Biologia Molecolare 7.1 PDF

7.1 biologia molecolare 7/11/23 La professoressa sottolinea l’importanza di sapere che cos’è un gene e di conoscere il concetto di meccanismo on-off, che potrebbero essere inseriti come domande d’esame. REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI IMPORTANZA DELLA REGOLAZIONE DI TRASCRIZIONE DEI...

7.1 biologia molecolare 7/11/23 La professoressa sottolinea l’importanza di sapere che cos’è un gene e di conoscere il concetto di meccanismo on-off, che potrebbero essere inseriti come domande d’esame. REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI IMPORTANZA DELLA REGOLAZIONE DI TRASCRIZIONE DEI PROCARIOTI La regolazione di trascrizione nell’organismo procariote dimostra una situazione particolare e unica che è di interesse nell’ambito delle professioni sanitarie. Conoscere questi meccanismi è di necessaria importanza non solo per la difesa del paziente da infezioni batteriche, ma anche per il mantenimento dell’equilibrio fisiologico tra il suo organismo e la flora batterica con la quale vive in simbiosi. Sono infatti diffusi organismi procarioti in vari siti dell’essere umano (7 kg nell’intestino): nel caso questa flora batterica prendesse il sopravvento si passerebbe da uno stato simbiotico ad un’infezione. Dunque, la conoscenza dell’organizzazione e del funzionamento degli RNA messaggeri nei procarioti è un mezzo efficace per un intervento terapeutico. MECCANISMO DI REGOLAZIONE Per quanto riguarda la regolazione dell’efficienza della trascrizione, i procarioti sono influenzati dall’ambiente esterno in cui vivono. Questo infatti ha la capacità di attivare o meno l’attività dell’RNA polimerasi, in quanto costituisce l’unica fonte di energia per la popolazione batterica. A seconda che l’ambiente esterno abbia al suo interno alimenti, ioni, sali si innescano cicli metabolici ben precisi che attivano le cascate trascrizionali specifiche. Ad esempio, se gli enzimi di una stessa via metabolica sono organizzati a livello genico in operoni, risulta molto efficace l’innesco della trascrizione nel caso in cui risulti necessario attivare quella via metabolica. La regolazione è semplice e in genere consiste in un meccanismo di on/off. Si tratta di un meccanismo che di per sé è estremamente elementare, ma rappresenta l’esempio canonico per poter comprendere il funzionamento di meccanismi naturali molto più complessi. Se nell’ambiente esterno c’è il metabolita che deve richiede una determinata cascata chimica per la propria catalisi, allora si attiva la trascrizione dei geni necessari ad effettuare questa precisa via metabolica. Inoltre, esistono delle sequenze più fini che permettono la regolazione dell’attività trascrizionale della RNA Polimerasi. Per capire il concetto, però, bisogna analizzare più nel dettaglio la struttura molecolare della regione definita operatore. Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 STRUTTURA DELL’OPERATORE L’operatore si localizza nel mezzo della TATA box e della sequenza -35 e viene riconosciuto da una molecola specifica detta repressore. REGOLAZIONE NEGATIVA: Se il repressore è presente nel citoplasma della cellula batterica, esso riconosce con altissima affinità il proprio sito di legame al livello del promotore, vi si lega e crea un ingombro sterico sul DNA tale da impedire il legame dell’RNA Polimerasi al promotore. REGOLAZIONE POSITIVA: Se la cellula batterica ha necessità assoluta e impellente che vengano trascritti i geni dell’operone, instaura un sistema tale per cui viene sintetizzata una molecola detta attivatore che si lega in una regione a monte del promotore, permettendo un diretto contatto molecolare con l’RNA Polimerasi e quindi creando uno stimolo positivo all’attività trascrizionale dell’RNA polimerasi. In questo modo aumentano i livelli trascrizionali. Qualora non ci fossero né repressore che attivatore la trascrizione dell’operone avverrebbe comunque, in quanto in un sistema vivente non può esserci un’assenza totale di trascrizione dal momento che esiste sempre su ogni singolo gene un livello basale di trascrizione, questo poi potrà essere totalmente represso o aumentato. MECCANISMO ON-OFF NELL’OPERONE LAC L’operone che normalmente viene portato ad esempio è quello del lattosio in quanto presenta la struttura classica dell’operone. Nell’operone del lattosio sono presenti tre enzimi implicati nell’endocitosi del lattosio dall’ambiente esterno a quello interno della cellula batterica e sono presenti anche gli enzimi necessari al catabolismo di questo disaccaride. La struttura dell’operone lac presenta sia un sito operatore a livello del promotore che viene legato dal repressore, sia un sito CAP, che lega l’attivatore. Il lattosio normalmente non è la fonte principale di nutrimento dei batteri. Infatti normalmente i batteri si nutrono di glucosio. Perciò, se nell’ambiente esterno è presente glucosio, l’operone del lattosio è espresso a livelli bassissimi, poiché i batteri non hanno necessità di un’altra fonte di energie e dunque nemmeno di metabolizzare il lattosio. Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 Infatti, se nell’ambiente esterno è presente in abbondanza il glucosio, per evitare uno spreco di energia, i batteri reprimono la trascrizione dell’operone lac, mediante una molecola repressore che va ad occupare il sito operatore, impedendo totalmente la trascrizione dell’operone. Nel momento in cui però nell’ambiente extracellulare compare il lattosio, esso si lega al repressore e lo allontana dal sito operatore e la RNA polimerasi è libera di trascrivere l’operone. Tuttavia, nel caso in cui il glucosio risulti in concentrazioni basse e il lattosio rappresenti l’unica fonte di energia, è necessario incrementare il livello di trascrizione. Viene dunque attivato un enzima detto “adelinato ciclasi”, che sintetizza, a partire dall’ATP, un secondo messaggero detto cAMP (adenosinmonofosfato ciclico). Tale molecola è in grado di essere prodotta in modo semplice e viene sfruttata per inviare messaggi veloci sia in procarioti che eucarioti. Perciò, in caso di livelli bassi di glucosio, in maniera immediata viene attivata l’adelinato ciclasi che riesce a produrre grandissime quantità di cAMP. Quest’ultimo si lega a una proteina detta CAP (Catabolite Activator Protein). Il complesso formato dal cAMP e dalla proteina CAP si lega al sito attivatore situato sul promotore del lattosio, stimolando in maniera efficiente l’attività dell’RNA Polimerasi.z ATTENUAZIONE Inoltre, viene considerata come meccanismo di regolazione anche l’attenuazione. Tale processo sfrutta il fatto che i processi di trascrizione e di traduzione negli organismi procarioti avvengano simultaneamente e sfrutta la disponibilità nei ribosomi degli amminoacidi per i quali i singoli codoni codificano. La trascrizione comincia a livello del sito d’inizio dell’operone, ma si ha una terminazione prematura della trascrizione. Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 ORGANIZZAZIONE DEL GENE EUCARIOTA All’interno di un gene eucariote troviamo: L’ORF (Open Reading Frame) si intende una porzione di DNA compresa tra il codone di inizio e il codone di STOP di un gene codificante per una determinata proteina. Il promotore, zona che precede ORF. Si tratta della regione dove prende contatto l’RNA polimerasi per trascrivere il gene stesso. ORF è preceduta e seguita da sequenze non tradotte, denominate UTR (Untranslated Regions). A monte troviamo una sequenza 5’ UTR e a valle una sequenza 3’ UTR. Al 3’ UTR sono presenti molti siti di legame per piccoli RNA regolatori (in particolare il microRNA) che vanno a influenzare l’espressione di un dato messaggero. Tale regione viene sempre trascritta dalla RNA Polimerasi ed è molto spesso il sito di riconoscimento per gli RNA corti a funzione regolatoria che influenzano l’efficienza traduzionale di un RNA messaggero. Invece la regione 5’UTR, a livello dei messaggeri, è legata dai fattori di inizio di traduzione. Gli RNA messaggeri che ne sono privi, vengono tradotti in modo meno efficace: ciò denota che la regione 5’ UTR non tradotta è essenziale per una produzione efficiente di un RNA messaggero da parte della macchina ribosomiale. Al momento della trascrizione ciò che viene trascritto dall’RNA Polimerasi all’interno del nucleo è un Pre-RNA messaggero, che presenta al suo interno regioni codificanti e non codificanti alternate (esoni e introni). In seguito il Pre-mRNA va incontro a processi post-trascrizionali come il capping, la poliadenilazione e lo splicing. Quest’ultimo processo porta all’eliminazioni degli introni ottenendo così una forma matura, pronta per l’esportazione nel citoplasma. All’interno del citoplasma delle cellule eucariote ci sono numerosissimi tipi di RNA e di fatto gli mRNA che codificano per i prodotti proteici costituiscono soltanto 3% dell’RNA totale. Dati i numerosi tipi di RNA, ognuno di questo sarà trascritto da una RNA Polimerasi specifica. Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 FUNZIONAMENTO DEL MECCANISMO DELL’RNA POLIMERASI II L’RNA Polimerasi II ha il compito di trascrivere e sintetizzare RNA messaggeri che codificano per codoni proteici e alcune molecole di RNA regolatori non codificanti (tra cui il microRNA) fondamentali per la modulazione e il controllo dell’espressione genica. Nella cellula eucariote la trascrizione avviene in più siti di inizio lungo il cromosoma e il sito di aggancio dell’RNA Polimerasi al DNA è in corrispondenza dei promotori. DIFFERENZE DELLA DNA POLIMERASI TRA EUCARIOTI E PROCARIOTI Rispetto alla cellula procariote, negli eucarioti i macchinari enzimatici per la trascrizione sono più numerosi e i promotori eucarioti hanno una componente prossimale al gene e una distale, lontana anche decine di migliaia di bp dal gene. La componente distale viene legata da proteine specifiche che riescono a influenzare l’attività dell’RNA Polimerasi. La numerosità dei macchinari enzimatici nella cellula eucariote è anche causata dal fatto che l’RNA Polimerasi degli eucarioti richiede proteine accessorie estremamente funzionali al corretto funzionamento dell’enzima stesso, denominate fattori generali della trascrizione. Il macchinario proteico della trascrizione è composto da: RNA Polimerasi (ci si concentrerà sull’RNA Polimerasi II) Fattori Generali della Trascrizione Attivatori, Repressori, Co-attivatori Fattori di trascrizione Le RNA Polimerasi hanno strutture molto simili perché devono affrontare la stessa funzione: denaturare il DNA a livello della bolla di trascrizione e sintetizzare un legame fosfodiestereo tra i ribonucleotidi che entrano nel sito catalitico. La differenza sta nella struttura che possiede l’RNA Polimerasi II, la quale è caratterizzata da un’estremità carbossiterminale che ha una conformazione disordinata e che protrude dal nucleo dell’enzima. Questa ha un ruolo essenziale non solo nel processo di trascrizione ma anche per attivare le modificazioni post-trascrizionali a cui è soggetto il Pre-mRNA. Nonostante l’RNA polimerasi eucariote sia strutturalmente molto simile a quella procariote, ha delle importanti differenze: La RNA Polimerasi II negli eucarioti deve affrontare la struttura della cromatina (su cui avviene la trascrizione) -che risulta estremamente compatta- risolvendo l’ingombro sterico formato dai nucleosomi. La RNA Polimerasi II degli eucarioti, a causa della sua incapacità di trascrivere un gene in autonomia, richiede un gruppo di proteine aggiuntive, chiamate fattori generali della trascrizione (nei procarioti invece il meccanismo avviene in autonomia) Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE La RNA polimerasi II negli eucarioti ha bisogno, per attivare e procedere con il processo di trascrizione, dei fattori generali della trascrizione. Il loro acronimo è TFII (Transcription Factor II) perché sono altamente specifici solo per l’RNA Polimerasi II. Essi si legano e riconoscono in maniera specifica tutti i promotori a cui si lega a sua volta l’RNA Polimerasi II e per questo sono chiamati generali. Sono estremamente importanti e svolgono numerose funzioni: 1. Aiutano L’RNA Polimerasi a riconoscere e a posizionarsi nella corretta regione del promotore, quindi nel punto di inizio della trascrizione; 2. Aiutano l’RNA Polimerasi a posizionarsi in corrispondenza del nucleotide da trascrivere; 3. Contribuiscono alla denaturazione della doppia elica di DNA, per formare la bolla di trascrizione; 4. Contribuiscono al “firing”, il processo di accensione del meccanismo di trascrizione Perciò quando si parla di complesso polimerasico si intende un complesso composto dall’RNA Polimerasi II e dai fattori generali di trascrizione. L’RNA Polimerasi II è per questo considerato un oloenzima: un complesso poliproteico formato da diverse subunità, fondamentali per la sua funzione. STRUTTURA DEL PROMOTORE EUCARIOTICO Il promotore tipico procariota è formato da due moduli: una TATA box situata a -10 nt e una sequenza più distale che si trova circa a -35 nt rispetto al sito di inizio, e al centro tra le due il sito operatore. Nel lievito, la cellula eucariota più semplice, c’è un doppio modulo di riconoscimento cioè una TATA box sempre prossimale al sito di inizio della trascrizione, un’altra sequenza di attivazione più distale (100-200 nt di distanza) che è essenziale affinché un gene sia riconosciuto dalla RNA Polimerasi. Il promotore viene definito promotore minimo. Nei promotori della RNA Polimerasi II delle cellule eucarioti superiori le sequenze di regolazione sono presenti anche a valle del punto di inizio di trascrizione; questo perché molecole che intervengono nell’attività dell’RNA Polimerasi si espandano a cavallo del punto di inizio della trascrizione al fine di influenzare l’efficienza dell’RNA Polimerasi II. Anche qui la TATA box è presente insieme a un elemento ricco di C-G prossimo alla TATA box. È da considerare il fatto che a livello dei geni dell’organismo eucariote ci sono elementi distali (anche decine di migliaia di bp) che influenzano positivamente o negativamente l’attività dell’RNA Polimerasi. Essi sono formati da sequenze dette: Silencers: sequenze che vengono legate da proteine con attività repressiva nei confronti dell’RNA Polimerasi (repressori). Enhancer: sequenze che vengono legati da proteine con attività attivatrice nei confronti dell’RNA Polimerasi (attivatori). Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin 7.1 biologia molecolare 7/11/23 LOOPING Ma come sequenze così lontane dal punto di inizio della trascrizione riescono a influenzare l’attività catalitica dell’RNA Polimerasi? Ciò si spiega con l’avvolgimento del DNA, detto looping. Infatti il DNA assume una struttura tridimensionale attorcigliata: in questo modo sequenze lontane si incontrano spazialmente con l’RNA Polimerasi, creando un contatto quasi diretto con tale enzima e influenzandone quindi l’attività. La strategia del DNA looping viene anche adottata dai lentivirus i quali si inseriscono all’interno del genoma umano, infettandone le cellule e modificandone l’attività trascrizionale. Essi infatti si integrano in regioni specifiche, a volte anche molto distanti, in cui sono presenti i geni che trascrivono e modulano le caratteristiche fisiologiche delle cellule in cui si sono inseriti. MEDIATORE Ma come possono questi fattori regolare in modo positivo o negativo l’attività polimerasica? È stato identificato un complesso molecolare multiproteico detto mediatore. Esso ha un’altissima affinità per l’RNA Polimerasi II: questa viene legata dal mediatore, la superfice esterna del quale prende contatto fisico con le proteine regolatrici (attivatori o repressori) poste sulle sequenze distali. In seguito il mediatore si occupa di fare una sommatoria fra stimoli trascrizionali positivi e negativi e trasmette il messaggio all’RNA Polimerasi. Sbobinatore: Ilaria Radina Revisore: Tommaso Piccin