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Fattori di Trascrizione Eucariotici Attivano o reprimono la trascrizione = stimolano o inibiscono l’attività della RNA polimerasi Reclutano l’apparato basale della trascrizione Si legano agli elementi enhancer o silencer, rispettivamente attivatori e repressori Negli eucarioti...

Fattori di Trascrizione Eucariotici Attivano o reprimono la trascrizione = stimolano o inibiscono l’attività della RNA polimerasi Reclutano l’apparato basale della trascrizione Si legano agli elementi enhancer o silencer, rispettivamente attivatori e repressori Negli eucarioti interagiscono con componenti del complesso trascrizionale ma non con RNA polimerasi II Richiamano proteine che modificano i nucleosomi per alterare la cromatina in prossimità dei siti di inizio trascrizione Reclutano fattori necessari a rimodellare la cromatina cambiando la spaziatura tra i nucleosomi I fattori di trascrizione legano il DNA o interagiscono con proteine che legano il DNA perché riconoscono sequenze specifiche in questo. Hanno infatti domini di legami al DNA. I fattori di trascrizione sono proteine modulari, con una porzione che lega un sito di legame e un sito che è il dominio di attivazione o repressione della trascrizione. Alcuni fattori di trascrizione, come TCF, non contengono nè il dominio di attivazione nè di repressione, ma hanno un dominio di legame al DNA. È dall’interazione tra due proteine che si forma il fattore di trascrizione per regolare vero e proprio. SEQUENZE CONSENSO Come si è visto per le proteine che legano il DNA in batteri, la regolazione per il riconoscimento della sequenza è molto simile. Anche per i fattori di trascrizione negli eucarioti il legame al DNA avviene nella sequenza consenso. Le sequenze consenso sono state definite con il -10 e il -35 nei batteri. A destra si osserva l’immagine di un’analisi bioinformatica dei siti di legame del TF MEF2. I dati analizzati sono quelli in base alla definizione delle sequenze consenso. Sono state analizzate dunque le sequenze a cui si lega il fattore di trascrizione, e si è ottenuta l’analisi della sequenza consenso, in base alle percentuali di probailità di trovare determinate basi. Quando si ha una sequenza di DNA che può agire da promotore si può predire il legame basandosi su queste matrici, ma poiché sono sequenze consenso con tante basi che possono essere diverse, allora va poi dimostrato in laboratorio che è effettivamente quello il fattore di trascrizione, con il “wet bech”. DOMINI DI LEGAME AL DNA dei fattori di trascrizione presentano dei motivi strutturali tipici e in base alle sequenze di legame al DNA. Andremo a vedere questi cinque che sono i più importanti e comuni. Homeodomain Zinc-finger Leucine-zipper Basic Helix-loop-helix High Mobility Group OMODOMINIO È una sequenza di circa 60 aminoacidi (180bp). È un dominio proteico che serve a legare il DNA. È un dominio che richiama all’helix-turn-helix dei batteri. È formato da tre alpha eliche in cui la prima si inserisce nel solco minore, la terza si inserisce nel solco maggiore del DNA, l’altra è ad essa perpendicolare. Lac Repressor Lambda Cro. Lambda Repressor Fragment La 2 e la 3 formano l’Helix Turn Helix. Ripetiamo come una proteina si inserisce nel DNA generando nuove interazioni senza rompere i legami a idrogeno del DNA. Sono presenti ad esempio Ser, Arg, Asn che sono in grado di formare altri legami a idrogeno con le basi azotate senza andare a rompere i legami del DNA. C’è poi una porzione flessibile nella prima alpha- elica, Arg, in grado di legarsi al solco minore. Non è quindi detto che si leghi solo nel solco maggiore, anche se in linea generale non sono alpha-eliche in questo caso.  C’è una parte esposta verso il solco maggiore, sia una verso il solco minore, in entrambi vengono esposti nuovi donatori di legami a idrogeno. In verde si osserva la proteina. Si osserva il frammento di asparagina con la sua catena laterale, ha un gruppo amminico e un gruppo chetonico, rispettivamente donatore e accettore di idrogeno, andando così a formare due nuovi legami a idrogeno. Si formano nuovi e vari legami deboli, non coinvolgono tutte le basi una dietro l’altra, questo comporta anche la presenza di sequenze conservate e dunque il consenso. È presente in fattori molto importanti per lo sviluppo embrionale ma anche in vari geni legati a patologie come il cancro. Vedremo poi degli esempi come i geni Hox. Molti fattori di trascrizione formano dimeri. Possono essere omodimeri o eterodimeri Ci sono fattori di trascrizione, con omodominio seguito da POU, costituiti anche da un alpha-elica 4. Ad esempio Oct-1 che è un fattore importante per le cellule stainali. Ci sono dunque fattori con più di un dominio di legame al DNA, che non sono assolutamente casuali.  ZINC-FINGER È molto sfruttata per portare proteine in particolari regioni del DNA, in siti specifici. Sono formate da due foglietti ß, un loop e un alpha-elica. Ci sono 2 cisteine nei foglietti beta e 2 istidine nell’ alpha elica che coordinano uno ione zinco. Sono costituiti da circa una ventina di amminoacidi. Le due frecce sono i foglietti beta con le due cisteine, e il cilindro l’alpha-elica con le due istidine. Esistono diversi tipi fattori di trascrizione che coordinano Zinc- Finger. Noi vedremo il C2H2, che è il più comune, più di mille unità di monomeri, sono fattori singoli non dimeri. C’è poi il C4, per ormoni come estrogeni, ecc. sono dimeri C6, che è per il GAL4, con uno Zinc- Finger leggermente modificato per legare ben 2 ioni zinco. Ad esempio GLI1 , del tipo C2H2, regola Sonic Hedgehog composto da 5 Zinc- Finger in tandem, ognuna di questa riconosce sequenze di DNA una dopo l’altra. Il recettore dei glucocorticoidi ha un’alpha elica che si pone perpendicolarmente alla precedente, una nel solco maggiore e una nel minore, del tipo C4 per riconoscere le sequenze corrette.  C6 ha una struttura più estesa e anch’essa forma dimeri come ad esempio in GAL4. Le Zinc-Finger sono messe in tandem perchè ogni alpha-elica che si inserisce nel solco maggiore del DNA, interagisce solo con due basi azotate. Se ci fosse solo un’unica Zinc-Finger allora si legherebbe ovunque. Mettendone invece molte in tandem, ci saranno le basi azotate separate correttamente, il fattore di trascrizione può così riconoscere sequenze varie e specifiche. Con studi confutazionali possono i biotecnologi scegliere l’ordine delle Zinc-Finger e andare a pianificarle per riconoscere una sequenza di DNA che si vuole bersagliare. Vengono così usati come moduli, in quanto riconoscono solo due nucleotidi, permettendo di predire dove andranno a legarsi nel DNA. LEUCINA ZIPPER La cerniera di Leucine è costituita da una lunga alpha elica in cui una regione è formata da leucine, che non legano il DNA, ma formano una struttura idrofobica che lega proteine. Ci sono poi altre alpha-eliche che si inseriscono nel solco maggiore del DNA. Leucine-Zipper è un motivo di dimerizzazione. Struttura “coiled-coil” dove le 2 eliche sono tenute insieme da interazioni idrofobiche. Permette di formare omo o eterodimeri. Leucine-zipper è preceduta da un regione basica ad alfa- elica bZip per il riconoscimento del DNA. Ogni fattore di crescita nella cellula va a richiamare e attivare AP-1, un etemoridimero di Jun e Fos, in cui si trova la cerniera di lucina, si interrompe appena prima di inserirsi nel DNA. Le alpha eliche si inseriscono nel sito maggiore del DNA.  BASIC HELIX-LOOP-HELIX È una variazione del Leu-Zipper. Ha un’elica, una loop, non ordinato, e un’altra elica. La sequenza di leucine è separata dal loop. Sono sempre fattori che agiscono come eterodimeri. Tipico esempio di questo tipo è il fattore di trascrizione MYC, un oncogene che regola il ciclo cellulare che normalmente forma eterodimeri. HIGH MOBILITY GROUP DOMAIN-HMG È un fattore di trascrizione che lega il solco minore. Ha delle regioni ad uncino-AT, in cui l’alpha elica si dispone a sella un po’ come la TBP, che avvolgono il DNA. È un dominio presente in fattori di trascrizioni abbastanza importanti tra cui Sox2 (importante per le cellule staminali) e TCF/LEF (che non ha domini di attivazione o repressione ma lega beta-catenina nella linea di segnalazione cellulare) REGOLAZIONE DAI FATTORI DI TRASCRIZIONE Il fatto di agire come dimeri aumenta notevolmente i modi di agire sulla regolazione genica. Possono infarsi formarsi dimeri differenti con varie modalità di regolazione. Possono essere eterodimeri, omodimeri, ecc. Oltre a collaborare con attivatori, possono in alcuni casi i repressori interagire e interferire con il legame, in base anche alle risposte specifiche che le cellule danno in base agli stimoli dall’ambiente esterno. DOMINI DI ATTIVAZIONE Negli eucarioti non legano direttamente l’RNA polimerasi ma vanno ad interagire con dei componenti del complesso di attivazione della trascrizione, cioè i fattori generali della trascrizione o il mediatore. Si legano a mediatori, TAF (TFIID) e rimodellatori della cromatina. Mediatore Le TAF possono prendere contatto con i domini di attivazione della trascrizione. Non ci sono strutture classiche come quelle che legano il DNA, per questo i fattori di trascrizioni sono catalogati col sistema con cui è caratterizzato il dominio di legame in sè, perchè questo ha struttura conservata. I domini di attivazione o di repressione vanno invece a interagire con queste componenti e non hanno strutture caratteristiche. TAF Rimodellatori Cromatina Ad esempio si osserva l’RNA polimerasi con i GTF, in cui si può vedere l’attivatore che interagisce con le TAF di TFIID.  In questa immagine si osserva invece l’RNA pol, le TAF e il mediatore. Più lontano dal promotore minimo o basale, dove si legano i GTF , ci possono essere elementi regolatori. La cromatina dunque si ripiega perchè possono essere lontanissimi. La parte blu sono i fattori di trascrizione dove si legano i GTF, la parte verde i domini che prendono collegamento con il mediatore o le TAF. Il mediatore è un complesso di tante proteine. I nomi sono vari e diversi, e per grazia ricevuta non li devi sapere. Come funzionano? Sono superfici, domini, proteici che interagiscono e hanno capacità di interagire con proteine del mediatore e di TFIID, e per questo spesso non sono specifiche. Ad esempio GAL4 con un dominio molto forte, è formato da aminoacidi acidi alternati a idrofobici.  Si osserva il mediatore che prende contatto con le porzioni acide del dominio. L’interazione tra l’alfa-elica acida del dominio di attivazione di Gcn4 e Gal11 (Med15) di Mediator permette un’interazione dinamica con diversi orientamenti: complesso indistinto (fuzzy), in cui i cristalli erano spostati. Questo dà la possibilità a Gcn4 di interagire con diverse proteine quando attiva la trascrizione. Forte attivatore della trascrizione. Possono avere varie conformazioni, è molto dinamica, per questo può interagire con più proteine oltre a quella del mediatore. I DOMINI DI ATTIVAZIONE TRASCRIZIONALE consistono di piccole unità ripetute (adesive, sticky) ciascuna dotata di una debole capacità di attivazione. All’aumentare del numero di unità aumenta la capacità di attivazione. Possono interagire con diversi fattori vari fattori. Più aumentano più è forte il legame Il fattore SP1 per esempio è presente con l’apparato basale della trascrizione e nel caso di TATAless, con dunque più efficiente. glutammine. CTF1 invece è ricco in proline. Esistono fattori di trascrizione inducibili, solo quando si lega una piccola molecola espongono il dominio di attivazione, ad esempio che espongono le superfici di interazione solo quando si lega un determinato ormone. REPRESSORI Possono agire in vario modo, non vanno a reprimere in modo diretto l’apparato della tracrizione, non agiscono su mediatore o TFIID, ma possono competere con il legame su uno stesso sito con l’attivatore. Oppure legandosi interagiscono con il dominio di trascrizione. Sopratutto però agiscono andando a regolare i rimodellatori della cromatina.  Analisi Dei Promotori Problema Ho clonato una regione genomica che sta a monte del primo esone di un gene, come dimostro che ha funzioni promotoriali? Quanto è estesa la regione che regola il gene? Si deve comprendere come si analizza un gene promotoriale. Considerando il sito di inizio trascrizione, quanto è estesa la regione che regola l’espressione di quel gene? dove si legano i GTF? enancher e silencer? SITO DI TRASCRIZIONE Per definizione l’inizio del primo esone è il sito di inizio di trascrizione (indicato come +1), dove si legano i fattori generali della trascrizione, compresa l’RNA polimerasi, e dove si legano gli enhancer o silencer, appunto attivatori o i repressori della trascrizione. Bisogna definire esattamente dove inizia questo primo esone. Ci sono database pubblici per dimostrare esattamente dove inizia e dove inizia a trascrivere. Molto spesso si indica con +1 un nucleotide che è un particolare punto in cui inizia la trascrizione, si è visto che in realtà può essere variabile di qualche nucleotide, si segna il più frequente. Vedremo che dipende anche dai promotori, con TATA- box è più preciso, coi TATA-less varia maggiormente. Concettualmente possiamo sviluppare una tecnologia per definire dove inizia ad essere trascritto RNA. Questo perché sappiamo che RNAm viene modificato in 5’ con CAP. Viene aggiunta un 7-metilguanosina con legame fosfoanidridico (5’-5’ link) e dunque può essere rilevato. Solo i messaggeri presentano il CAP, che è un punto di aggancio per i fattori di inizio della traduzione, gli EIF4E. Si parla dunque di geni che vengono trascritti e tradotti, dunque codificanti proteine. RACE = CapFinder Rapid Amplification of cDNA Ends Utilizza PCR per avere abbastanza DNA su cui fare l’analisi, se ho poco DNA non sarà abbastanza sensibile. Bisogna avere cDNA, perchè il sequenziamento si basa sull’analisi di DNA non RNA (non può essere sequenziato direttamente). Dato che so che ha il CAP dunque, so che traduce per una proteina, e posso distinguerlo dagli altri tipi, come il transfer o il ribosomiale. Gli RNA sono poco stabili essendo a singolo filamento, tende a spezzarsi. Se ho molecole spezzate posso andare a vedere da dove inizia e potrei pensare che il sito di trascrizione si trova lì. Bisogna dunque distinguere molecole con il sito di trascrizione e molecole in cui si è spezzato RNA.  Uso enzimi specifici. Ci sono enzimi che possono rompere i legami coi fosfati in base al tipo di legame che si è formato. Per esempio la CIP (Calf Intestine Phosphatae), che abbiamo visto parlando del clonaggio: per evitare che il plasmide si richiuda su sè stesso dopo che lo si è tagliato con un enzima di restrizione, lo si defosforila perchè basta un singolo fosfato per chiudere il filamento, l’altro verrà corretto dai batteri in cui si trasforma il DNA. Lo stesso enzima può essere usato per trattare RNA. La CIP va a rimuovere il fosfato in 5’, in molecole in cui non è presente il CAP. Dunque da RNA messaggero degradato, che si è spezzettato e in un si perde il primo CAP e da RNA che non sono messaggeri. A questo punto non hanno il fosfato le molecole che non si vogliono analizzare, che non ci interessano. Ora ci si concentra sulle molecole che hanno il CAP. Si utilizza l’enzima TAP, una pirofosfatasi, che rompe i legami fosfato- fosfato. Hanno notevole specificità, infatti non rompe i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi. Tutti i messaggeri che hanno al 3’ la coda polyA, vengono rimossi i CAP lasciando esposto il fosfato in 5’. Quest’ultimo è un aggancio disponibile per enzima ligasi, che usa il 5’ fosftato e ossidrile in 3’. Si usano delle molecole dette adattatori, ovvero delle piccole sequenze (15-20 ma anche 5 nucleotidi), sintetiche di cui conosco la sequenza con un fosfato in 5’ e un ossidrile in 3’. A questo punto si ha una sequenza conosciuta, la coda poliA, e dunque si può usare in primo luogo una trascrittasi inversa, per generare cDNA, da cui poi si può fare PCR e sequenziamento. Alla fine dell’adattatore ci sarà il primo nucleotide dell’RNAm. Sull’utilizzo degli adattatori si basano le analisi per sequenziare l’intero genoma. È un concetto molto valido perchè permette attraverso una semplice ligazione di agganciare sequenze a noi noti che si possono utilizzare come punto per sapere dove inizia la sequenza di interesse, sia per avere una sequenza su cui aggiungere i primer e fare il sequenziamento. SAGGIO DI PROTEZIONE ALLA NUCLEASI Si clona un cDNA e ci si chiede: è davvero questo il sito di trascrizione è ce ne è in più? Si ha la sequenza del genoma con i diversi esoni e si ha RNAm. Si usa una sonda che abbia la sequenza del genoma nella regione che si ha clonato. Vi erano frammenti di DNA e cDNA nelle genoteche, quest’ultimo arriva fino a un determinato punto e ci si chiede se quello è davvero il primo esone. È utilizzato un frammento di genoma che comprenda l’inizio del messaggero analizzato. Viene marcato con fosforo radioattivo. Si denatura il cDNA e si va a farlo appaiare con la sonda. In questo modo si può utilizzare nucleasi S1 che può tagliare solo DNA a singolo filamento. Si genera un frammentino piccolo. In base alle paia di basi che avanzano sarpò quanto è lungo. Si fa correre in un gel e si osserva prima e dopo la digestione quanto è lungo il probe, e in base a questo si può ricostruire l’RNA messaggero. La S1 nucleasi taglia solo regioni protrudenti a singolo filamento. Con questo veniva definito il sito di inizio trascrizione. PROMOTORE MINIMO Si vuole ora capire dove si trova il promotore minimo. Si utilizza un plasmide, si prende la regione a inizio del sito di trascrizione e la si clona nel Multiple Cloning Site, a monte di ciò che è detto Gene Reporter. Questi sono geni che producono proteine facilmente rilevabili. Nel caso del promotore i ricercatori vanno in primo luogo a clonare nell’MSC ciò che si pensa possa agire da promotore, e si vede se si attiva il Gene Reporter. Questo viene clonato in un plasmide di clonaggio. I gene reporter andranno poi a tradurre per enzimi come la CAT e luciferasi. Si inserisce nella cellula eucariotica questo DNA. Si formano dei precipitati di DNA che vengono fagocitati dalle cellule. Questo plasmide poi arriva nel nucleo, dove avverrà se il promotore è attivo e ci sono i GTF giusti, la produzione del messaggero e del peptide e di un enzima funzionale. Bisogna utilizzare un enzima per il quale ci sono saggi semplici per rileverà e la sua attività. Si usa un enzima poichè vi è una proporzione diretta tra forza del promotore e la quantità di proteina prodotta, quando si aggiunge il substrato dell’enzima si deve avere qualcosa che permette di avere un prodotto in qualche modo quantizzabile. ANALISI CON CAT CAT (Cloramfenicolo Acetil Transferasi) derivato dal transposone Tn9 di E.coli. CAT modifica il cloramfenicolo con gruppi acetilici derivati dall’acetil-CoA. Si fa entrare il DNA col promotore nelle cellule eucariotiche, si aspettano 48h perchè venga prodotta la proteina, poi si lisano per ottenere l’enzima. Il saggio si basa sull’utilizzo di Cloramfenicolo marcato con C14 radioattivo e Acetil-CoA, si vede poi quanto è stato acetilato. Si produce una miscela di molecole mono- e diacetilate che possono essere risolte mediante cromatografia su strato sottile e rilevate mediante autoradiografia. Concettualmente vuol dire che più cloramfenicolo c’è, più acetilazione c’è.  Si utilizzano lastre per cromatografia su strato sottile e si fa l’analisi. Si usa il cloroformio come eluente. Se non è acetilato si ferma a un livello più basso. Ci sono poi forme diverse di acetilazione, in siti diversi, doppia o singola. Queste si separano per cromatografia. In questo caso si osserva che Nel campione 3 in cui non c’è nulla di acetilato non sarà presente il promotore. Dove ho solo le singole acetilazioni ci sarà promotore debole. Dove ci sono anche quelli acetilati doppi allora ci sarà il promotore forte. Si fa sempre un controllo dove non si ha clonato il promotore, si dovrebbe trovare solo non acetilato, per rilevare così la differenza. Questo metodo non è più utilizzato, ci sono metodi molto più semplici ed efficienti. CHEMIOLUMINESCENZA E FLUORESCENZA La produzione di fotoni viene realizzata attraverso fluorescenza e chemioluminescenza. Entrambi i processi producono fotoni come conseguenza di transizioni di energia da orbitali molecolari in stato eccitato ad orbitali a minore energia. Differiscono su come gli orbitali in stato eccitato vengono creati. Nella chemioluminescenza vengono prodotti da reazioni chimiche esotermiche mentre nella fluorescenza dall’assorbimento di luce. I saggi con fluorescenza hanno maggiore segnale aspecifico di fondo perché i fluorimetri devono discriminare tra un influsso molto alto di fotoni nel campione e l’emissione molto piccola dei fotoni dal fluorocromo. Ciò è ottenuto soprattutto da filtri ottici che limitano i rumori di fondo, dato dalle molecole che compongono un tessuto. La chemioluminescenza ha il vantaggio che, poichè non vengono richiesti fotoni per creare lo stato eccitato, dato che si basa su una reazione chimica di un enzima specifico, questi non costituisco un segnale di fondo quando si misura l’efflusso di fotoni dal campione, c’è così meno segnale di fondo ed è meglio.  Si basa sull’enzima LUCIFERASI della lucciola, che utilizza la luciferina. Utilizza ossigeno e ATP per ottenere la forma attiva ed ossidata della luciferina ed ottenere un fascio luminoso. Emettono una luminosità data da una reazione chimica. Esiste una seconda forma di luciferasi, detta LUCIFERSI DI RENILLA, presente in alcuni polipini. La luciferasi della lucciola è un enzima di 61kD mentre quella del celenterato è di 36kD. Differiscono nei loro substrati e cofattori: luciferasi di lucciola richiede LUCIFERINA in presenza di O2 e ATP e magnesio per produrre luce gialla nel range di 550-570nm. Luciferasi di renilla richiede CELENTERAZINA in presenza di O2, non richiede ATP, per produrre luce blu nel range di 480nm. Se si usano dei filtri si possono distinguere le due lunghezze d’onda. SAGGIO PROMOTORIALE Si ha clonato (preso DNA, tagliato e messo in un vettore plasmidico) a monte della luciferasi della lucciola. Si fa entrare il plasmide all’interno della cellula eucariotica di mammifero, tipo la cellula umana, si aspetta e si fa un estratto proteico. Si aggiunge la luciferina, ossigeno, ATP e magnesio e si va a rilevare in luminometro quanta luce viene emessa. Più luce è emessa più enzima ci sarà. Se il plasmide senza promotore emette la luce a sinistra, quando si usa il promotore che regola i fattori della trascrizione si ottiene quello a destra. C’è forte attività promotoriale. Questo esperimento ha dei limiti. In laboratorio non si ha mai efficienza al 100%. C’è sempre una variabile che non mi permette di confrontare esperimenti diversi. Le cellule acquisiscono DNA in maniera differente. Bisogna normalizzare. Per questo viene utilizzata la seconda forma di Renilla.  NORMALIZZAZIONE Si prende il plasmide e lo si inserisce nelle cellule. Si mischia RNA con DNA che porta la luciferasi di Renilla ma con un promotore ubiquitario che si esprime in modo identico in tutte le cellule. In questo modo essendo un promotore ben conosciuto, se si ha poca attività di Renilla avrò tranfettato poche cellule e viceversa. Posso dunque capire quante cellule hanno recepito il DNA. Si prendono due plasmidi e ci si aspetta di avere corrispondenza, quando si mischiano la cellula fagocita un miscuglio di DNA, con varie molecole, dunque solitamente entrano entrambi. A quel punto si prende il valore ottenuto con luciferasi della lucciola diviso quello con In questi casi ripetendo più volte l’esperimento, non si avrà sempre lo stesso Renilla. valore ovviamente, ci sarà comunque una deviazione standard, ma molto più ridotta, che ci permette così di fare l’analisi statistica. Si fanno entrare in contemporanea il plasmide che esprime luciferasi di lucciola e il plasmide che esprime luciferasi di renilla e si iniziano a fornire la luciferina ed ATP e si forma adenil-luciferina. Dopodiché si forma, con anche ossigeno, adeniloxiluciferina. Si ha così l’emissione del primo segnale luminoso a 550-570nm. Viene rilevato nel luminometro e si tiene il dato. Si aggiunge Celenterazina, che non necessita di ATP e si ha il secondo segnale luminoso. Si hanno così i dati per poter fare il rapporto. Come si fa un vettore di clonaggio per questi? AmpR, Ori, MSC, Gene per Luciferasi. Segnale di Poliadenilazione di derivazione virale, poi può avere sistemi di selezione per quando si vogliono generare cellule non transfettate con ad esempio il gene Neo. ENANCHER Vogliamo analizzare solamente l’attività di un enancher. Ci sono promotori simili ai precedenti già caratterizzati con la TATA box. Si va a porre solo l’elemento che si vuole andare ad analizzare. Si può utilizzare un promotore sintetico dunque, che non sia solamente con gli elementi minimi, ossia gli elementi del genoma che legano i fattori generali della trascrizione. Si vuole poi andare ad analizzare qualcosa di specifico. Nel plasmide senza il clonaggio dell’elemento mi aspetto comunque di vedere qualcosa, perchè ho fornito gli elementi per l’attività dell’RNA polimerasi. Mancano poi degli altri fattori che lo rendono un promotore forte.  Supponiamo di avere clonato questo gene e si è osservato che ha una determinata attività promotoriale. Come determini le sequenze responsabili della regolazione della trascrizione in un promotore? Normalmente si prendono le paia di basi e vengono tagliate in frammenti sempre più piccole, per controllare l’attività del promotore. Si definisce ad esempio che il promotore minimo è in una sequenza ridotta. Si analizza poi l’attività della luciferasi anche in questo caso. Dall’altro lato si possono fare delezioni solo da una parte, per andare a studiare quali elementi sono chaive per l’espressione del gene, e andare a predire quali fattori di trascrizione si possono andare a legare. Come si generano le delezioni? Ci sono vari modi: Trattare con ESONUCLEASI che tagliuzza e la si ferma a tempi diversi, si richiude poi il plasmide e ci saranno varie sezioni casuali. Per capire quanto ha mangiato, si fa sequenziamento usando un primer e si legge dove ci si trova. SITI DI RESTRIZIONE SPECIFICI effettuando una delezione ben precisa studiando le matte di restrizione PCR si disegnano primer in vari punti e si clona l’elemento in un altro plasmide vuoto. Problema: Come identifico i siti dove si legano la RNA polimerasi ed i fattori di trascrizione? FOOTPRINTING Si utilizzano delle DNAasi che digeriscono il DNA dove non è protetto dalla proteina, come DNAsi micrococcica. Viene tagliato il DNA a singoli nucleotidi. Si mette il DNA in presenza di estratti nucleari con fattori generali della trascrizione ecc. che si legherà o perchè ne avranno la possibilità. Taglio poi con DNAsi e lo analizzo con elettroforesi su gel di poliacrilamide. Questa forme maglie strette ci permette di distinguere frammenti di DNA che distinguono anche per un unica base. Se il DNA è libero si vede una scaletta, in quanto ci sono tempi precisi in cui si lascia digerire. Con DNA a pesi molecolari che si distinguono per un’unica base. Se il DNA ha la proteine non verrà digerito. Si prende DNA sintetico marcato con fosforo 32 radioattivo, si fanno legare le proteine poi si tratta con DNAsi 1. Si vanno poi a separare i frammenti generati con un’elettroforesi e si osserva dove il DNA è stato protetto per la presenza di proteine. Questa metodologia ha permesso di mappare regioni che legano fattori di trascrizione utilizzando estratti nucleari o proteine ricombinanti. Definita una regione ad attività promotoriale, come identifico i siti dove si legano i fattori di trascrizione? Una delle prime cose che vengono fatte è un’ANALISI BIOINFORMATICA. È possibile dare in pasto la sequenza a dei software, subito si interpreta che questo è complesso. Uno dei software per studi promotoriali più usato è TRANSFACT. I siti per i fattori di trascrizione non hanno sequenze ben definite, ma ci sono SEQUENZE CONSENSO che sono conservate anche se possono variare in parte, possono variare alcune basi in particolare quelle che non interagiscono direttamente con la proteina. Il software quando identifica queste sequenze di sei nucleotidi, li rileva come siti di taglio di enzimi di restrizione come ColiE1. Nel caso dei fattori di trascrizione è più complicato, oltre alla sequenza bisogna andare a considerare il peso, la probabilità, con cui si possono trovare determinate bas in una posizione (all’interno della sequenza consenso ci sono basi più conservate e basi meno conservate). Ad esempio, T iniziale non sempre è presente, ma bisogna tenere conto di tutti i diversi pesi identificati dai ricercatori. Il software viene aggiornato continuamente in base alle nuove informazioni sui fattori di trascrizione, e vengono modificati i pesi delle diverse posizioni rilevate.  Il software prende in considerazione più di 7 mila fattori di trascrizione e circa 15 mila siti di legame; Match ci permette di andare a fare un match tra la sequenza e il possibile fattore di trascrizione ☆ Si può scegliere se minimizzare i falsi positivi e i falsi negativi: in questo modo si è molto più stringente con la Si inserisce la sequenza matrice e un po’ meno che si vuole analizzare. nei pesi percentuali delle basi. * Si può anche specificare e definire l’interesse per i fattori specifici di alcuni organismi come vertebrati, batteri o della Drosophila. Si può anche specificare il tipo cellulare da cui deriva la sequenza DNA oggetto di indagine. Ci esce una tabella grande e dettagliata dalla quale poi andranno selezionati gli elementi da studiare. Sicuramente può darci una prima idea dei fattori he possono legarsi e come indirizzare la ricerca in laboratorio. I lavori in laboratorio sono giorni e giorni di sperimentazion e, e per questo è utile ridurre i tempi.  TRASFEZIONE Gli esperimenti si basano inizialmente sulla trasfezione in cui lipidi cationici possono garantire la fagocitosi del plasmide nella cellula. Se si stannno studiando i adipociti per esempio, la prima cosa da fare è utilizzare le cellule in cui il gene viene espresso, dato che ci sono cellule che esprimono determinati geni e altri no. Consideriamo di avere tre tipi cellulari. Si sa che nell’organismo studiato il gene viene espresso in tessuti che contengono le cellule verdi. Se si trasferta con il promotore che controlla la luciferasi, viene transfettato il plasmide nella cellula verde che esprime i fattori di trascrizione e quindi permette l’espressione. Sopratutto esprime anche dei fattori di trascrizione in grado di legare gli enancher che rendono la trascrizione veramente rilevabile. Si può poi provare a utilizzare lo stesso costrutto nella cellula blu e nella cellula rossa. In questo caso mi aspetto di avere un’attività di luciferasi veramente bassa, perchè normalmente il gene non è espresso qui, magari perchè hanno un repressore specifico per la trascrizione di questo gene. A questo punto si osserva dopo aver inserito il fattore in TRANSFACT, che viene trascritto maggiormente nelle cellule verdi piuttosto che blu e rosso, posso dunque ipotizzare che questo ha espressioni specifiche. Se si aggiunge alla cellula rossa un plasmide per il fattore di trascrizione, che ho osservato in TRANSFACT, può arrivare a trascrivere la luciferasi anche la cellula rossa. La cellula verde ha un fattore di espressione blu non espresso nella rossa, perchè è un adipociti che esprime solo alcuni geni specifici. Prendo una cellula che non centra niente con gli adipociti, e non vedo espressione. Posso però tranfettare insieme un plasmide per l’espressione del fattore blu, e un plasmide per l’espressione del fattore insieme la gene di interesse, se è davvero importante per quel promotore allora mi permetterà di vedere espressione. Il fattore blu vuol dire dunque che regola l’espressione tessuto specifica per quel determinato promotore. Il plasmide blu, di cui si fa il clonaggio del cDNA per il fattore di trascrizione ha: il suo promotore eucariotico (plasmide studiato con il promotore basale del gene dell’ actina di pollo ed enancher virale), un ATG ottimizzato con un consenso di Kozak e a valle il sito di poli-adenilazione. Si è dimostrato che il fattore di trascrizione è importante per l’espressione del gene nell’adipociti. Non si ha però dimostrato che lega l’elemento identificato con Trasnfact. Bisogna dimostrarlo. Dato che si conosce la sequenza consenso, osservo di avere una base al 100% T, che se viene cambiata non permetterà l’attacco dei fattori di trascrizione, in quanto modificata. Molto probabilmente cambiandola vado ad interferire con il legame, inq emanato è una delle basi che interviene nei legami a idrogeno con i fattori di trascrizione. Dopo aver osservato il consenso dunque determino le basi importanti per il legame con il fattore di trascrizione. Se fornisco il wild type osservo la trascrizione, se fornisco un fattore modificato anche solo di una di queste basi importanti, non dovrei vedere trascrizione, se davvero l’elemento in cui si lega è quello identificato con l’analisi informatica. Per MUTAGENIZZARE: - si prende un primer, si mette la mutazione verso il 5’, perché la maggior parte del primer si appaia verso l’estremità 3’ del DNA; - si replica il DNA si formano molecole si DNA a doppia elica che possono essere emimetilate. Il DNA si è preparato dal batterio, organismo che metila il DNA subito dopo la replicazione. La parte di DNA sintetizzata in vitro non è metilata; - Si utilizza un enzima che taglia solo la catena di DNA metilata e si elimina il wilde type, conservando la parte mutagenizzata. Con questo si è dimostrato che quel particolare elemento è probabilmente una sequenza molto importante per questo gene negli adipociti. Il legame diretto della proteina con il DNA non è ancora stato dimostrato. Ho dimostrato solo che probabilmente è legato da questo fattore di trascrizione. Bisogna dimostrare il legame diretto, utilizzando degli e sperimenti completamente in vitro, sintetici. EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay La sequenza mutagenizzata è quella gialla, quella che con TRANSFACT risulta essere la sequenza a cui si lega il fattore di trascrizione blu. Si va a far sintetizzare dalle aziende che sintetizzano oligonucleotidi, due oligonucleotidi che contengono la sequenza di 6 paia di basi. Questi sono complementari e formo una breve sequenza di DNA a doppio filamento. I fattori di trascrizione di fatto riconoscono i doppi filamenti. Si utilizzano piccole provette in cui si trova la proteina mutante, con il fattore di trascrizione e la purifico (Ptirex è il vettore di clonaggio studiato). Osservo così se il DNA si lega alla proteina. Si hanno quantità molto piccole di DNA radioattivo, marcato con fosforo radioattivo. Si osserva la proteina modificata in rosso. Nel momento in cui il DNA si lega alla proteina, in elettroforesi, il complesso è molto più pesante e si ferma prima. Si può fare ad esempio in poliacril amide gel verticale. Se si ha l’oligonucleotide da solo, questo migra in un certo modo, con la proteina si complessa e viene ritardato in quanto più pesante. Si fa poi una competizione per dimostrare il legame diretto. Si prende un oligonucleotide freddo, non radioattivo, e se ne inserisce 100 volte tanto. Questo catturerà la proteina, dato che si vedono solo i radioattivi non si dovrebbe più vedere ritardato rispetto alla proteina, L’ultima prova è usare un oligonucleotide con il sito di trascrizione mutagenizzato. Nella provetta ci saranno solo proteina e DNA e si va a dimostrare che il fattore di trascrizione lega proprio quell’elemento promotoriale. Abbiamo detto che la proteina è purificata anche se in realtà è un processo complesso e di solito si usa un estratto in generale delle cellule da cui si ottiene, in cui ci sono vari fattori di trascrizione e in cui si osservano più di una banda. Il competitore wilde type già alle più basse concentrazioni mostra competizione. Il competitore mutagenizzato può legare appena un po’ di fattori di trascrizione ma comunque c’è una competizione molto bassa. C’è sempre una certa percentuale che non viene mutagenizzata e che quindi da competizione. Questo avviene in vitro, forzando l’avvicinamento di proteine purificate, favorendo l’avvenire di legame che in un nucleo in vivrò avvengono più raramente. Si va a un livello superiore di analisi, e bisogna dunque andare ad analizzare efettivamente se questo avviene nel nucleo, attraverso: IMMUNOPRECIPITAZIONE DELLA CROMATINA Si vuole indagare se due molecole interagiscono e hanno formato un complesso, dunque se la proteina in un nucleo è davvero legata al promotore. L’immunoprecipitazione si utilizza molto in laboratorio. In generale: Consideriamo due proteine A e B, che immagino formino un complesso. Per dimostrarlo è semplice utilizzare un anticorpo che lega ad esempio al proteina A. Se legata alle sferuline di separosio attraverso l’anticorpo, si può separare. Se la proteina A è legata alla B, allora purificherò anche la B. Se vi è anche una proteina C non legata invece, non sarò in grado di separarla. In fondo alla provetta si otterrà il complesso di anticorpo, sferulina, A e B. A questo punto per dimostrare che A e B sono legate, si fa un’elettroforesi, si separano le proteine e otterrò una proteina A e una proteina B. Si utilizza un altro anticorpo che si lega a B, ed è o fluorescente o ha un enzima che permetta di evidenziarla, per osservare che era legata ad A. Si chiama co-immunoprecipitazione. Infine si analizza con il Western Blotting. Concettualmente questo processo con la cromatina in particolare è molto simile. Si hanno le cellule con la cromatina, nel nucleo ci sono i fattori di trascrizione legati in determinati punti. Si fa un lisato, si ottiene la cromatina e la si spezzetta in vari punti grazie a sonificazione con ultrasuoni. Si aggiungono gli anticorpi che si legano alla proteina blu. C’è il DNA legato alle proteine, lo si purifica e poi lo si analizza. Durante la sonificazione c’è il rischio che si spezzino anche i legami con le proteine però, bisogna dunque stabilizzare questi legami per poter fare le altre operazioni con facilità. Si utilizza formaldeide. La formaldeide, nel caso di due proteine, forma un intermedio , base di Shiff, con la lisina e poi dei legami covalenti tra i residui aminoacidici. Forma legami crociati tra proteina. Nel momento in cui si formano questi legami non si riescono a risolvere (dunque non si usano nella coimmunoprecipitazione per proteine) Come mai si usa in questo caso allora? Così si formano legami crociati tra proteine e DNA. Così si formano legami stabili con la cromatina, che possono essere rotti alla fine dell’esperimento. Il gruppo amminico della lisina deve essere vicino al gruppo amminico della citosina, almeno di 2Å.  Dunque tratto le cellule con formaldeide, nei punti in cui riesce, senza selettività, sia tra proteine che tra proteine e DNA. Si può poi spezzettare la cromatina con ultrasuoni e ho vari frammmenti legati alle proteine. Aggiungo l’anticorpo che si lega alla proteina di interessa. Possono dunque immunoprecipitare con il DNA legato alle proteine. In soluzione acida posso rompere il legame crociato tra proteine. Vado poi a fare una PCR. Si disegnano due primer, sul filamento superiore e inferiore nella regione genomica che ho trovato con Tranfact, a distanza di 100-50bp, che deve contenere all’interno l’elemento di interesse. Vado a vedere quali geni posso amplificare. Infine si fa un’analisi sul gel. Questo ci dice che il nostro fattore di trascrizione è legato all’elemento promotoriale in vivo, e non solo in vitro. ATAC = Assay for Transposase Accessible Chromatin Quest’ultima tecnica va alla ricerca di regioni di cromatina rilassate. Bisogna andare a vedere quali loci si trovano con queste regioni aperte. Sono regioni aperte in cui i nucleosomi sono separati, in cui deve esserci uno spazio accessibile ai fattori di trascrizione. Per distinguerle dalle regioni chiuse si possono sfruttare i TRASPOSONI. Questi hanno la caratteristica di mettersi nel genoma in maniera casuale, non hanno un indirizzo preciso. Questo processo non è chiaramente totalmente casuale, se una regione è molto impacchettata è chiusa, la trasposasi non ha lo spazio per inserire il trasposone. Da questo conoscenze è stato progettato un fago ATAC= assay for transposase- accessible chromatin with sequencing. Una volta fatto il taglio da parte della trasposasi il trasposone si attacca con OH , con reazione di transesterificazione e ripiegamento a forcina per poi inserirsi attaccandosi alla sequenza. Si inserisce il sistema trasponibile, che va a finire nello spazio tra gli istoni. Dove c’è invece eterocromatina impaccata non avrà lo spazio di inserirsi e dunque non ci va. Nel trasposone ci sono sequenze caratteristiche conosciute e dunque quando si va a frammentare la cromatina, vengono aggiunti dei primer che abbiano le sequenze a 5’ e 3’ del trasposone. Faccio la PCR e vado a ricercare delle regioni nel genoma che posso andare a integrare il trasposone. DIMOSTRAZIONE CHE UN ELEMENTO PROMOTORIALE CONTROLLA LA SPECIFICITÀ TISSUTALE Generazione di topi transgenici con il promotore da analizzare a monte del gene LacZ o GFP Iniezione di virus che contengono il promotore da analizzare a monte del gene reporter nell’organo di interesse.