidrolizează legăturile β-1,4-glicozidice eliberând resturi de maltoza de la capătul nereducător al lanțului poliglucidic. Este tot e endoamilază. →γ-amilaza/glicoamilaza→scindează succesiv resturi de glucoza de la capătul nereducător al lanțului poliglucidic. Este o exoamilază. IV. Caracterizarea clasei liazelor. Liazele catalizează reacții in care se rup legături covalente C-C, C-heteroatom fără participarea apei. Urmează o rearanjare interna a valentelor ramase disponibile in urma scindării. Denumirea sistemica a acestor enzime se face adăugând la numele substratului termenul liaza. In cazul unor reacții importând dpdv metabolic se admit si denumirile de aldolaza, decarboxilaza, dehidrataza, etc. Atunci când reacția inversa este mai importanta sau atunci când numai aceasta a fost demonstrata poate fi folosita si denumirea de sintaza dar nu sintetaza. O enzima bine studiata din aceasta clasa este aspartaza sau L-aspartat: amoniac liaza EC 4.3.1.1 15  Din aceeași clasa face parte si citratsintaza, enzima ce catalizează prima reacție a ciclului Krebs ce consta in condensarea acetil coenzimei A cu acidul oxalil-acetic cu formare de acid citric. O alta enzima importanta din clasa liazelor este aldolaza. Ea catalizează o reacție importanta din calea de degradare anaeroba a glucozei (glicoliza) si anume reacția de scindare a fructozo-1,6-difosfatului cu formarea a doua trioze fosforilate. V. Caracterizarea clasei izomerazelor Aceasta clasa reunește enzimele ce catalizează reacții in urma cărora au loc rearanjări interne in molecula substratului soldate cu modificări geometrice sau structurale deci de reacții de izomerizare. 16  In funcție de tipul reacției de izomerizare pe care le catalizează aceste enzime pot fi racemaze, epimeraze, tautomeraze, cis-trans-izomeraze, mutaze, cicloizomeraze etc. O enzima ce catalizeaza conversia unui izomer geometric este maleat-cis-trans-izomeraza EC 5.2.1.1 In metabolismul glucidelor este implicata enzima triozo-fosfat-izomeraza EC 5.3.1.1 O izomeraza importanta ce participa la degradarea glucozei prin glicoliza este glucozo-fosfat-izomeraza numita si fosfo-gluco-mutaza. Ea catalizeaza conversia glucozo-1- fosfat in glucozo-6-fosfat, aceasta reacție fiind însă ceva mai complexa si realizându-se in doua etape, enzima putând exista atât sub forma fosforilată, cat si defosforilată. 17  VI. Caracterizarea clasei ligazelor Ligazele/sintetazele caracterizează reacții bimoleculare in care se stabilește o noua legătură covalenta C-C sau C heteroatom cuplate cu reacția de hidroliza a ATP-ului. Pentru clasa ligazelor este utilizat si termenul generic de sintetaze deoarece aceste enzime sunt implicate cu precădere in căile de biosinteza. Atunci când unul din cele doua substrate este CO2, se recomanda utilizarea denumirii carboxilaza. Carboxilazele alcătuiesc subclasa 6.4 si catalizeaza reacția de formare a unei noi legături C-C pe seama CO2. De exemplu, enzima acetil-CoA: dioxid de carbon ligaza numita si acetil-CoA- carboxilaza catalizeaza conversia acetil-CoA in malonil-CoA 18  Din aceeași clasa a ligazelor face parte o grupa de enzime numite acil-CoA-sintetaze care catalizeaza reacția de activarea a acizilor grași prin formarea unor legături macroergice intre radicalul acil si gruparea tiolică a coenzimei A Dintre aceste enzime acetil CoA sintetaza joaca un rol aparte deoarece generează continu acetil CoA. Foarte multe ligaze sunt implicate sin in metabolismul AA. De ex conversia acidului aspartic in amida sa se realizează prin aminarea reductiva a acidului aspartic sub acțiunea asparagin-sintetazei. La nivelul mitocondriilor din hepatocite are loc conversia acidului piruvic in acid oxalil-acetic sub acțiunea altei ligaze importante numita piruvat-carboxilaza. 19  Exprimarea activității enzimelor Activitatea enzimatica se definește ca fiind viteza cu care este modificat substratul sub efectul catalitic al enzimelor. Viteza reacțiilor enzimatice se evaluează într-o mare varietate de moduri in funcție de natura chimica a substratului si produsului de reacție, natura reacției catalizate etc si se poate face prin măsurarea modificării densității optice in unitatea de timp a volumului de gaz degajat sau consumat in unitatea de timp. Comisia de enzimologie a uniunii internaționale de biochimie a propus ca viteza unei reacții enzimatice sa fie exprimata in moli de substrat transformați in unitatea de timp iar unitatea de activitate enzimatica (U) se definește ca fiind acea cantitate de enzima ce catalizeaza transformarea unui micromol de substrat într-un minut in condiții standard identice cu condițiile de reacție existente in vitro. Activitatea enzimatica este de mai multe tipuri in funcție de modul de exprimare: Activitate relativă: munărul de unități/ml(mg) de material biologic Activitatea specifică: numărul de unități/1 mg proteină Activitatea moleculară: numărul de unități/micromoli de enzimă In prezent se mai utilizează catalul ca unitate de activitate enzimatica ce se definește ca fiind cantitatea de enzima ce transformă un mol de substrat într-o secunda. Structura enzimelor Enzimele fără excepție sunt proteine fiind constituite numai din catene polipeptidice (proteine simple/holoproteine) fie din catene polipeptidice si alte componente organice sau anorganice(proteine complexe sau conjugate) deci dpdv structural enzimele se clasifica in doua grupe: enzime monocomponente formare numai din catene polipeptidice si enzime bicomponente in molecula cărora, pe lângă componenta polipeptidică mai exista si o componenta neproteică – cofactor enzimatic. Atunci când cele doua componente se leagă prin legături necovalente componenta neproteică se numește coenzima iar daca legarea se face covalent cofactorul se numește grupare prostetică. Componenta proteica denumita apoenzima poate fi constituita din una sau mai multe catene polipeptidice fiecare fiind alcătuită la rândul sau din cel puțin 100 de resturi de AA 20 legați covalent dând naștere unor adevărate edificii macromoleculare cu mase moleculare cuprinse intre 10.000 – câteva milioane de daltoni (Da). Organizarea structurala a enzimelor Din aceleasi considerente structura(sunt proteine)enzimelor prezinta aceleasi particularitati ca si proteinele propriu-zise in organizarea lor structurala. Ele prezinta 4 tipuri de structura sau mai exact,4 niveluri de organizare astfel: a) Structura primara care este reprezentata de natura si succesiunea aminoacizilor in catena polipeptidica; b) Structura secundara care este data de aranjamentul spatial al principalilor atomi ai catenei,fara a tine seama de orientarea radicalilor si de relatiile cu alte segmente; c) Structura tertiara este reprezentata de aranjamentul spatial al tuturor atomilor,fara a considera realtiile cu moleculele vecine; d) Structura cuatenara care este data de aranjamentul subunitailor in spatiu. Nivelele superioare de organizare a structurii proteinelor si enzimelor sunt specifice si intotdeauna aceleasi pentru o enzima data in conditii naturale. Proprietatile chimice si catalitice ale enzimelor sunt rezultatul structurii primare a acestor macromeloecule,iar conformatiile lor refelecta interactiunile care se pot stabili intre radicalii resturile de aminoacizi care conduc la stari stabile termodinamic cu minimum de energie libera. Dpdv structural ,enzimele sunt fie proteine simple,fie proteine conjugate. Partea prostetica al celui de-al 2 lea tip de enzime ,poate fi reprezentata de diferite vitamine hidrosolubile,nucleotide,ioni metalici etc. Faptul ca aceeasi grupare prostetica se poate combina cu diferite apoenzime (=parte proteica) dand nastere la enzime cu activitati catalitice extrem de diferite ,a determinat pe enzimologi sa considere ca specificitatea enzimelor este conferita preponderent de partea proteica. Pe de alta parte, masa moleculara a subtratului raportata in procente la masa moleculara a enzimei numai in rare cazuri depaseste 1%. Aceste considerente au condus la enuntarea urm postulat : “activitatea catalitica este realizata de o regiune mica din enzima geometric discreta ,numita centrul activ -situs activ- sau situs catalitic”. Centrul activ poate fi exrem de diferit,in functie de structura enzimei: 21 1) In cazul enizmelor monocomponente,formate doar din catene polipeptidice,centrul activ este alcatuit numai din resturi de aminoacizi care pot fi situate in pozitii diferite ale catenei polipeptidice,dar apropiate in spatiu si grupate pe o arie cu diametrul de 10-30 A(angstromi) ca urmare a unui mecanism de pliere a macromoleculei proteice. De exemplu: In cazul chimotripsinei,centrul activ este constituit din 3 resturi de aminoacizi si anume:restul de histidina din pozitia 57,restul de serina din pozitia 195,restul de acid aspartic din pozitia 202,enzima fiind formata din 242 de resturi de aminoacizi dispuse sub forma a 3 catene polipeptidice.(nu e de inv) Situsul catalitic al chimotripsinei,format din resturile de aminoacizi aratate ,acopera o aria de 20 A 2)In cazul enzimelor bicomponente,cofactorul enzimatic face parte in general,din structura centrului activ,particiand efectiv la actul catalitic. De exemplu: In cazul carboxipeptidazei,metalonzima formata din apro 300 de resturi de aa,centrul activ este format din ionul de Zn3+ si resturile de aa :parginina din 145,tirozina 248,glutamat 270. CONZIME-cofactori enzimatici Nu intodeuna este posibila o stricta delimitare intre conzime si gruparile prostetice pe de o parte si intre cofactori si substrat pe de alta parte. Exista exemple tipice de coenzime ( NAD+, NADP+) precum si de grupari prostetice(piritoxal5’ fosfat) dar in unele cazuri acelasi cofactor poate fi legat puternic de apoenzima ca si gruparile prostetice (flavinele din lipoamid dehidrogenaza)sau legat labil (ca in D aminoacid-oxidaza). In cazul unor transformari biochimice succesive ,cu toate ca in cele din urma cofactorul enzimatic se reface in forma lui initiala ,el poate deveni intr-una din etape substrat al unei reactii enzimatice Studiul naturii chimice al coenzimelor si grupărilor prostetice a demonstrat ca majoritatea sunt vitamine sau derivati ai vitaminelor,in general hidrosolubile sau derivati fosforilati ai nucleozidelor 22 CLASIFICARE: In functie de structura lor chimica ,coenzimele pot fi clasificate in: --conzime cu structura alifatica --coenzime de natura aromatica -- coenzime cu structura heterocic -- conzime cu structura nucleozidica+nucleotidica 1.COENZIME CU STRUCTURA ALIFATICA Acidul lipoic,glutationul si acidul ascorbic a)acidul lipoic -descoperit in 1941 in mai multe laboratoare concomitent. La inceput s-a observat actiunea ca factor de crestere a unor protozoare,apoi ca factor care inlocuieste acidul acetic pentru creșterea lui Lactobacillus Casei si Streptococcus lactis. Studiul acestor compusi a demostrat ca ei reprezinta defapt o singura substanta si anume acidul α-lipoic aflat sub forma redusa sau oxidata. Aidul α-lipoic este o disulfura ciclica a acidului dimercapto n octanoic Reactie(1): Sub forma oxidata acidul lipoic are o coloratie galbuie si un spectru de absortie caracteristic de 335nm. Forma redusa a acidului alfa lipoic nu se întâlnește in stare libera in țesuturile animale, vegetale si microorganisme. Studii ale distributiei acidului alfa lupoic au aratat ca el apare in tesuturi asociat cu proteinele printr-o legatura covalenta care se formeaza intre gruparea carboxil a acestuia si gruparea epsilon amino a unui rest de lizina. Rolul biologic al acidului alfalipoic este determinat de prezenta unor legături disulfidice intramoleculare. b) Glutationul - este o tripeptida formata din L-glutamat, L-cisteina, glicina si se întâlnește in toate celulele vii. 23  Gruparea functionala al glutationului este gruparea sulfhidril. Glutationul redus este oxidat enzimatic in prezenta acidul-D-hidroascorbic sub acțiunea glutation reductazei. Glutationul oxidat este redus enzimatic la NADH, NADPH in prezenta glutation reductazei. Reactie: Deoarece suferă reacții de oxidare si reducere el îndeplinește un rol important in calitatea de cofactor al unor oxidoreductaze. Glutationul-oxidat constituie coenzima unor izomeraze care realizează trecerea acidului-fenil-piruvic din forma cetonica in forma enol sau a cis-izomerilor in trans-izomeri ca de exemplu a acidului maleic in acid fumaric. C) acidul ascorbic -acidul L-ascorbic este un acid enolic relativ tare care poate fi oxidat ușor si reversibil la acid dehidroascorbic, 24 Potențialul redox al acidului ascorbic este situat intre cel al piridin-nucleotidelor si al citocromului c si are o valoare comparabila cu a glutationului ceea ce a sugerat faptul ca acest compus cu acțiune vitaminică acționează la nivel celular in calitate de transportor de hidrogen. 2. COENZIME DE NATURA AROMATICA Din aceasta categorie fac parte ubichinonele,ele contin un inel derivat de la hidrochinona si multe unitati izoprenice. Formula(5): Conzimele Q apar in tesuturile animalelor si plantelor superioare in special in mitocondrii,fiind componenete ale lantului respirator si trasportand hidrogenul de la falvin enzime ,la sistemul citocromic. 3.COENZIME DE NATURA HETEROCICLICA a)coenzime-derivați ai tiaminei vitamina B1 Tiamina(B1, aneurina) este un factor nutritiv deosebit de important. Forma in care tiamina funcționează in calitate de coenzima este tiamin-piro-fosfatul(TPP). TPP joaca rol de coenzima pentru enzimele participante la reacțiile de decarboxilare a alfa cetoacizilor, reacțiile de dismutare a acidului piruvic si reacțiile de decarboxilare oxidativa. 25 b) Coenzime derivate de la biotina Rolul de cofactor al biotinei este jucat in reacțiile enzimatice in care se realizează o activare urmata de un transfer de CO2 adică reacții de carboxilare si decarboxilare. In aceste reacții se formează in totdeauna un intermediar carboxilat al cofactorului si anume carboxi biotina. A doua etapa a transformării o constituie cedarea CO2 de către carboxi-biotina celuilalt substrat. In majoritatea reacțiilor biotina îndeplinește funcțiile de grupare prostetică deoarece se leagă covalent de apoenzima la nivelul unei grupări epsilon-NH3 a unui rest de lizina din centrul ac tiv al enzimei. Catena laterala a biotinei permite acesteia sa funcționeze ca un braț mobil in interiorul centrului activ, fapt ce facilitează carboxilarea.O reacție importanta in care este implicata biotina in calitate de cofactor este reacția de carboxilare a piruvatului. 26 Acelasi mecanism este respectat si la carbolirarea acetil coenzimei A,ce reprezinta prima reactie din calea de biosinteza a acizilor grasi. c)Coenzime derivate de la piridoxina (vitamina B6) Numeroase reacții sunt catalizate de enzime ce conțin in calitate de cofactor piridoxal- fosfatul adică derivatul fosforilat al formei aldehidice a vitaminei B6. Cele 3 forme ale vitamine B6 sunt: PIRIDOXOL, PIRIDOXAL și PIRIDOXAMINĂ In metabolismul AA enzimele piridoxal-fosfat dependente catalizeaza reacții extrem de variate: transaminarea, decarboxilarea si racemizarea AA, condensarea indolului si serinei cu formare de triptofan etc. 27  Piridoxal-fosfat se leagă printr-un sistem de baze SCHIEFF cu gruparea epsilon-NH3 a unui rest de lizina din apoenzima. In timpul formarii complexului enzima substrat, gruparea epsilon NH3 este eliberata, cofactorul enzimatic trecând din starea de grupare prostetică in cea de coenzima. Pe langa rolul de cofactor, piridoxal fosfatul îndeplinește și o importanta functie de stabilizare a structurii terțiare a enzimei. D)COENZIME DERIVATE DE LA ACIDUL FOLIC (VITAMINA M) Acidul folic a fost extras prima data din frunzele de spanac după care a fost descoperit in ficat si alte organe si țesuturi. Conține in molecula un rest de pteridina, un rest de acid- para-NH3-benzoic si un rest de acid glutamic. Pteridina si acidul-para-NH3-benzoic formează acidul pteroic. In stare libera, acidul folic se întâlnește foarte rar fiind prezent de obicei sub forma unor derivați care joaca același rol biochimic. Cel mai adesea se întâlnește in forma sa redusa care este acid 5,6,7,8-tetrahidrofolic sau acidul folinic. Acidul folic si derivații sai îndeplinesc in organism alături de rolul vitaminic si rol de coenzime ale unor enzime ce catalizeaza reacții de transfer a radicalilor monocarbonati cum ar fi grupele formil, metil, hidroximetil, etc. 28  Enzimele care conțin acidul folic in calitate de coenzime alcătuiesc o grupa denumita pteroil-enzime sau ptero-proteine. 4.COENZIME CU STRUCTURA NUCLEOZIDICA SI NUCLEOTIDICA a) ATP-adenozin trifosfatul este principalul transportor de grupări fosfat Legăturile intre radicalii fosfat ale ATP-ului sunt hidrolizate cu eliberarea unei energii libere cu mult mai mare decât in cazul hidrolizei altor esteri fosforici cum ar fi glicerol-1- fosfatul (8 kcal fata de 3 kcal). Energia eliberată prin hidroliza legăturilor macroergice este utilizată în procesele de biosinteză sub acțiunea sintetazelor. Și celelalte baze azotate formează nucleozide și nucleotide cu rol coenzimatic. b) Coenzima A A fost descoperită în 1947 ca un agent de activare și transfer a radicalului acetil. Ulterior s-a dovedit a avea o acțiune mult mai diversificată, acționând asupra radicalilor acil proveniți de la numeroși acizi organici. Dpdv structural CoA este formată dintr-un rest de acid adenilic, ribozo-3’-fosfat, pirofosfat, acid pantotenic și tio-etanol-amină. 29  Gruparea funcțională -SH (tiol) reprezintă partea activă a coenzimei A din care cauză ea se notează prescurtat CoA-SH. Această coenzimă joacă un rol deosebit de important în majoritatea reacțiilor care implică transfer de grupări acil. În aceste reacții, CoA intră sub forma ei acilată R—C=O-S-CoA. c) Coenzimele piridin-nucleotidice (coenzimele nicotin-amid-nucleotidice) Majoritatea organismelor animale, precum și numeroase microorganisme necesită un aport zilnic de acid nicotinic(niacină) sau de nicotinamidă în dieta alimentară sau în mediul de cultură. Unele microorganisme sunt capabile să sintetizeze această vitamină, în timp ce altele au nevoie de acid nicotinic ca factor de creștere. În afară de rolul vitaminic jucat de acidul nicotinic și amida sa, acesta intră în structura a două coenzime extrem de importante, NAD+ și NADP+, coenzime care funcționeaza ca agenți de transfer a protonilor și electronilor datorită unor procese de oxidare și reducere reversibile. 30  Dpdv structural, nicotin-amid-adenin-dinucleotida(NAD+) este formată din două nucleotide și anume: una dintre acestea este un compus format din amida acidului nicotinic, riboză și un radical fosfat iar a doua nucleotidă reprezintă de fapt acidul adenozin- monofosforic(ADM) Legăturile dintre molecula D-ribozei și azotul adeninei pe de o parte și dintre cea de-a doua moleculă de riboză și azotul nicotinamidei pe cealaltă parte sunt legături de tip beta – N- glicozidice în timp ce acidul fosforic, în ambele nucleotide formează cu riboza un compus ribozo-5’-fosfat. Nicotin-amid-adenin-dinucleotida-fosforilată NADP+ conține în plus un rest de acid fosforic esterificat la hidroxilul de la atomul de C2 al ribozei din adenozină. Pentru facilitarea studiului privind mecanismul de acțiune în molecula etanolului au fost înlocuiți 2 atomi de H cu 2 atomi de deuteriu. Reacția catalizată este urmatoarea: 31  Coenzima redusa a fost izolata și s-a stabilit că ea conține un atom de deuteriu per moleculă. De asemenea, s-a pus în evidență formarea aldehidei acetice care conține un atom de deuteriu. Coenzima redusă poate fi reoxidată cu aldehida acetică în prezența alcool- dehidrogenazei(reacția inversă) sau cu piruvatul în prezența lactat-dehidrogenazei. În ambele cazuri, deuteriul este îndepărtat din coenzimă. Lactatul format conține un atom de deuteriu în moleculă ceea ce a permis formularea următoarelor concluzii: Reacția are loc printr-un transfer direct de atomi de H de la o moleculă la alta În timpul reacției orientarea relativă a substratului și coenzimei este întotdeauna aceeași; atomul de H este transferat atomului de C4 din coenzimă iar H hidroxilic este transferat atomului de N. d) Coenzimele flavinice În 1932 a fost izolat din albușul de ou un pigment galben-verzui puternic fluorescent care a primit atunci numele de ovo-flavină. Ulterior s-a semnalat prezența acestui compus în lapte (a fost denumit lacto-flavină), în ficat, în rinichi, mușchi, levuri, malț etc. Cercetări detaliate au demonstrat că acest pigment este o vitamină care a primit numele de vitamina B2 sau riboflavină, denumire care derivă de la ribitol, un alcool tetra-hidroxilic care intră în structura sa. Riboflavina ca atare joacă rol vitaminic. În aproape toate celulele vii ea se mai găsește însă și în structura a două coenzime importante și anume: flavin-mono-nucleotidul (FMN) și flavin-adenin-dinucleotidul(FAD). În organismele vii, cea mai mare parte a riboflavinei se întâlnește sub forma celor doi cofactori și mai puțin sub forma vitaminei libere. Flavinmononucleotidul FMN este de fapt vitamina B2 fosforilată. 32  În prezent se cunosc peste 40 de enzime flavinice din care numai o parte neînsemnată are drept cofactor riboflavin-5’-fosfatul (FMN) de exemplu citocrom-c-oxidoreductaza. Celelalte enzime au drept cofactor FAD-ul. Rolul de coenzime al FMN și FAD pentru oxidoreductaze este asigurat de existența în structura nucleului izo-aloxazinic a celor două legături duble conjugate. În reacțiile de dehidrogenare, nucleul izo-aloxazinei se reduce la nivelul legăturilor duble conjugate iar oxidarea coenzimei are loc invers atunci când substratul de reduce. 33 ➔ 2 protoni la N din ciclul 2 jos și 3-sus, legăturile din ciclu fiind schimbate Acești cofactori reprezintă coenzimele multor flavin-enzime implicate în reacțiile de oxido-reducere ale unor substrate, Cum ar fi, piridin-nucleotidele, alfa-AA, alfa-hidroxiacizi, aldehide, unele combinații saturate ale carbonului, etc. Mecanismul molecular prin care au loc reacțiile redox sub acțiunea flavin-enzimelor nu este încă în întregime elucidat. Studiile pe modele cu flavine și compuși înrudiți structural au stabilit că reducerea flavinei la nivelul nucleului izo-aloxazinic are loc prin două procese de transfer a câte unui singur electron; drept urmare, adiția H la nucleu are loc prin formarea a 3 compuși intermediari și anume: verdo-flavina(culoare galben-verzuie), cloro- flavina(verde), rodo-flavina(roșu carmin). Deși participă la multe reacții de oxido-reducere funcția de bază a flavo-proteinelor o constituie participarea la etapa finală a oxidării biologice în catena respiratorie, participare ce constă în transportul electronilor și protonilor de la coenzimele nicotinamidice și de la succinat la sistemul citocromic. FAD este cofactorul citocrom-c-reductazei și al dehidrogenazei L-aminoacizilor, modul de acțiune al L-aminoacid-dehidrogenazei putând fi reprezentat schematic astfel L-AA→ (FAD→FADH2) iminoacid Flavoproteinele mai joacă rol de coenzime pentru diaforaza, glicin-oxidază, xantin- oxidază și butiril CoA-dehidrogenaza. În prezent se cunoaște că numeroase flavo-proteine mai conțin în afară de FMN sau FAD și atomi ai diferitelor metale cu valență variabilă; de ex: xantin-oxidaza este o metal-flavo-proteină care conține Molibden Mo, hidrogenaza acidului fumaric conține fier Fe, iar butiril CoA-dehidrogenaza are în molecula ei Cu cupru. 34  e) Coenzimele Cobamidice Sunt derivați ai vitaminei B12 numită cobalamină, ce are o structură compleză, ce conține 4 nuclee pirolice parțial reduse și care au numeroși substituenți: un rest de dimetil- benz-imidazol unit la atomul central de cobalt Co, o moleculă d riboză fosforilată la atomul de C3 și amino-propanol legat de o catenă laterală al ciclului D al nucleul tetrapirolic. Un rol al cobamid-coenzimelor constă în cataliza transformării 1,2-propandiolului în aldehidă propionică și a etilen-glicolului în acetaldehidă. De asemenea la microorganisme, iau parte la reacția de izomerizare a acidului glutamic Glu în acid beta-metil-aspartic în timp ce în ficat s-a evidențiat prezența enzimei metil-malonil-CoA-izomeraza care conține cobamidă în calitate de coenzimă și care catalizează reacția de conversie a metil-malonil- CoA în succinil-CoA. f) Coenzime si cofactori feroporfirinici Reprezentanții tipici ai acestei categorii de enzime care conțin cofactori de natura fero-porfirinică sunt catalazele, peroxidazele și sistemul multienzimatic care participă la procesele de oxidare biologică reunit sub denumirea de sistem citocromic. Citocromii formează o grupă de hemoproteine intracelulare cu rol extrem de important în procesul respirației celulare. Citocromii se deosebesc între ei după spectrele de absorbție, gradul de afinitate față de oxigen și după natura chimică a cofactorului. A. Grupa A cuprinde citocromi care au în calitate de cofactori formil-porfirina B. Grupa B cuprinde citocromi care au în calitate de cofactori proto-porfirina C. Grupa C cuprinde citocromi care au în calitate de cofactori mezo-porfirina substituită D. Grupa D cuprinde citocromi care au în calitate de cofactori dihidro-porfirina Cinetica reacțiilor enzimatice Deoarece enzimele acționează în celula vie, iar pe de altă parte sunt substanțe proteice, ele prezintă unele particularități fizico-chimice și funcționale care le deosebesc net de catalizatorii chimici. Complexitatea structurii chimice a enzimelor precum și complexitatea mecanismelor intime de reacție determină ca studiul cineticii reacțiilor enzimatice să fie mult mai dificil comparativ cu cinetica reacțiilor chimice în general. Studiile cinetice în enzimologie se bazează pe măsurarea vitezei de reacție în condiții standard care sunt identice cu cele existente in vivo precum și în anumite condiții particulare create special în acest scop. 35  Deoarece numărul variabilelor ce corespund tuturor parametrilor unei reacții biochimice date este extrem de mare, prelucrarea matematică a datelor obținute este atât de complexă încât este absolut necesar să se facă unele aproximații în vederea reducerii la maximum a numărului acestor variabile. Reacțiile enzimatice ce asigură desfășurarea căilor metabolice au loc in vivo și respectă toate principiile și legile termodinamicii. Cu toate acestea, noțiunea de echilibru este diferită de echilibrul reacțiilor chimice iar pe de altă parte sistemele biologice se caracterizează prin existența reacțiilor cuplate în care produsul unei reacții este substrat pentru reacția următoare. Puntea de legătură între două reacții ale unui astfel de sistem este asigurată de prezența unui proton, a unui electron sau a unui compus cu structură complexă. De ex, în reacțiile de dehidrogenare catalizate de enzimele NAD+ sau NADP+ dependente coenzima trece în forma sa redusă în prima reacție ce constă în dehidrogenarea substratului și se regenerează în forma sa oxidată într-o reacție cuplată cu prima cedând protonii și electronii unei molecule de FAD (de exemplu). În așa numitele reacții enzimatice cheie, există mecanisme enzimatice speciale numite reacții enzimatice anti-paralele sau bucle ireversibile ce pot fi explicate dpdv termodinamic. De exemplu: în cazul conversiei fructozo-6-fosfatului în fructozo-1,6-difosfat sub acțiunea fosfo-fructo-kinazei și în prezența ATP-ului, entalpia liberă este negativă iar reacția este practic ireversibilă. Reacția inversă are totuși loc în absența ATP-ului dar este catalizată de o altă enzimă și anume fructozo-1,6-difosfataza. Influența unor factori asupra vitezei reacțiilor enzimatice Deoarece acționează în organismele vii, enzimele se comportă total diferit comparativ cu catalizatorii chimici în acțiunea unor factori de mediu. Astfel, enzimele își manifestă activitatea catalitică maximă în condiții fiziologic normale de pH, temperatură, presiune osmotică etc. Dinamica activitatii enzimatice la concentratii diferite ale substratului enzimei si modulatorilor fiind de asemenea diferita. Influența concentrației enzimei asupra vitezei reacțiilor enzimatice Viteza reacțiilor enzimatice, teoretic, este direct proporțională cu concentrația enzimei în mediu. v-viteza reactiei enzimatice []-concentratie 36  În condițiile determinărilor practice, reprezentarea grafică a dependenței vitezei de reacție de concentrația enzimei nu este liniară ci se obțin curbe Grafic: Porțiune AB a curbei poate fi datorată faptului că la concentrații mari de enzimă, viteza cu care este consumat substratul nu mai este direct proporțională cu concentrația enzimei dar aceasta abatere este mai degrabă un artefact experimental și nu o comportare reală O altă cauză o poate constitui limita metodei de dozare utilizată la estimarea vitezei de reacție. În cazul în care studiul cinetic nu este relizat pe un preparat enzimatic înalt purificat, preparatul conținând un inhibitor, creșterea concentrației enzimei va fi însoțită și de creșterea concentrației inhibitorului. Un caz aparte îl reprezintă enzimele proteolitice care acționând asupra proteinelor în diferite concentrații prezintă dependențe v în funcție de concentrația enzimei neliniare. S-a încercat să se găsească ecuații empirice care să definească aceste curbe. Schutz consideră că viteza reacțiilor catalizate de proteinaze este o funcție de tipul v=k * √[𝐸]. Această ecuație este valabilă numai în anumite condiții – experimentale limită din care cauză pentru determinarea activității acestor enizme se construiesc curbe de etalonare cu ajutorul preparatelor enzimatice pure, curbe ce ajută a transformarea unităților de densitate optică în unități enzimatice. Influența concentrației substratului asupra vitezei reacțiilor enzimatice. Constanta kM. Factori de influențează valoarea constrantei kM La baza cineticii enzimatice stă postulatul existenței unui complex deosebit de reactiv ES între enzimă și substratul ei. Acestă structură tranzitorie, deosebit de instabilă a fost denumită complex enzimă-substrat sau complex Michaelis după numele unuia din autorii teoriei generale a cineticii enzimatice(Michaelis, Menten, Haldane). Cea mai simplă reacție enzimatică poate fi redată de ecuația: 37  În care există un singur complex ES bogat în energie. În realitate, în majoritatea reacțiilor enzimatice, apar două sau mai multe complexe enzimă-substrat, adevăratul complex Michaelis fiind cel care determină viteza reacției totale în cel mai înalt grad. Reacțiile generale pentru astfel de transformări sunt de tipul: E+S  ES1 ES2..... → P + E Cinetica reacțiilor enzimatice cu un singur substrat În 1925, Haldane elaborează teoria stării staționare, conform căreia, în orice moment al unei reacții enzimatice, vitezele de formare și de scindare a complexului ES sunt aproximativ egale, așa încât, pentru o scurtă perioadă de timp, concentrația complexului ES poate fi considerată constantă. Plecând de aici, s-a postulat că între viteza de reacție și concentrația substratului se instalează o stare staționară. Michaelis și Menten introduc schema reacției generale a unui mecanism enzimatic E+S< -- >ES→ E+P Pentru studiul cinetic al unor astfel de reacții enzimatice se fac următoarele notări: [E] – concentrația totală a enzimei [S]- concentrația substratului liber [ES]-concentrația complexului enzimă-substrat De regulă, concentrația substratului este mult superioară enzimei din care cauză modificare concentrației de substrat poate fi neglijată. Viteza de formare a complexului ES se poate calcula aplicând legea acțiunii maselor. Unde [E]-[ES] reprezintă de fapt concentrația enzimei libere. 38  Complexul ES se poate disocia pe calea reacției inverse sau prin formarea produsului de reacție și regenerarea enzimei. Aplicând aceeași lege, viteza de disociere a complexului ES va fi: În momentul atingerii stării de echilibru, [ES]→concentratia compleului enzima substrat; devine constantă (cele două viteze egale) deci viteza de formare devine egală cu viteza de disociere a acestui complex. Această egalitate este de tipul „produsul mezilor este egal cu produsul extremilor”, deci termenii pot fi rearanjați sub forma unei egalități de fracții. Constanta kM se numește constanta Michaelis-Menten. Odată cu creșterea concentrației de substrat, treptat toată enzima va fi legată în complexul ES. Asta înseamnă că [E]=[ES]. Deoarece în aceste condiții, întreaga cantitate de enzimă -- în complexul ES, acest moment corespunde vitezei maxime de reacție care este deci dependentă doar de concentrația enzimei, singurul factor limitant. Vmax= k[E] , dar noi stim ca viteza reacției enzimatice în general va fi V=k[ES]. Din ultimele două ecuații scoatem valorile lui E și ES: [E]=Vmax/k; [ES]=v/k Introducem aceste valori în ecuația care dă valoarea lui kM și atunci obținem: 39 [S]=kM kM are o valoare exactă concretă. Ea indică acea concentrație a substratului pentru care viteza reacției enzimatice este egală cu ½ din viteza maximă. Daca presupunem ca v=1/2 Vmax obținem: (totul minus 1) Se poate obtine: Ecuatie care reflecta dependenta vitezei recatiilor enzimatice de concentratia substratului si poarta numele de ecuatia Michaelis-Menten. kM are o valoare exacta,concreta;ea indica acea concentratie a substratului pentru care v reactiei enzimatice este egala cu ½ din viteza maxima. Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice de concentrația substratului este următoarea: 40  Constanta kM este parametrul cinetic de bază al enzimelor fiind o măsură a gradului de afinitate dintre enzimă și substrat. Această afinitate este cu atât mai mare cu cât kM este mai mic. Determinarea practică a valorii lui kM se face în mai multe moduri. Determinarea constantelor cinetice prin reprezentarea grafică a ecuației Michaelis- Menten(M-M) este anevoioasă atât datorită numărului mare de determinări necesare pentru trasarea graficului, cât și posibilităților de eroare. De aceea 2 cercetatori, au prelucrat matematic ecuația M-M utilizând valorile inverse. 41  Reprezentarea grafică a lui 1/v in functie de 1/[S] este o dreaptă ce intersectează abscisa în punctul -1/kM. Utilizând această reprezentare se poate determina și constanta catalitică sau numărul de turnover ca fiind egal cu raportul Vmax/[E]. Constanta kM are dimensiunile unei concentrații, se exprimă de obicei prin molaritate și poate lua valori de la 10-1M la 10-8M. Pentru enzimele a căror substrat este o substanță macromoleculară cu masă moleculară variabilă (amidonul- pentru amilaze, apoi pentru diferite proteine pentru proteaze etc) valoarea constantei kM se ia în procente. Enzimele care au valorile lui kM cuprinse intre 10-1 si 10-2M prezinta o mica afinitate pentru subtratele a caror transformare o catalizeaza, iar enzimele cu kM cuprins intre 10-5 si la 10-8 au o mare afinitate pentru substratele lor. Valoarea kM este totdeauna aceeasi pentru fiecare pereche enzima-substrat in conditii standard,dar diferea la modificarea substratului pH-ului,temperaturii etc. Abateri de la cinetica Michaelis-Menten Nu toate enzimele cunoscute astăzi respectă cinetica Michaelis-Menten. De exemplu, enzimele alosterice care sunt implicate în mecanismele moleculare de reglare a metabolismului prezintă unele abateri de la cinetica Michaeliană. Există de asemenea enzime a căror activitate catalitică scade progresiv odată cu creșterea concentrației substratului. În aceste cazuri, cinetica Michaeliană este respectată doar în domeniul concentrațiilor mici de substrat. Acest fenomen poartă numele de inhibiție prin substrat. * Abaterile de la cinetica Michaelis-Menten presupun nu doar scăderea activității catalitice la concentrații mari de substrat, existând și situații când mărirea concentrației substratului determină o accelerare a procesului catalitic. Acest fenomen poartă numele de activare prin substrat și se întâlnește în cazul enzimelor ce pot exista la echilibru în două conformații: E1 și E2, din care una predomină cantitativ. Cealaltă formă conformațională are o concentrație mult mai mică în mediu, în schimb afinitatea sa pentru substrat este mai mare. În momentul în care enzima intră în contact cu substratul său, primele molecule ale complexului ES se vor forma preponderent pe seama 42 formei enzimatice cu afinitate mai mare. În felul acesta, concentrația acestei forme conformaționale scade. Treptat, o cantitate din ce în ce mai mare de enzimă este convertită în conformația mai activă, aceasta însemnând că viteza procesului per ansamblu crește. Și enzimele ce acționează asupra substratelor insolubile prezintă comportament neMichaelian. Un exemplu concret în acest sens îl constituie lipaza care este hidrosolubilă, al cărei substrat nu este miscibil cu apa. In vivo, substratul se află sub formă emulsionată datorită acțiunii bilei iar viteza de scindare hidrolitică a acestuia nu depinde de concentrația trigliceridelor ci de mărimea suprafeței de contact de la interfața celor două faze adică de gradul de emulsionare. O altă situație de comportament neMichaelian o constituie reacțiile autocatalitice. De exemplu conversia tripsinogenului în tripsină activă este o reacție autocatalitică adică tripsina formată manifestă o acțiune de activare a procesului. Un comportament neMichaelian se mai întâlnește și la enzimele care prezintă în afara centrului activ un al doilea situs dar cu afinitate inferioară primului. În acest caz saturarea enzimei în substrat poate provoca o deformare a moleculei enzimei soldată cu scăderea capacității catalitice. Marea majoritate a reacțiilor enzimatice cu două substrate se caracterizează printr-un comportament neMichaelian. Astfel, reacțiile catalizate de hidrolaze sunt reacții bimoleculare deoarece apa este unul din substrate. Atunci când concentrația celuilalt substrat crește, concentrația apei scade fapt ce afectează de asemenea viteza de reacție. Influența pH-ului mediului asupra vitezei reacțiilor enzimatice Enzimele sunt extrem de sensibile la variațiile de pH care le poate afecta activitatea, fie ireversibil când este denaturată enzima, fie reversibil când este afectat gradul de ionizare al substratului enzimei sau a complexului ES. Dependența vitezei de pH-ul mediului de incubare are aspect de clopot și poate și reprezentată astfel: 43  Viteza maximă de reacție se înregistrează la valoarea de pH optim. Majoritatea enzimelor prezintă un pH optim de acțiune situat în vecinătatea pH-ului fiziologic normal (om-7.4). un număr redus de enzime fac excepție de la această regulă, de exemplu: - Pepsina este activă în intervalul de pH 1.4 cu un maxim de activitate la pH 1.8, valoare la care alte enzime sunt total inactive, uneori chiar denaturate. Este interesant faptul că limitele foarte largi de pH la care pepsina are o activitate maximă sunt în funcție de natura, proprietățile și starea fizico-chimică a proteinei substrat. De exemplu, ovalbumina nativă este hidrolizată cu viteză maxima la pH între 0.8 și 1, în timp ce aceeași proteină denaturată prin încălzire este hidrolizată cu viteză maximă la pH 1.5-1.8. Câteva enzime au o activitate catalitică maximă în mediu puternic alcalin, astfel arginaza în prezența manganului are pH-ul optim de acțiune egal cu 10. Această valoare de pH optim este puternic influențată de natura chimică a ionului metalic activator. Dependența strictă a activității enzimelor de pH-ul mediului de reacție se datorează următorilor factori: - Denaturarea și degradarea acestor biocatalizatori la valori extreme de pH când pot avea loc scindări de legături covalente și necovalente soldate cu modificări structurale începând chiar cu structura primară a enzimelor. - Modificarea stării de ionizare a substratului atunci când acesta conține grupări polare - Efectul asupra stării de ionizare a enzimei sau a complexului ES. Influența efectorilor asupra vitezei reacțiilor enzimatice Efectori= sau modulatori acele substanțe organice/anorganice care adăugate în mediul de incubare modifică viteza reacțiilor enzimatice. Efectorii care măresc activitatea comparativ cu cea determinată în condiții standard se numesc activatori sau efectori pozitivi iar cei care o micșorează sau o anulează se numesc inhibitori sau efectori negativi. Rolul de activatori poate fi îndeplinit de diferiți ioni metalici( Molibden 3+, Mangan 2+, Mg, Zn), uni anioni anorganici (Cl-) sau unii compuși organici cu masă moleculară mică. 44  Dintre cele două efecte, cel de inhibiție este efectul întâlnit cel mai des, inhibiția reprezentând și unul din factorii de reglare ai metabolismului. Efectul inhibitorilor asupra vitezei reacțiilor/cineticii enzimatice Studiul acțiunii inhibitorilor asupra activității enzimatice reprezintă o parte componentă importantă a studiului cineticii enzimelor deoarece ajută la elucidarea structurii chimice a situsului catalitic al enzimelor respective. Există mai multe tipuri de inhibitori, aceștia putându-se clasifica în funcție de mecanismul lor de acțiune. O categorie importantă de inhibitori o constituie inhibitorii ireversibili sau otrăvurile catalitice(urme ale metalelor grele) Din punct de vedere cinetic, o categorie importantă de inhibitori o constituie inhibitorii reversibili Inhibiția reversibilă se clasifică la rândul ei în mai multe grupe în funcție de modificarea parametrilor kM și Vmax astfel: - Inhibiție competitivă, când inhibitorul determină o creștere a valorii lui kM - Inhibiția pur necompetitivă, când inhibitorul determină o scădere a valorii lui Vmax - Inhibiția incompetitivă, în care atât valoarea lui Vmax cât și a lui kM scad într-un raport constant - Inhibiția mixtă, reprezentată de o combinare a două sau mai multe tipuri de inhibiție Unii agenți de chelatizare sunt inhibitori enzimatici. De exemplu, grupa CN-, N3- etc. în concentrații mici, formează complecși cu metalo-enzimele în special, cu metalo-porfirino- enzimele și cupru-enzimele (catalaza, citocrom oxidaza, urat oxidaza) iar în concentrații mari conduc chiar la îndepărtarea ionilor metalici din structura enzimei. CO(monoxid) este un inhibitor clasic pentru citocrom oxidază și polifenol-oxidază, iar EDTA-ul și orto- fenantrolina sunt inhibitori organici utilizați des în studiul structurii metalo-enzimelor. Inhibiția competitivă Substanțele înrudite cu substratul dpdv structural care se combină cu enzima la nivelul aceluiași centru activ ca și substratul natural sunt grupate sub denumirea de inhibitori competitivi. Deci inhibitorii competitivi sunt în competiție permanentă cu substratul pentru unul și același centru activ. Deoarece complexul EI este incapabil de a se transforma mai departe în produși cu eliberarea enzimei, inhibitorii competitivi se mai numesc și inhibitori absoluți. 45  Acești inhibitori se caracterizează printr-o serie de proprietăți principale și anume : prezintă o mare analogie cu substratul natural d.p.d.v. a formei mol. și prin natura și localizarea în spațiu a funcțiunilor polare. Poate forma o serie de interacțiuni ( punți de H, legături ionice) care fac posibilă încorporarea inhibitorului în geometria centrului activ. Inhibitia necompetitiva In cazul acestui tip de inhibiție, nu exista nicio competiție între substrat si efector, fixarea acestuia din urmă având loc la un alt situs decât centrul activ, provocând o deformare a enzimei și poate afecta viteza de reacție sau valoarea lui kM. Cazul de inhibiție necompetitiva pură cand electorul reduce valoarea lui Vmax si nu afectează kM nu apare decât in puține cazuri complete și poate fi considerată ca o alternativă teoretică a inhibiției completitive. Inhibitia incompetitiva Acest tip de inhibiție este înregistrat în cazul în care inhibitorul nu se leagă cu enzima liberă ci numai cu complexul Michaelis(ES) având efecte egale asupra Vmax si kM dar neafectând raportul Vmax/kM. Inhibiția prin substrat și prin produsul de reacție În multe reacții enzimatice, produsul (P) unei căi metabolice poate fi recunoscut de centrul activ al enzimei și in felul acesta, poate funcționa ca un inhibitor competitiv împreună cu substratul (S) din care a provenit. Tipurile de inhibitie prezentate poarta numele de inhibitite liniara,deorece reprezentarile grafice ale valorilor inverse ale valorilor inverse (1/v in funcție de 1/[S]) sunt drepte. Inhibitia liniară este numită și inhibiție completă deoarece creșterea concentrației inhibitorului face ca viteza reacției enzimatice sa tinda către 0. (Inclusiv si in cea competitiva) Dpdv practic însă, exista numeroase cazuri când studiile de cinetica enzimatica in prezenta inhibitorilor conduc la reprezentări grafice neliniare. Acești inhibitori se numesc hiperbolici si ei realizează o inhibiție parțială deoarece activitatea enzimatica nu este abolita complet, nici chiar la concentratii de saturație ale inhibitorului. Inhibiția hiperbolica se întâlnește mai ales în cazul inhibitiei prin substrat si prin produs. 46