Tema 13 Diapositivas PDF

Tema 13 TINCIONES HISTOQUÍMICAS, ENZIMOHISTOQUÍMICAS E HISTOQUÍMICA DE LAS LECTINAS  1- TÉCNICAS DE TINCIÓN HISTOQUÍMICAS La histoquímica se define como “la aplicación de reacciones químicas y bioquímicas sobre tejidos histológicos con el fin de localizar y determinar sustancias (moléculas) o...

Tema 13 TINCIONES HISTOQUÍMICAS, ENZIMOHISTOQUÍMICAS E HISTOQUÍMICA DE LAS LECTINAS  1- TÉCNICAS DE TINCIÓN HISTOQUÍMICAS La histoquímica se define como “la aplicación de reacciones químicas y bioquímicas sobre tejidos histológicos con el fin de localizar y determinar sustancias (moléculas) o su actividad o microorganismos”. Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos: a) Las reacciones químicas en las tinciones consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. b) La histoquímica enzimática se basa en la demostración de la presencia de enzimas.  2- TIPOS DE TINCIONES HISTOQUÍMICAS 2.1 Reacciones histoquímicas para hidratos de carbono Los hidratos de carbono, glúcidos, sacáridos son polialcoholes oxidados. Los polisacáridos están formados por la unión de muchas moléculas de monosacáridos (más de 10). Polisacáridos simples: glucógeno Polisacáridos complejos: Mucopolisacáridos neutros y ácidos, Mucoproteínas y Mucolípidos Las reacciones histoquímicas para hidratos de carbono se basan en la demostración de grupos carbonilo formados sobre los hidratos de carbono por oxidación previa. 2.1.1 Técnica de PAS (ácido peryódico Schiff). Es la más utilizada en muchos laboratorios. Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryódico para aumentar el número de grupos carbonilo presente en ellos, de forma que pueden ser mostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff. El reactivo de Schiff se obtiene a partir de la fucsina básica tratada con ácido sulfuroso, que hace desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula transformándose en una sustancia incolora. Resultado: Glúcidos: rosa intenso a fucsia Núcleos: azul oscuro  Existe una variante que es la variante PAS-digestión DIASTASA que sirve para distinguir si el material PAS positivo es glucógeno, en cuyo caso desaparece con la diastasa o para ver las mucinas neutras que se tiñen con el PAS y que es posible visualizar mejor cuando desaparece el glucógeno de la tinción. Se hace utilizando la amilasa al principio de la técnica. Técnica Desparafinar e hidratar. Amilasa al 1% durante 30 min. Lavar con agua destilada. Pasar a la técnica PAS. AZUL ALCIAN PH 2,5 (METODO PARA RESALTAR MUCOPOLISACARIDOS ACIDOS) Resultados. Pas -: azul brillante. Pas +: rojo. Núcleos: azul. Metenamina de plata En ella la plata metálica obtenida precipita sobre las estructuras que se van a teñir. Es muy importante hacer esta técnica en pH alcalino. Se utiliza para ver las membranas basales principalmente del riñón. REACCIÓN DE FEULGEN  importante pero leer La reacción de Feulgen es una técnica delicada y pueden aparecer una serie de problemas: Que haya una hidrólisis excesiva. El ácido clorhídrico es un ácido fuerte que si se prolonga el tiempo de la hidrólisis disgrega la molécula de ADN en su totalidad. Por ello, el aspecto más importante de la técnica es el tiempo, que puede variar según el fijador utilizado. Tener en cuenta el envejecimiento del reactivo de Schiff. Éste normalmente es incoloro, pero si se vuelve rosa, significa que se está liberando fucsina por envejecimiento y lo hará inservible para la identificación de grupos carbonilo. Habría que desechar el reactivo. 3- MÉTODOS HISTOQUÍMICOS: IDENTIFICACIÓN DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS solo saber qué sustancia pone de manifiesto y qué técnica utiliza, el color solo es importante en la hemoglobina  3.1 Técnica del Azul de Perls Esta técnica de Perls nos permite detectar el hierro en forma iónica (Fe+3), el ligado a proteínas y en forma de hemosiderina. En el interior de los tejidos, el hierro se puede depositar en forma de sales ferrosas o férricas, también llamada forma iónica, o como hierro ligado a proteínas o hierro enmascarado. El hierro ligado a proteínas no puede detectarse directamente, es necesario someterlo a un proceso previo de desenmascaramiento por el cuál lo transformamos en hierro iónico. La hemosiderina es un pigmento proteico de color amarillo o dorado que contiene hidróxido férrico y normalmente aparece como acúmulos dentro de los macrófagos. Se puede teñir con la técnica de Azul de Perls. Técnica: 1. Desparafinar e hidratar. 2. Tratar con la mezcla de ferrocianuro potásico (C₆FeK₄N₆) al 10% y ácido clorhídrico (libera el hierro de los tejidos) al 2% durante 10 minutos. 3. Lavar con agua destilada donde se observará el hierro de color azul. 4. Contrastar si se desea con una solución de rojo nuclear al 1% durante 2-3 min. 5. Lavar con agua destilada. 6. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: ✓ Hierro férrico incluida la hemosiderina de color azul. ✓ Núcleos en color rojo. 3.2 Técnica de Schmorl Determina las lipofucsinas y el pigmento ceroide. La lipofucsina es un pigmento de desgaste pardo-amarillo que aparece fundamentalmente en las células envejecidas del sistema nervioso periférico, músculo cardíaco, hígado, testículo y glándulas suprarrenales. Esta técnica además de colorear la lipofucsina tiñe también la melanina, el pigmento biliar y las células argentafines y cromafines. Técnica: 1. Desparafinar e hidratar. 2. Incubar en una solución de cloruro férrico al 1% y ferricianuro (C 6N 6Fe3−) al 1%, durante 5 min y medio. 3. Lavar con agua corriente. 4. Tratar con ácido acético al 1%. 5. Contrastar con una solución de rojo neutro. 6. Lavar en agua corriente. 7. Deshidratar, aclarar y montar. Técnica de Schmorl Manchas marrón amarillas de lipofucsinas 3.3 Técnica de Masson-Fontana: Se trata de una impregnación argéntica. Este reactivo es la principal dificultad de la técnica : Disolución saturada de Plata amoniacal: Nitrato de plata al 5% en amoníaco. Debe quedar transparente. Se deja reposar y se filtra en el momento de usar. Es fundamental guardarlo en oscuridad, porque la luz reduce el nitrato de plata.. Técnica: 1. Desparafinar e hidratar. 2. Lavar con agua destilada. 3. Plata amoniacal en oscuridad hasta el día siguiente (mínimo 8 horas, máximo 36 horas).Debemos evitar la precipitación del reactivo por luz solar, Queremos que el nitrato de plata de fije a las estructuras afines y éstas comiencen la reducción del nitrato de plata a plata metálica. 4. Tiosulfato sódico 5 minutos. 5. Coloración de contraste con verde de metilo, picroíndigo o hematoxilina. 6. Retirar el sobrante sin lavar. 7. Deshidratar. 8. Aclarar y montar. Técnica de Fontana-Mason, permite identificar sustancias argentafines como la melanina en cortes de piel. Resultados: - Sustancias reductoras de la plata incluida la melanina en color negro. - Fondo según contraste elegido. 4- MÉTODO DE IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DE VON KOSSA PARA IONES CÁLCICOS Las sales de calcio normalmente están presentes en los huesos y dientes, aunque en ocasiones también aparecen áreas de calcificación en tejidos desprovistos de calcio. En general, las sales que con mayor frecuencia se depositan son carbonatos, oxalatos y fosfatos. Técnica: 1. Desparafinar e hidratar. 2. Tratar con solución de nitrato de plata al 1% a plena luz, 30-60 min. 3. Lavar con agua destilada. 4. Lavar en tiosulfato al 2,5%, 5 min. 5. Lavar en agua destilada. 6. Contrastar con el rojo neutro al 1%, 2-3 min. 7. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Hueso y calcificaciones de negro. Núcleos en rojo. MÉTODO DE IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DE VON KOSSA PARA IONES CÁLCICOS TÉCNICA DE LA PLATA METENAMINA DE GROCOTT PARA HONGOS Los hongos son microorganismos que pueden causar enfermedades en determinadas condiciones (hongos patógenos). Se clasifican de acuerdo con su morfología en: a. Filamentosos (hifas): Se suele utilizar la técnica PAS y Gram positivos b. Con esporas: PAS positivos y Gram negativos c. Filamentosos con esporas. La técnica de la plata metenamina tiene su fundamento en la oxidación de los hidratos de carbono de la cápsula mediante el ácido crómico y el ácido peryódico. Estos hidratos de carbono oxidados reducen las sales de plata que contiene el reactivo, haciendo precipitar la plata metálica sobe la estructura a teñir. La sal de plata empleada es el complejo metenamina argéntica. Suele ser inestable y sólo se mantiene como tal a pH alcalino entre 8.3 y 9.2. La técnica debe realizarse con un control continuo de pH, de modo que la precipitación de la plata métalica no ocurra anticipadamente. Se contrasta con solución verde luz durante 30 seg. TINCIÓN DE GROCOTT PARA HONGOS Resultados: Hongos de negro. Tinción de fondo de color verde pálido. Mucina de color gris. 6.- HISTOENZIMOLOGÍA Técnicas dirigidas a demostrar una actividad enzimática mediante la reproducción de la reacción sobre el tejido y en las condiciones óptimas de pH, temperatura, etc… para cada reacción. En el procesamiento del tejido se producen modificaciones reversibles o irreversibles, por lo tanto, a la hora de diseñar el protocolo de fijación, es muy importante intentar preservar al máximo la actividad enzimática. Preferible utilizar material congelado sin fijación química suave (de los aldehídos) En cualquier técnica enzimohistoquímica es necesario proporcionar un sustrato adecuado y las condiciones adecuadas de temperatura, pH o cofactores para la actuación de la enzima. Es importante controlar la concentración del sustrato, ya que, si existe saturación, puede quedar inhibida la reacción de la enzima (inhibición por sustrato). El pH adecuado de la técnica tiene que tener en cuenta el pH óptimo de la enzima y el de la solubilidad del PPR. La reacción enzimática debe visualizarse al microscopio, mediante la aparición de una sustancia coloreada en el tejido, que se deposita en el punto concreto donde se produce la reacción enzimática. Para ello necesitaremos un sustrato del enzima y un producto cromógeno que cambie de color y precipite como consecuencia de la reacción del sustrato.  Corte de hígado, técnica enzimohistoquímica para determinación de ATPasa.Los canalículos biliares quedan marcados como líneas negras. 7- HISTOQUÍMICA DE LAS LECTINAS Las lectinas son proteínas o glucoproteínas de origen no inmune capaces de unirse específicamente a determinados azúcares, de aglutinar células y de precipitar glucoproteínas. Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes. Hay al menos cinco grupos de lectinas según se unan a manosa (Man), a galactosa/Nacetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac), respectivamente. Las lectinas están ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. En histología las lectinas se usan, para estudiar la distribución tisular de distintos tipos de azúcares de manera específica. Se pueden usar diferentes tipos de lectinas en base a su especificidad de reconocimiento de azúcares determinados, pudiendo identificar así distintas poblaciones celulares o alteraciones patológicas de los tejidos. Para observar el lugar de unión específica entre la lectina y su glúcido tenemos que unir a la lectina un marcador que nos produzca una señal visible con el microscopio óptico o electrónico. Marcaje con enzimas como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina, o moléculas fluorescente. Cuando la enzima o la molécula fluorescente están directamente unidas a la lectina se denomina método de detección directa y cuando se unen a la lectina mediante una molécula interpuesta se denomina detección indirecta, como el método con lectinas biotinadas, a las que, posteriormente, se añadirá avidina marcada para su detección.