Demostración histoquímica de enzimas - 2 PDF

Demostración histoquímica de enzimas - 2  Subconjunto de Ez capaces de producir hidrólisis del ATP en ADP y liberación de un ión fosfato ATPasa libre. Es utilizado a distintos pH para distinguir entre los distintos tipos de...

Demostración histoquímica de enzimas - 2  Subconjunto de Ez capaces de producir hidrólisis del ATP en ADP y liberación de un ión fosfato ATPasa libre. Es utilizado a distintos pH para distinguir entre los distintos tipos de fibras musculares de miosina (I, II, IIa, IIb y IIc). Permite diagnosticar patrones morfológicos característicos. ATPasa: Fundamento histoquimico Tamaño, número y distribución de los tipos de fibras musculares. La reacción histoquímica se basa en: a.- La sensibilidad de la enzima frente a soluciones ácidas y alcalinas, y b.- la detección de fosfato liberado por acción enzimática de la ATPasa. La sensibilidad al pH ácido y alcalino, está dada por la variación de isoformas.  El músculo esquelético está compuesto por una mezcla de fibras que difieren en sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. Fibras tipo I: Roja-Lenta- NADH-SDH-COX- LIPIDOS Denominada miosina de contracción lenta, Posee estabilidad enzimática en soluciones ATPasa: ácidas (pH 4.3). Tipos de Fibras tipo II: Blanca-Rápida-PAS fibras Denominada miosina contracción rápida, posee estabilidad enzimática en soluciones alcalinas (pH 9.4).  Pre-tratamiento del tejido en un medio ácido o básico. El medio ácido inactiva las miosinas de las fibras tipo IIa y IIb. ATPasa: Continuación El medio alcalino inactiva la miosina presente en las fibras tipo I. Resumen de reacción ATPasa según fibra (Bancroft) Fibras tipo II: ATPasa pH 9.4 ATPasa: Fundamento histoquímico ATPasa a pH 9.4 ATPasa a ph 4.3 Cadena transportadora de electrones  Sales de tetrazolium Son compuestos que poseen 1 o mas grupos tetrazol. Aceptor artificial de hidrógenos que al reducirse se vuelve insoluble y coloreado denominandose formazán Sales de tetrazolium Sales de Monotetrazolium: Sales que poseen sólo un grupo tetrazol en su estructura, y al ser oxidado por la enzima, genera un precipitado rojo y soluble, por lo cual se debe recurrir a la quelación con cobalto para formar un producto insoluble. Sales de tetrazolium Sales de Ditetrazolium: Sales que poseen en su estructura 2 grupos tetrazol. al momento de oxidarse producen un precipitado de diformazán color azul sobre el tejido. El diformazán por si solo es un precipitado insoluble, sin la necesidad de usar un agente quelante.  Con NADH-TR se puede diferenciar claramente las fibras tipo I, debido a su alta capacidad oxidativa. Resultados Ejemplo: Miopatía del NADH centronuclear con atrofia de fibras tipo I. Presencia de SDH en cadena transportadora de electrones  Deshidrogenasa succínica Al igual que NADH, la SDH posee como aceptor final del complejo a la CoQ. El ubiquinol cargado de electrones se desplazan por la bicapa lipídica mitocondrial hasta el tercer complejo y sigue la gradiente de electrones que tiene como objetivo la producción de ATP y eliminación de radicales de oxígeno mediante la formación de moléculas de agua. Fundamento histoquimico aceptor artificial de electrones, que al reducirse por acción enzimática, genera un compuesto insoluble y coloreado en el tejido. La enzima actúa sobre el sustrato donador de electrones, Succinato, pero estos electrones no fluyen por el complejo enzimático, sino que quedan atrapados en el aceptor artificial provocando su reducción y la consecuente formación del precipitado coloreado  Resultados SDH El aceptor artificial de electrones es (NBT), el cual, al momento de reducirse genera un Diformazán que es un compuesto muy estable , insoluble, y coloreado. Proporciona un patrón fibrilar característico (fibras tipo I). Citocromo oxidasa Recibe los electrones circulantes y los lleva al aceptor final que es el oxígeno molecular (O2) para reducirlo agua, eliminando así los radicales de oxígeno producidos en la generación del gradiente de electrones para la producción de ATP. Citocromo oxidasa Se basa en la utilización de un donador artificial de electrones que al momento de ser oxidado por acción enzimática, precipita como un compuesto insoluble y coloreado, indicando la actividad enzimática en el tejido. EL sustrato donante de electrones más usado es el 3,3`- Diaminobencidina Tetrahidrocloruro (DAB), el cual al ser oxidado por acción enzimática precipita rápidamente formando un producto de color pardo sobre la zona del tejido que presente acción enzimática. Citocromo oxidasa Este precipitado es insoluble en compuestos orgánicos como alcohol o xilol. El tejido contiene H2o2, y se debe considerar siempre que frente a las miopatías mitocondriales con déficit de COX puedan generarse falsos positivos, a causa de la actividad endógena de peroxidasas. (cuando COX no esté active). Se controla el H2O2 presente en tejido usando catalasa en la solución de trabajo.