Conceitos Básicos de Infecção Ocular PDF

# Conceitos Básicos de Infecção Ocular ## Luciene Barbosa de Souza, Ana Luisa Höfling-Lima, Acácio Alves de Souza Lima Filho, Maria Cecília Zorat Yu, Renata Rezende, Paulo José Martins Bispo, Gustavo Barreto de Mello ### A - Mecanismos de Defesa - Microbiota Ocular Normal - Patogênese da Infecção...

# Conceitos Básicos de Infecção Ocular ## Luciene Barbosa de Souza, Ana Luisa Höfling-Lima, Acácio Alves de Souza Lima Filho, Maria Cecília Zorat Yu, Renata Rezende, Paulo José Martins Bispo, Gustavo Barreto de Mello ### A - Mecanismos de Defesa - Microbiota Ocular Normal - Patogênese da Infecção Ocular * Luciene Barbosa de Souza, Ana Luisa Höfling-Lima O olho possui diferentes mecanismos de defesa, anatômicos e imunológicos, responsáveis pela manutenção do equilíbrio da microbiota conjuntival normalmente existente no ser humano. * A pálpebra e os cílios formam uma proteção mecânica durante o sono, ajudando na [remoção de impurezas](https://www.google.com/search?q=remo%C3%A7%C3%A3o+de+impurezas+olho) e distribuição da lágrima com o reflexo de piscar. A pálpebra ainda contribui com a estabilidade do filme lacrimal, através da secreção do seu componente lipídico pelas glândulas meibonianas. * A lágrima, por sua vez, além de representar um fator de diluição de toxinas, alérgenos e microrganismos, ainda é rica em imunoglobulinas, lactoferrinas, lisozimas e outras proteínas, que atuam diretamente na microbiota ocular, com atividade antimicrobiana (Tabela I). Sua camada de mucina, que recobre as microvilosidades epiteliais, inibe a adesão de alguns patógenos na superfície da córnea. O pH neutro da lágrima pode contribuir para a neutralização de substâncias tóxicas na superfície ocular. * Conjuntiva e Córnea - O epitélio da córnea e conjuntiva, formado por camadas de células estratificadas, não queratinizadas, firmemente aderidas, representa uma forte barreira contra a invasão de microrganismos ou material antigênico. Quando lesionado, sua cicatrização é rápida, mantendo o estroma protegido de exposições prolongadas. A camada de Bowman, formada por densas fibras colágenas, é uma barreira adicional à penetração de patógenos. ### Tabela 1: Componentes do Filme Lacrimal | Componente | Concentração (mmol/L) | Função | |---|---|---| | Na+ | 120 a 170 | | | K+ | 6 a 26 | | | Ca++ | 0,5 a 1,1 | | | Mg++ | 0,3 a 0,6 | | | CI- | 118 a 138 | | | HCO3- | 26 | | | Alfa1-antitripsina | 1,5 mg% | Antiproteases | | Alfa1-antiquimotripsina | 1,4 mg% | Antiproteases | | Inibidor inter-alfa-tripsina | 0,5 mg% | Antiproteases | | Alfa2-macroglobulina | 3 mg% | | | Lisozima | | Lise da parede bacteriana | | Lactoferrina | | Ligação com ferro usado em metabolismo microbiano | | β-lisina | | Rotura de membrana celular | | Imunoglobulina A | | Interfere na aderência bacteriana | | Imunoglobulina G | | Promove fagocitose e fixação de complemento | | Imunoglobulina E | | Ativação de mastócito | | Complemento | | Causa lise bacteriana | Além de representar uma barreira mecânica, as células epiteliais resistem à invasão bacteriana pela fagocitose e digestão de bactérias pelos fagossomos. Células epiteliais estimuladas pela presença de citoquinas facilitam a [resposta imunológica](https://www.google.com/search?q=resposta+imunol%C3%B3gica+olho) e a hipersensibilidade tardia (tipo IV), apresentando antígenos aos linfócitos CD4 (T helper). O rápido ciclo de renovação epitelial da córnea também serve como mecanismo de defesa ocular, por possibilitar a remoção de patógenos que possam estar aderidos ou mesmo já ter invadido as camadas superficiais do epitélio. A córnea e conjuntiva, frente à invasão viral ou na presença de mediadores inflamatórios, ainda secretam interleucina-1 e outras citoquinas inflamatórias que auxiliam na resposta imunológica. * A conjuntiva possui um rico e complexo sistema vascular e sistema linfático, que promovem componentes de defesa imunológica e celular. O epitélio conjuntival e substância própria contêm linfócitos, plasmócitos, mastócitos, polimorfonucleares e células de Langerhans, que estão presentes durante a inflamação. * A córnea, sendo uma estrutura avascular, é praticamente desprovida de células imunológicas. Normalmente, existem alguns linfócitos e células de Langerhans localizados no epitélio e estroma periférico, responsáveis pela apresentação de antígenos para células CD4 (T helper). Células epiteliais, ceratócitos e células endoteliais podem secretar interleucinas e outras citoquinas, estimulando o processo inflamatório. Durante um quadro inflamatório, linfócitos e neutrófilos chegam à córnea através do filme lacrimal, vasos limbares e câmara anterior. ### B– Técnicas de Diagnóstico Ocular * Maria Cecília Zorat Yu, Acácio Alves de Souza Lima Filho, Ana Luisa Höfling-Lima, Paulo José Martins Bispo, Gustavo Barreto de Mello O diagnóstico laboratorial de processos infecciosos inclui análise das amostras do sítio de infecção para esfregaços e cultivo de bactérias, parasitas, fungos e vírus. * Os esfregaços podem ser analisados com colorações variadas na busca de um diagnóstico etiológico e também corados para a realização da citologia da amostra obtida. * Técnicas de biologia molecular estão sendo introduzidas e comparadas às técnicas clássicas, e trazem informações valiosas, com uma abordagem mais atual na interpretação dos resultados. ### Coleta de Material A coleta de material dos processos infecciosos externos oculares para cultura e antibiograma deve ser feita anteriormente ao exame citológico, pois este exige o uso de um anestésico tópico, que possui preservativos capazes de inibir o crescimento bacteriano (Figs. 1A-C). * Para o exame citológico são necessárias três lâminas, para as colorações de Gram, Giemsa e Acridine orange. Mesmo no caso de afecção unilateral conjuntival, preconiza-se a coleta de material dos dois olhos, para comparação dos resultados. ### Coleta de Material: Conjuntiva e Pálpebra **Material necessário:** * Meios sólidos - 1 placa de ágar-sangue, 1 placa de ágar-chocolate; * Meios líquidos - 2 tubos com TSB, para enriquecimento; 2 tubos com tioglicolato, para anaeróbios; * 3 lâminas etiquetadas para cada olho (Gram, Giemsa e Acridine Orange) e 1 lâmina para imunofluorescência (clamídia); * 1 espátula de Kimura e 4 zaragatoas estéreis; * 1 frasco com soro fisiológico estéril, colírio anestésico, lamparina, fita adesiva, álcool metílico. **Procedimento:** 1. Flambar a boca do tubo que contém o soro fisiológico e, em seguida, umedecer a zaragatoa. 2. Raspar a zaragatoa umedecida na conjuntiva e no fundo-de-saco conjuntival. 3. Semear na placa de ágar-sangue, fazendo estrias em zigue-zague. Flambar a boca do tubo que contém o TSB e semear nesse meio. Identificar os tubos com a letra D (para o olho direito) ou E (para o olho esquerdo). 4. Flambar novamente o tubo que contém o soro fisiológico, umedecer outra zaragatoa e repetir a coleta. 5. Semear na placa de ágar-chocolate, fazendo estrias em zigue-zague. Semear no tubo com tioglicolato, sem agitar o meio. Identificar os tubos. 6. Umedecer outra zaragatoa e coletar material da borda palpebral inferior. 7. Semear nas placas "escrevendo" a letra D (olho direito) ou E (olho esquerdo) sem tocar na estria já feita. 8. Repetir os mesmos procedimentos para o outro olho. Vedar as placas com fita adesiva. ### Coleta de Material: Córnea **Material necessário:** * 1 placa de ágar-sangue, 1 placa de ágar-chocolate, 1 placa de ágar-Sabouraud. * 2 tubos com TSB, para enriquecimento e 2 tubos com tioglicolato, para anaeróbios. * 1 frasco com soro fisiológico estéril. * 1 frasco com solução para pesquisa e cultura de Acanthamoeba sp. * 3 lâminas etiquetadas (Gram, Giemsa e Acridine orange). * 1 espátula de Kimura, zaragatoas estéreis, colírio anestésico, lamparina, fita adesiva, álcool metílico. **Procedimento:** 1. O procedimento de coleta pode ser feito com ou sem anestesia tópica, dando-se preferência ao procedimento sem anestesia. 2. Flambar a boca do tubo que contém o soro fisiológico. 3. Com a espátula de Kimura, coletar material do centro e da borda da úlcera, utilizando a lâmpada de fenda para melhor exame. 4. Semear na placa de ágar-sangue, fazendo uma fileira de três letras "C" na placa. Cuidado para não cortar os meios de cultura no processo de semeadura. Flambar a boca do tubo que contém o TSB e semear nesse meio (Fig. 15). 5. Repetir o procedimento de coleta e semear do mesmo modo na placa de ágar-chocolate. Flambar a boca do tubo que contém o tioglicolato e semear, sem agitar o meio. 6. Repetir o procedimento de coleta e semear na placa de ágar-Sabouraud. 7. Repetir o procedimento de coleta e semeadura mais 2 vezes em cada placa (3 séries de "C"). 8. Repetir o procedimento de coleta e colocar o material na solução para pesquisa de Acanthamoeba. Fazer o raspado da córnea em profundidade. 9. Vedar as placas com fita adesiva e mantê-las viradas com a tampa para baixo. ### Procedimentos para Bacterioscopia e Citologia da Córnea 1. Anestesiar o olho. 2. Flambar o tubo que contém o soro. 3. Com a espátula de Kimura, coletar o material do centro da úlcera e fazer o esfregaço no lado esquerdo das lâminas. Com o material coletado da borda da úlcera, fazer o esfregaço no lado direito das lâminas. 4. Esfregar o material nas lâminas, sem deixar grumos. 5. Fixar as lâminas para bacterioscopia (Gram) pelo calor e as lâminas para citologia (Giemsa e Acridine orange) pelo álcool metílico (cobrir com álcool metílico e deixar secar em temperatura ambiente). ### Citologias Conjuntival e Corneana O exame citológico é importante para o diagnóstico de muitos processos inflamatórios e infecciosos da conjuntiva e córnea. A presença predominante de certos tipos celulares ou alterações dessas células estão associadas com alguma doença. O objetivo das citologias conjuntival e corneana é a diferenciação entre as afecções bacterianas, virais, alérgicas, degenerativas ou tumorais. * As principais indicações dos exames de citologia ocular são: úlceras corneanas, conjuntivites hiperagudas ou crônicas, oftalmia neonatal, endoftalmites, síndrome oculoglandular de Parinaud, dacriocistites (micóticas ou bacterianas), blefarites (bacterianas, alérgicas ou micóticas) e tumores. A coleta de material correta é importante para que o resultado obtido represente a realidade. Para se conseguir uma boa coleta de material, deve-se usar um anestésico tópico, preferencialmente sem preservativo, e raspar a conjuntiva tarsal ou úlcera corneana com a espátula de Kimura. Deve-se ainda coletar material equivalente da conjuntiva contralateral para comparação. Os raspados devem ser feitos cuidadosamente para evitar sangramentos. Os esfregaços devem ser feitos esparramando-se delicadamente o material sobre a lâmina, evitando a destruição das células. * Para coleta de material na citologia de impressão, utiliza-se uma membrana de acetato de celulose (Millipore HTTP 0,47 mm, hidrofílica, malha com 0,4 µ) pressionada delicadamente sobre uma superfície específica (córnea ou conjuntiva) que retira as células superficiais por impressão *imprint*, usando-se anestesia tópica. ### Interpretação dos Resultados na Citologia * Células epiteliais normais de conjuntiva e córnea: nas conjuntivites crônicas, as células epiteliais podem apresentar sinais degenerativos, tais como vacuolização, eosinofilia e cariópxicnose. * Células epiteliais queratinizadas e em queratinização: podem ser observadas quando há exposição da conjuntiva, como nos casos de ectrópio, penfigoide ocular, tracoma, eritema multiforme, conjuntivites membranosas e pseudomembranosas. São também observadas nas deficiências de vitamina A, ceratoconjuntivite seca, conjuntivite límbica superior, síndrome de Stevens-Johnson, na irradiação da conjuntiva e das placas epiteliais. * Células caliciformes: são encontradas com maior frequência nas conjuntivites crônicas, especialmente nos casos de ceratoconjuntivite seca e em pessoas idosas ou com problemas reumáticos. * Polimorfonucleares neutrófilos: são encontrados caracteristicamente nas conjuntivites agudas bacterianas. Nas infecções bacterianas crônicas, há associação de reação polimorfonuclear e mononuclear, com predominância de mononucleares, com exceção das infecções por estafilococos, nas quais a predominância é de polimorfonucleares, mesmo nos [estados crônicos](https://www.google.com/search?q=estados+cr%C3%B4nicos+olho). São encontrados também, no tracoma, conjuntivites de inclusão, síndrome de Reiter e eritema multiforme. As infecções micóticas apresentam em geral reação polimorfonuclear, e as infecções virais, raramente (Fig. 16). * Mononucleares (linfócitos e monócitos): são as células predominantes e típicas nas infecções virais da conjuntiva, como as causadas por adenovírus, herpes simples e zóster, verrugas e molusco contagioso. São também predominantes nas conjuntivites por tuberculose, lues e tracoma. * Eosinófilos e grânulos de eosinófilos: constituem um achado anormal, considerado típico das conjuntivites alérgicas, ao lado de polimorfonucleares. Também são encontrados no penfigoide ocular, na conjuntivite parasitária, na alergia a cosméticos e na sensibilidade à atropina, antibióticos tópicos ou seus conservantes (Fig. 17). * Basófilos e grânulos de basófilos: são caracteristicamente encontrados nos processos alérgicos e especialmente na conjuntivite primaveril. Ocasionalmente podem ser encontrados no tracoma. * Células de Leber: são macrófagos grandes, geralmente contendo restos celulares fagocitados encontrados em casos de tracoma. * Plasmócitos: aparecem em casos de tracoma. * Filamentos de muco: aparecem em maior quantidade na conjuntivite seca, nas conjuntivites crônicas e na fase de resolução das conjuntivites agudas. * Fibrina: aparece em quantidade aumentada nas conjuntivites por diplobacilos e por Neisseria catarrhalis, e em pequena quantidade na fase aguda de qualquer conjuntivite. * Células epiteliais multinucleadas: aparecem nas infecções virais por herpes simples e herpes-zóster (3 a 5 núcleos), no tracoma, onde as células são necróticas (5 a 6 núcleos), em casos de tumores e após irradiação. * Corpúsculos de inclusão: podem ser encontrados nas células epiteliais, nas infecções agudas por clamídia (no citoplasma das células) e herpes simples (no núcleo). ### Colorações Usuais **Coloração de Gram (modificada por Hucker)** No método de Gram, a coloração está relacionada à estrutura e [composição](https://www.google.com/search?q=composi%C3%A7%C3%A3o+parede+celular+bacteriana) da parede celular bacteriana. As bactérias Gram-positivas contêm em sua parede um complexo de mucopeptídeo, mucopolissacarídeos e ribonucleático de Mg++, e suas paredes são mais espessas. As Gram-negativas contêm grande quantidade de lipídios e são mais finas. As bactérias Gram-positivas retêm o complexo para iodo rosa anilina formado pelo cristal violeta com o lugol, em sua parede proteica, mesmo após a descoloração pelo álcool-acetona (corando-se em roxo-azulado), enquanto as bactérias Gram-negativas não retêm esse precipitado e tomam a coloração do corante de fundo (fucsina ou safranina) vermelho. O precipitado sai das bactérias Gram-negativas pelo tratamento com álcool usado no processo de coloração, através da parede bacteriana (Figs. 18 e 19). **Coloração de Ziehl-Neelsen** É usada para observação de bacilos álcool-ácido-resistentes, _Micobacterium sp._ e também para a observação de _Nocardia sp._ * A coloração de Ziehl-Neelsen é feita a quente pela fucsina concentrada e as bactérias ácido-resistentes retêm o corante após a descoloração do esfregaço com uma mistura de álcool e ácido clorídrico. Como a coloração de fundo é feita pelo azul de metileno, as bactérias que não são ácido-resistentes tornam-se azuis. **Procedimento** 1. Cobre-se a lâmina com fucsina fenicada e deixa-se por 5 minutos sob aquecimento (utiliza-se uma chama para aquecer os esfregaços). 2. Espera-se esfriar. 3. Lava-se a lâmina com água corrente. 4. Coloca-se álcool-ácido e deixa-se por 2 minutos para descorar. 5. Lava-se com água corrente para parar a descoloração. 6. Acrescenta-se o azul de metileno e deixa-se por 2 minutos. 7. Lava-se com água corrente e seca-se a lâmina com papel de filtro. 8. Observa-se a lâmina ao microscópio, com aumento de 1.000 Χ. 9. Os bacilos ácido-álcool-resistentes (BAAR) apresentam-se corados em rosa, e o fundo do esfregaço, completamente azul. **Coloração de Acridine orange** É uma coloração recomendada para detecção de vários microrganismos, por microscopia de fluorescência, em amostras diretas de material clínico ou não. As estruturas que contêm DNA apresentam fluorescência verde, e as que contêm RNA, de laranja a vermelho (identificam-se apenas formas). **Procedimento** 1. Fixa-se a lâmina com metanol por 5 minutos. 2. Deixa-se secar em posição vertical. 3. Cobre-se com o corante por 2 minutos. 4. Lava-se com água destilada. 5. Deixa-se a lâmina secar em posição vertical. 6. Observa-se em microscopia de fluorescência em aumentos de 100, 400 e 1.000 Χ. * Faz-se primeiramente a pesquisa de fungos, nos aumentos de 100 e 400 X, e, em seguida, a pesquisa de bactérias, com aumento de 1.000 X. Bactérias, leveduras, inclusões clamidiais e cistos de _Acanthamoeba_ fluorescem de laranja a vermelho. Filamentos fúngicos usualmente coram de verde brilhante. **Coloração de Giemsa** A coloração de Giemsa é feita usando um dos derivados do corante de Romanowsky, constituído de uma mistura de eosinatos de azul de metileno, eosinato de violeta e azul de metileno, usualmente dissolvidos em álcool metílico para fixação. A diferença entre os vários corantes derivados do corante primitivo de Romanowsky acha-se na proporção que se emprega o azul de metileno e a eosina, ou no método de tratamento do azul de metileno antes de sua combinação com a eosina. **Procedimento** 1. Cobre-se a superfície da lâmina com álcool metílico, para fixar o esfregaço, durante 5 minutos. 2. Escorre-se o álcool metílico e deixa-se secar espontaneamente, colocando a lâmina em posição vertical. 3. Cobre-se o esfregaço com a solução diluída de Giemsa (1 gota para cada cm³ de água destilada). Deixa-se atuar durante 40 minutos. 4. Mergulha-se a lâmina em uma cubeta com álcool metílico, para retirar o excesso de corante. 5. Deixa-se secar espontaneamente, colocando a lâmina em posição vertical. 6. Observa-se em aumento de 1.000 Χ. ### Pesquisa de Sensibilidade aos Antimicrobianos (PSA) A PSA é realizada para todos os microrganismos identificados, exceto os difteroides que não possuem importância clínica no material de conjuntiva. A suscetibilidade aos antimicrobianos pode ser medida in vitro, utilizando-se princípios de difusão em ágar. O método clássico utilizado para medir a sensibilidade de bactérias isoladas é o de Kirby-Bauer. Os antibióticos diferem na capacidade de difusão no ágar de modo que o tamanho da zona de inibição, e não simplesmente sua presença, é um indicador da suscetibilidade do microrganismo isolado. No método de Kirby-Bauer, suspendem-se as colônias isoladas em TSB até obter uma tur-bidez aproximadamente igual ao tubo 0,5 da escala de MacFarland (os estreptococos devem ser incubados por um período maior que os outros organismos, em razão de seu crescimento lento). * Inocula-se a suspensão, com técnica de esgotamento em duas placas (pequena e grande) de ágar-Müeller-Hinton. Para os cocos Gram-positivos, semelhantes a estreptococos com [hemólise](https://www.google.com/search?q=hem%C3%B3lise+olho), inocula-se a suspensão em três placas pequenas de ágar-sangue e, para diplococos semelhantes a Neisserias e cocobacilos semelhantes a Haemophilus sp., inocula-se a suspensão em três placas pequenas de ágar-chocolate. * Distribui-se os antibióticos começando pela placa menor em forma de círculo na periferia, exceto a rifamicina B, que é usualmente colocada no centro da placa maior, devido ao seu grande halo de inibição e aos antibióticos de identificação que são colocados no centro da placa menor. * Incuba-se por 18 a 24 horas a 37° C. Para os estreptococos a e β-hemolíticos, Neisserias e cocobacilos, a incubação é feita em atmosfera com 10% de CO2. **Relação dos Antibióticos Utilizados na PSA** 1. Amicacina (AMI) - 30 mcg 2. Ampicilina (AMP) - 10 mcg 3. Bacitracina (BAC) – 10 UI 4. Carbenicilina (CAR) - 100 mcg 5. Cefalotina (CFL) - 30 mcg 6. Cefoxitina (CDF) - 30 mcg 7. Ciprofloxacino (CIP) - 5 mcg 8. Clindamicina (CLI) – 2 mcg 9. Cloranfenicol (CLO) – 30 mcg 10. Cotrimoxazol (SUT) - 25 mcg 11. Eritromicina (ERI) - 15 mcg 12. Estreptomicina (EST) - 10 mcg 13. Gentamicina (GEN) - 10 mcg 14. Imipenem (IPM) - 10 mcg 15. Lincomicina (LIN) - 2 mcg 16. Lomefloxacino (LMX) - 10 mcg 17. Neomicina (NEO) - 30 mcg 18. Norfloxacino (NOR) - 10 mcg 19. Ofloxacino (OFX) - 5 mcg 20. Oxacilina (OXA) - 1 mcg 21. Penicilina G (PEN) - 10 UI 22. Polimixina B (POL) – 300 UI 23. Rifamicina B (RFM) - 30 mcg 24. Rifampicina (RIF) - 5 mcg 25. Sulfonamidas (SUL) - 300 mcg 26. Tetraciclina (TET) - 30 mcg 27. Tobramicina (TOB) - 10 mcg 28. Vancomicina (VAN) - 30 mcg ### Interpretação Os tamanhos da zona são comparados com os organismos de referência (tabelados) e o resultado é assinalado [com S](https://www.google.com/search?q=com+S+antibiograma) (sensível), M (moderadamente sensível, ou seja, é suscetível em doses altas) e R (resistente). * Além desse método, utilizam-se os métodos de diluição seriada e do E-Test, para determinação das concentrações mínimas inibitórias, além dos métodos automatizados. ### Pesquisa de Anaeróbias As bactérias anaeróbias são incapazes de se multiplicar na superfície de meios sólidos, na presença de ar. As infecções por anaeróbios no homem podem comprometer qualquer órgão ou tecido do organismo quando as condições são adequadas. Alguns sinais clínicos sugerem a possibilidade de infecção por anaeróbio, como [odor fétido](https://www.google.com/search?q=odor+f%C3%A9tido+olho) das lesões ou secreções, infecção secundária a mordeduras, presença de gás nas secreções, tecido necrosado e gangrena, entre outros. * A maioria dos anaeróbios isolados em amostras clínicas se enquadra na categoria de anaeróbio obrigatório moderado. Esses microrganismos não requerem oxigênio como aceptor final de elétrons e seu desenvolvimento é inibido por este, se o nível de oxigênio passar de 2 a 8%. São encontrados em vários tipos de habitat como parte da microbiota normal. No homem, os anaeróbios predominam normalmente na cavidade oral, ao redor dos dentes, no trato geniturinário e na pele. A maioria desses habitats tem baixa tensão de oxigênio e baixo potencial de oxirredução, resultantes das atividades metabólicas dos microrganismos que consomem oxigênio durante a respiração. **Os anaeróbios de maior incidência são:** 1. Grupo dos _Bacteroides_ (bacilos Gram-negativos): _Bacteroides sp._, _Bacteroides fragilis_, _Fusobacterium sp._ 2. Bacilos Gram-positivos esporulados: _Clostridium perfrigens_ 3. Bacilos Gram-positivos não esporulados: _Propionibacterium acnes_, _Actinomyces sp._ 4. Cocos Gram-positivos: _Peptococcus sp._, _Peptostreptococcus sp._ 5. Cocos Gram-negativos: _Veillonella sp._ **Procedimento** 1. Semear os materiais em placa de ágar-sangue e incubar em jarra de anaerobiose a 37° C durante 7 dias. É necessário verificar se houve crescimento por volta do terceiro dia. 2. Quando houver crescimento em tioglicolato, proceder como no item anterior. 3. Fazer um esfregaço corado pelo Gram. 4. Comparar o crescimento das placas em anaerobiose com o das placas em atmosfera de CO2. 5. Realizar testes para diferenciação de anaeróbios: indol, catalase, lipase, urease, redução do nitrato, motilidade, sensibilidade a determinados antibióticos (kanamicina, vancomicina, colistina), crescimento em bile etc. ### Identificação de Fungos e Leveduras Identificação dos microrganismos que possuem características próprias, por isso são classificados no reino Fungi, e causam doenças denominadas micoses. Existem dois grupos de agentes causadores de micoses humanas: os fungos filamentosos (bolores) e as leveduras (fermentos). * O diagnóstico é feito mediante a demonstração do fungo nos diferentes materiais e pelo cultivo dos mesmos em meios especiais. As infecções oportunistas só podem ser confirmadas após repetidas demonstrações do agente pelo exame direto ou em cultura. ### Micológico Direto O exame micológico direto, se necessário com hidróxido de potássio a 10% (com ou sem tinta nanquin), e as colorações de Gram, Giemsa e Acridine orange permitem a observação de leveduras ou hifas de fungos no material. * As estruturas relatadas são: * Estruturas leveduriformes. * Estruturas leveduriformes sugestivas de _Cryptococcus sp._ * Estruturas leveduriformes sugestivas de _Paracoccidioides sp_. * Estruturas leveduriformes com pseudofilamentos micelianos. * Filamentos micelianos. ### Exame a Fresco - Processamento de Amostras de Biópsias e Fragmentos * Coloca-se o material em placa de Petri estéril e, com auxílio de um bisturi, fraciona-se em minúsculos pedaços ou mesmo leves macerados. * Utiliza-se uma parte do material para a realização de [cultura de fungos](https://www.google.com/search?q=cultura+de+fungos) e outra para a confecção da lâmina. O restante deverá ser colocado em tubo de ensaio estéril. ### Preparo das Lâminas * **Material líquido:** Coloca-se três alçadas do material e cobre-se com lamínula. Observa-se em aumento de 400 X. * **Material viscoso, biópsia ou fragmento:** Coloca-se duas alçadas do material, 1 gota de solução fisiológica e cobre-se com lamínula. Observa-se em aumento de 400 X. ### Exame a Fresco com Tinta Nanquin * É usado para observar cápsulas que envolvem leveduras. Através da tinta nanquim (tinta da China), pode-se proporcionar um fundo negro que evidencia as estruturas celulares com cápsula ("efeito halo"). Por ser muito concentrada, essa tinta deve ser diluída na proporção de 1:3 em solução fisiológica. ### Acridine Orange * Observam-se as estruturas fúngicas em microscopia de fluorescência com aumento de 400 vezes. Esse método é prioritário, por sua sensibilidade. ### Cultura de Fungos * O material clínico deve ser processado [imediatamente](https://www.google.com/search?q=imediatamente+cultura+de+fungos) após a coleta, para permitir que o fungo cresça em meios [apropriados](https://www.google.com/search?q=meios+apropriados+cultura+de+fungos) e na temperatura [adequada](https://www.google.com/search?q=temperatura+adequada+cultura+de+fungos). Seu crescimento é necessário para sua identificação, através das características das colônias e das estruturas microscópicas. **Material líquido:** * Pinga-se diretamente na superfície do ágar-Sabouraud e realizam-se movimentos giratórios na placa, para espalhar o material. **Material coletado com Zaragatoa:** * Semeia-se com movimentos em zigue-zague, diretamente na superfície do ágar-Sabouraud. **Biópsia:** * Coloca-se em placas de Petri estéril e, com bisturi, fraciona-se o máximo possível; adicionam-se algumas gotas de água destilada estéril. * Semeia-se o maior número possível de pequenos fragmentos em ágar-Sabouraud. * As culturas são mantidas em temperatura ambiente. A observação é feita diariamente. Considera-se a cultura negativa se não houver crescimento em até 15 dias. ### Análise do Crescimento em Meio de Cultura Se houver crescimento de fungo filamentoso ou de leveduras, seguir a sequência de identificação. No caso de leveduras, deve-se fazer inicialmente uma lâmina corada pelo Gram, para verificar se é realmente uma colônia de levedura e não um crescimento bacteriano. ### Identificação de Fungos Filamentosos **Análise macroscópica da colônia:** * Observa-se a cor, textura, pigmentos, exsudados, topografia e tempo de crescimento. **Análise microscópica da colônia (microcultivo):** * Semeado em ágar pobre nutricionalmente, como o ágar-batata, o fungo filamentoso produzirá um número maior de conídios, o que facilitará a sua identificação. ### Confirmação do Dimorfismo Se o fungo analisado é suspeito de ser dimórfico, deve-se fazer a conversão da fase miceliana para a leveduriforme. A conversão não precisa ser total para demonstrar o dimorfismo e, muitas vezes, ela poderá ser de difícil realização, necessitando de múltiplos subcultivos e meios especiais. **Procedimento:** * Remove-se, em fluxo [laminar](https://www.google.com/search?q=laminar+cultura+de+fungos), uma pequena porção da colônia e transfere-se para dois tubos de ágar-Sabouraud ou sangue. * Deixa-se um tubo à temperatura ambiente e outro a 37°C. * Observam-se, semanalmente, áreas de crescimento leveduriforme (podem ser necessárias várias semanas para a conversão). Resultado positivo: conversão da forma miceliana para a leveduriforme. ### Identificação de Leveduras São utilizadas várias técnicas que avaliam características morfológicas e [bioquímicas](https://www.google.com/search?q=bioqu%C3%ADmicas+leveduras) para a diferenciação dos gêneros e espécies. A morfologia é primariamente usada para estabelecer o gênero, enquanto a bioquímica para diferenciar as espécies (Fig. 20). **Técnicas que analisam a morfologia:** * **Formação do *tubo germinativo*** * Suspende-se a colônia da levedura em 0,5 a 1 ml de [plasma humano](https://www.google.com/search?q=plasma+humano), em um tubo de ensaio. * Incuba-se a 37°C durante 2 a 3 horas.