3° Lezione di Biologia Molecolare - PDF

3° lezione sabato 26 ottobre 2024 18:02 TRANSIZIONE DEI PROCARIOTI FASE DI INIZIO FATTORE SIGMA + CORE ENZYME = OLOENZIMA Promotore è la sequenza di DNA di regolazione a cui si lega la RNA polimerasi per poter iniziare la trascrizione e la sintesi di RNA. Il promotore è formato da sequenze c...

3° lezione sabato 26 ottobre 2024 18:02 TRANSIZIONE DEI PROCARIOTI FASE DI INIZIO FATTORE SIGMA + CORE ENZYME = OLOENZIMA Promotore è la sequenza di DNA di regolazione a cui si lega la RNA polimerasi per poter iniziare la trascrizione e la sintesi di RNA. Il promotore è formato da sequenze consenso, ovvero delle sequenze di base ritrovate in più promotori come, portando un esempio di promotore batterico, la box -10 (TATAAT o Pribnow box) e la box -35 (TTGACA). Fattore sigma Nel caso di un batterio, il fattore sigma dell’oloenzima lega il promotore e, tramite i suoi domini 2 e 4, è in grado di rico noscere le sequenze -35 e -10. Il fattore sigma ha una grande affinità per il promotore, ma non lega quest’ultimo come monomero perché la regione 1.1 (flessibile, disordinata e carica negativament e) mima il DNA e scherma il dominio 2.4 (un’elica) importante per l’aggancio della sequenza consenso -10pb. Quindi, il fattore sigma legando il core dell’oloenzima riesce a legare il promotore del DNA. Quando il fattore sigma si lega al promotore si costituisce il cosiddetto complesso binario chiuso non pronto ad essere trasc ritto: il DNA è ancora a doppia elica ed è presente sulla superficie di queste “chele di granchio” formate dalle subunità b e b’. Grazie al DNA scrunching, avviene la denaturazione dei due filamenti di DNA con un cambiamento della struttura topologica. Durante questo fenomeno, uno dei 2 filamenti diventa curvo e viene captato andando a formare un complesso binario aperto. In questo momento, il fattore sigma si stacca dell’oloenzima, permettendo alla RNA polimerasi di andare avanti. Riassumendo: L’enzima si appoggia sopra il DNA e uno dei due filamenti viene captato all’interno del sito. Il passaggio del complesso bina rio chiuso a quello aperto implica lo spostamento della regione sigma 1.1 verso la superficie. Notare che nel complesso, la regione sigma 3.2 caricata negativamente blocca il canale di uscita dell’RNA nella RNApol. Pas sando al complesso aperto, il canale diventa aperto ma l’RNA non è ancora pronto ad uscire. La polimerasi rimane ferma perché sigma la tiene strettamente legata al promotore tramite interazioni specifiche. Poi, il fattore sigma deve staccarsi dalla polimerasi: la polimerasi, così, avanza nel processo di trascrizione. Passaggio dal complesso binario chiuso al complesso binario aperto: DNA SCRUNCHING (sia proc che euc) Il DNA passa da una struttura a doppia elica ad una struttura aperta, esponendo il filamento templato che va a posizionarsi n el sito catalitico. DENATURAZIONE di una regione del promotore: il DNA è un’elica destrogira con superavvolgimenti sinistrosi: è necessario: - avere la giusta quantità di energia per rompere i legami ad idrogeno, - modificare la struttura del DNA: ripiegamento di 80/90 gradi ⟶ l’energia potenziale liberata dalla rottura del superavvolgimento negativo serve per stabilizzare il complesso ternario. Sequenze consenso è una sequenza ideale data da un allineamento di nucleotidi o amminoacidi che ricade più frequentemente in una posizione. non è presente in tutti i promotori, ma nella maggior parte. Esempio: sequenza consenso TATAAT (o Pribnow box), presente nella maggior parte dei promotori dei batteri, viene riconosciuta da sigma70. Essa possiede le basi A e T e sono necessarie a dar luogo all’inizio della trascrizione. Questo fattore sigma70, facendo lega mi con queste 2 basi A e T: 1. gira e destabilizza la struttura; 2. crea una curvatura nel DNA che diventa piegato a 90° (DNA bending); 3. rilascia energia dal superavvolgimento e l’enzima se lo capta all’interno del sito catalitico; 4. induce la formazione del complesso binario aperto. Una volta che il complesso aperto è stato creato, si va incontro a due situazioni: 1. Inizi abortivi: vengono sintetizzati i primi 2-10 nucleotidi ma, per ragioni non del tutto note, il complesso aperto si stacca e non porta a compimento l’allungamento. 2. Il complesso è stabile e si avvia la transizione alla fase di allungamento previo distacco di sigma: il complesso RNApol cambia la sua conformazione da chiuso ad aperto a ternario. Il fattore sigma aiuta la polimerasi a legarsi il promotore andando ad agganciare il DNA in corrispondenza di siti specifici. Dopodiché, il fattore sigma si stacca (il core dell'oloenzima rimane attaccato al DNA), la polimerasi procede con la fase dell’allungamento: la polimerasi lascia la regione del promotore e trasc orre il DNA nella direzione di sintesi 5’-->3’. Riassumendo: 1. Formazione del complesso binario chiuso: regione 1.1 (disordinata, carica negativamente) si trova sopra il sito catalitico, bloccando l’accesso al DNA. Regione 3.2 (disordinata, carica negativamente) occupa il canale di fuoriuscita dell’RNA. 2. Formazione del complesso binario aperto: regione 1.1 si sposta, il DNA subisce bending di 90 gradi rilasciando energia (perdita superavvolgimento) e permettendo l’inserimento del filamento stampo nel sito attivo. 3. Formazione del complesso ternario: si sintetizzano i primi 2-9 nucleotidi con inizi abortivi. 4. Transizione dalla fase di inizio alla fase di allungamento: sigma si stacca così da consentire alla RNA polimerasi di lasciare il promotore e consentirne l’allungamento. FASE DI ALLUNGAMENTO Movimento dell’RNA polimerasi L’enzima RNA polimerasi presenta un canale di entrata del DNA (regione 1.1), un canale di uscita del DNA e un canale di uscit a dell’RNA (regione 3.2). Gli elementi che partecipano al processo di allungamento non sono proteine, ma sono porzioni delle subunità β e β’ della RNA polimerasi (che rimane compatta e legata al DNA): - il nucleotide entrante si porta uno ione Mg e ne è presente già un altro. - cambio conformazionale del PONTE PROTEICO della RNApol (folding della porzione in interesse): avvengono due reazioni accoppiate: ○ rottura di un legame covalente ad alta energia (quello del nucleotide entrante tra gruppo P alpha e beta) ○ liberazione di pirofosfato ⟶ si libera l'energia necessaria per: - formare un nuovo legame fosfodiesterico ed inserire il nuovo nucleotide. - effettuare un movimento in modo che si possa passare al nucleotide successivo. Poi la porzione di RNApol torna unfolded e si ricomincia il ciclo. Perché è importante per un futuro medico studiare il processo di trascrizione nei batteri ? Per il fenomeno dell'antibiotico-resistenza, una delle principali cause di morte nel mondo, la quale è mediata prevalentemente dal batterio Clostridium Diffic ile. ⟶ L'antibiotico ha come target la RNA polimerasi batterica, operandone l'inibizione della trascrizione. In seguito si analizzano le motivazioni: - è un farmaco contro un enzima batterico che ha poco effetto invece sulle polimerasi dell'ospite (uomo) - La RNApol è un enzima essenziale. - La RNApol è molto conservato, dunque questa classe di antibiotici ha un ampio spettro di efficacia. Esempi di farmaci: 1. Le rifampicine: inibiscono la fase di allungamento collocandosi vicino al sito catalitico di uscita dell'RNA, bloccandone subito la trascri zione; si tratta di un antibiotico molto efficace. 2. La fidaxomicina: bloccano allostericamente il complesso nella fase chiusa; il loro legame è dunque lontano dal sito catalitico. 3. Gli analoghi di base (nucleotide analogs). RIFAMPICINE antibiotici diretti contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Il meccanismo d'azione prevede che si leghino alla subunità beta dal sito attivo, bloccando allostericamente la sintesi di una molecola di RNA più lunga di tre nucleotidi, operando dunque in ultima battuta un blocco dell'allungamento. FIDAXOMICINA è diretta contro gram-positivi, batteri che producono spore e batteri che producono tossine. BIOLOGIA MOLECOLARE Pagina 1 è diretta contro gram-positivi, batteri che producono spore e batteri che producono tossine. Somministrando la fidaxomicina si protegge l’ospite da C.diff ed anche da m. tubercolosis, senza danneggiare gli altri batteri. La fidaxomicina si lega nella regione hinge della polimerasi bloccandola nello stato aperto. Si è studiato quindi la sensibilità funzionale delle polimerasi: C.diff e m.tubercolosis possiedono K84 (lisina, carica posi tivamente) nella subunità beta (che si lega all'antibiotico) e sono sensibili all'antibiotico. E.coli holoenzyme ha invece E84 (acido glutammico, carico negativamente) ed è resistente, ma se ca mbiamo E84 a K84 diventa parzialmente sensibile. In e.coli wild type l'attività della polimerasi è poco sensibile al farmaco, ma se viene sostituita la E con la K, l'enzima viene reso molto sensibile all'antibiotico. ⟶ la lisina è importante aiuta a capire anche che probabilmente quel batterio può sviluppare resistenza al farmaco: va modifica ta dunque la parte chimica del farmaco che interagisce con la lisina, creando così una seconda generazione del farmaco stesso. L'obiettivo, dunque, è quello di sviluppare nuovi composti derivati da Fidaxomicina che targetano K84. PSEUDOURIDIMICINA (PUM): nucleoside-analog inhibitor (NAI): analogo di nucleotide I nucleotidi sono elementi che potrebbero creare problemi alle polimerasi umane. è stato creato un nucleotide analogo, che vi ene sfruttato dalle subunità beta e beta'. Il nucleotide in questione è UTP, ed il suo analogo è PUM, che compete dunque con UTP per l'occupazione del sito di aggiunta dell'RNApol NTP. le sue caratteristiche: 1. PUM viene incorporato mediante accoppiamento con A sul filamento modello del DNA; 2. PUM risulta particolarmente efficace sulla RNA pol batterica, la quale viene inibita in quanto riconosce che non è il nucl eotide corretto nella sequenza di trascrizione; CONTROLLO TUTTA STA PARTE DEGLI ANTIBIOTICI SULLE SBOB DI QUEST ANNO ATTIVITA' DI CORREZIONE DI BOZZE, ovvero PROOFREADING ACTIVITY: EDITING Le DNApol sono molto accurate perché devono replicare l'informazione e se compiono un errore esso si propaga. Le RNApol invec e sono meno precise. La RNA pol può effettuare lo stalling e può fermare dunque la corsa quando: 1) il DNA è danneggiato; 2) ci sono sequenze di DNA che hanno l'intrinseca capacità di arrestare RNA pol; 3) è stato introdotto NTP sbagliato; 4) una pausa prolungata può causare la terminazione della trascrizione. RNApol può comunque ripartire dopo lo stalling. Ci sono due meccanismi attraverso i quali RNApol corregge gli errori, ovvero quando viene incorporato un nucleotide sbagliato e viene sentito il mismatch, e sono: 1) editing pirofosfolitico: reazione inversa della formazione del legame fosfodiestereo: il pirofosfato (appena staccato) viene subito rilegato al nucl eotide appena incorporato. 2) editing idrolitico: RNApol torna indietro di 1 o più nucleotidi e taglia l'RNA prodotto rimuovendo la sequenza errata. Questo processo è stimol ato da fattori proteici aggiuntivi, come Gre, avviene quando RNApol si accorge tardivamente dell'errore. ATTIVITA’ DI SVOLGIMENTO E RIAVVOLGIMENTO DEL DNA Il DNA nelle cellule eucariotiche è superavvolto, ovvero è impacchettato nella cellula batterica o nel nucleo. Il DNA batterico, invece, è formato da un cromosoma circolare agganciato in una porzione alla parete cellulare. Dna batterico e proteine Il cromosoma batterico, come il DNA eucariotico, è associato a proteine. Queste vanno a creare circa 400 sottodomini, in cui il DNA batterico è superavvolto, permettendo così che tutta la molecola possa essere racchiusa nella cellula batterica. Si può definire un sottodominio come una porzione di DNA super avvolta da proteine ed ogni sottodominio è indipendente da un altro. ⟶ Per rilassare il DNA bisogna rompere i microdomini. TOPOLOGIA DEL DNA Il DNA è una doppia elica destrogira, i due filamenti sono avvolti formando il solco maggiore e il solco minore. Il DNA fa degli attorcigliamenti intorno a un asse immaginario che possono essere: Sinistrorsi, superavvolgimenti negativi, sono quelli che ci garantiscono di immagazzinare l’energia, sono frutto della chimica del DNA e delle condizioni in cui si trova nella cellula Destrorsi, superavvolgimenti positivi Analisi superavvolgimento di una porzione di DNA Viene presa in analisi una porzione di DNA e viene posta sul gel di agarosio che è sottoposto a un campo elettrico con un pol o negativo ed uno positivo. il DNA rilassato è lento perché non riesce a correre velocemente nel gel di agarosio il DNA superavvolto, è molto più veloce perché è più compatto e corre bene nel gel ⟶ Tramite la corsa elettroforetica possiamo andare a identificare le zone di DNA più compatte e quelle meno compatte. I microdomini sono separati e indipendenti, sia in eucarioti che in procarioti, dove il DNA viene agganciato e superavvolto. I superavvolgimenti nel DNA Il DNA nelle cellule è prevalentemente superavvolto in maniera negativa: conformazione che contiene più energia che verrà utilizzata per aprire la doppia elica (DNA scrunching). Se la polimerasi va avanti devo: 1. perdere superavvolgimento 2. recuperare il superavvolgimento, meccanismo che avviene in modo casuale, infatti non vengono a ri -formarsi solo superavvolgimenti negativi, come erano presenti prima del passaggio della macchina, ma vengono a formarsi anche superavvolgimenti positivi che devono essere riconvertiti 3. ripristino della situazione Per ripristinare la topologia iniziale del DNA ho bisogno di due enzimi: Topoisomerasi I: per aprire i due filamenti e rilassare il superavvolgimento. - Sono monomeriche - Non serve ATP per la loro attività - Hanno bisogno di magnesio - rilassano i superavvolgimenti negativi nel momento in cui bisogna aprire le eliche del DNA per fare trascrizione con il minor dispendio di energia possibile. - Tagliano un unico filamento, spezzando un legame covalente liberano energia che viene immagazzinata in un altro legame covalente ad alta energia tra il suo gruppo idrossilico e il gruppo fosfato del filamento del DNA che è stato tagliato. A questo punto ‘girano’, riagganciano (tramite l’energia immagazzinata) e rilassano così due superavvolgimenti di DNA. Topoisomerasi II o girasi: - Sono dimeri - Richiedono ATP per la loro attività tagliando entrambi i filamenti di DNA per ripristinare la situazione, non riescono ad immagazzinare energia - Servono per andare a ripristinare dopo la trascrizione la normale topologia del DNA formata da superavvolgimenti negativi - Tagliano entrambi i filamenti e li fanno ‘passare sotto’. Poi riformano i due legami covalenti, pertanto hanno bisogno di ATP La prof consiglia la visione online di alcuni video (di cui non fornisce i link) per vedere come agiscono in vivo le DNA topo isomerasi di tipo I e II. FASE DI TERMINAZIONE - possibile domanda sulla polarità. Terminatori La RNA pol. sta procedendo finchè incontra un segnale di terminazione ovvero una sequenza specifica presente nel trascritto. Ci sono due tipi di terminatori nei batteri: 1) Terminatori intrinseci: si trova direttamente sul trascritto ⟶ elementi cis-attivi (elementi che agiscono la dove sono) In questo caso il segnale di terminazione non richiede fattori aggiuntivi. La polimerasi incontra la sequenza, la trascrive e la riconosce come terminatore causando una pausa della polimerasi 2) Terminatori RHO-dipendenti: dipendono dal fattore RHO ⟶ fattori tras-attivi (elementi che devono essere portati dove servono. ex. RNA polimerasi è un fattore trans -attivo) MECCANISMO DI AZIONE DEI TERMINATORI INTRINSECI Sono composti da due elementi: BIOLOGIA MOLECOLARE Pagina 2 Sono composti da due elementi: Sequenza costituita da due ripetizioni invertite ricche di CG; una volta trascritta dà origine a una struttura secondaria a forcina molto stabile ⟶ destabilizzazione della polimerasi Stretch di U (almeno 6 U): ferma la polimerasi: essendo U il nucleotide meno concentrato, la polimerasi impiegherà più tempo per ‘trovarli ’ determinando così un rallentamento ⟶ stallo della polimerasi Tutto ciò permette alla polimerasi di staccarsi. TERMINATORI RHO-DIPENDENTI Il fattore RHO va a riconoscere le sequenze di terminazione RUT, ovvero siti che non presentano un consenso (sequenza specifica) e sono ricchi in C e poveri in G nell’RNA. Il fattore RHO si lega al trascritto nascente dove legge i siti ricchi in C. Come agisce RHO? RHO lega RUT Interagisce con la polimerasi inducendone un cambiamento conformazionale che causa il distacco da DNA ed RNA La polimerasi rallenta RHO blocca la corsa della RNApol ed entra nel canale di uscita per destabilizzare l’ibrido DNA/RNA. Rho termina la trascrizione grazie alle sue attività: 1) elicasica: rompe i legami tra l’ibrido RNA-DNA 2) ATPasica, RHO aggancia l’RNA formando la struttura nella quale viene fatto scorrere l’RNA. In questa struttura l’N -terminale lega l’RNA mentre il C-terminale ha attività ATPasica. RHO è come un anello che scorre sull’RNA fino a raggiungere la polimerasi. Rho stacca la polimerasi dal DNA. Attività ATPasica = idrolizzare ATP in modo da avere energia per muoversi ANTI-TERMINATORI se l’RNA è ricoperto da un ribosoma, Rho non può raggiungere la polimerasi. Dal momento che nei batteri, trascrizione e traduzione avvengono simultaneamente e nello stess o compartimento, il ribosoma può fungere da anti-terminatore. Questa funzione è importante quando sono presenti delle sequenze RUT collocate all’interno della regione codificante. Per evitare che la trascrizione termini precocemente, il sito RUT viene coperto dal ribosoma causando l'impossibilità di legame da parte di rho. POLARITA’ DI GENI CODIFICANTI PROTEINE Polarità: effetto che ha una mutazione di influenzare l’espressione di un singolo gene o di un operone. Se in un operone vi è una mutazione non senso, la presenza di siti di terminazione rho-dipendente criptici consente di terminare precocemente la trascrizione: lo stop codon prematuro porta al distacco del ribosom a e rho può legare il sito rut criptico, raggiungere l’RNApol e determinare la terminazione della trascrizione. ⟶ si forma così una polarità: la quantità di trascritto a valle della mutazione diventa molto inferiore rispetto a quella a monte. Con questa modalità, l a cellula procariotica evita di trascrivere proteine che sarebbero inutili senza altre proteine codificate dalle restanti parti dell’operone. Esempio: operone Lac: a cosa serve trascrivere il gene della permeasi che fa entrare il lattosio all’interno della cellula, s e poi una volta entrato non ho gli enzimi per processarlo? POLARITA’ in tRNA e rRNA tRNA e rRNA non sono caratterizzati dal fenomeno della polarità. - I tRNA sono piccoli e la formazione delle strutture secondarie previene il legame di Rho su eventuali siti rut. - Gli rRNA sono più lunghi, ma in questo caso nella regione 5’ del trascritto si trovano siti nut, sui quali si assemblano NUS proteins che formano complessi anti-terminazione che bloccano il legame di Rho al sito criptico, o agiscono sulla polimerasi impedendo l’azione di Rho. Riassumendo: sia i ribosomi (nel caso di trascritti mRNA) che complessi proteici (NUS protein, nel caso di trascritti rRNA) possono svolgere il ruolo di anti -terminatori della trascrizione. REGOLAZIONE DELLA TERMINAZIONE TRAMITE ANTI-TERMINATORI E ATTENUATORI Nei batteri la trascrizione dei geni può essere regolata sfruttando la terminazione: - Gli attenuatori terminano precocemente la trascrizione (intervento di terminatori intrinseci) - Gli anti-terminatori impediscono la terminazione (intervento di specifiche proteine) esempio di azione di anti-terminatore: attività del fago lambda (l), un virus che infetta batteri. Quando il fago entra nel batterio (E. Coli) rilascia all’interno dell’ospite il suo genoma e i due promotori L e R producono trascritti uno verso destra e l’altro verso sinistra. Una delle due proteine sintetizzate è la proteina N, la quale ha funzione di anti-terminatore e viene prodotta dalla polimerasi batterica già a partire da un minuto dopo l’ingresso del genoma virale. N ha la capacità di legare la polimerasi, impedendo che Rho la faccia terminare. Si passa quindi dalla trascrizione dei geni early alla trascrizione dei geni intermedi. Tra i geni intermedi, un altro anti-terminatore consentirà ai successivi cicli della polimerasi di passare alla trascrizione dei geni late. La strategia del fago lambda si basa quindi sull’utilizzo di anti-terminatori. ⟶ L’attività di anti-terminatore della proteina N è stata dimostrata con la sua capacità di invertire la polarità di un operone Trp con stop codon prematuro. In assenza della proteina N, se c’è una mutazione nonsense nel gene, si ha la terminazione della trascrizione con conseguente polarità. Se i geni strutturali dell’operone Trp sono stati traslocati nel genoma del fago, a valle del promotore che fa esprimere N, l a polarità si inverte e si ha l’espressione dei geni. BIOLOGIA MOLECOLARE Pagina 3