Aula 11: Prática Laboratorial de Exames Complementares no Diagnóstico (PDF)

PRÁTICA LABORATORIAL DOS EXAMES COMPLEMENTARES UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS INFECCIOSAS DE INTERESSE ESTOMATOLÓGICO Exames complementares nas doenças virais Tânia Sanches Pato  INTRODUÇÃO ◦ Quando falamo...

PRÁTICA LABORATORIAL DOS EXAMES COMPLEMENTARES UTILIZADOS NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS INFECCIOSAS DE INTERESSE ESTOMATOLÓGICO Exames complementares nas doenças virais Tânia Sanches Pato  INTRODUÇÃO ◦ Quando falamos de vírus que podem se manifestar na região bucomaxilofacial temos como o mais comum, o Papillomaviridae humano. Os Papilomavírus humano são pertencentes à família Papoviridae do gênero Papillomavírus, o HPV é a abreviatura utilizada para identificar o Papilomavírus Humano, causador do condiloma acuminado. ◦ Esses vírus são comumente encontrados na região cervical uterina com suspeitas de que eles podem estar relacionados em algumas lesões orais pré-malignas e malignas. Tânia Sanches Pato INTRODUÇÃO ◦ O HPV é um DNA vírus, transmissível sexualmente, sendo frequente na região anogenital e mais raro na mucosa oral. ◦ A sua implantação oral pode ser por autoinoculação ou pelo contato orossexual. ◦ As manifestações orais associadas ao HPV são os papilomas, o condiloma acuminado, a verruga vulgar, a hiperplasia epitelial focal, algumas leucoplasias, o líquen plano e o carcinoma. Tânia Sanches Pato INTRODUÇÃO ◦ O diagnóstico é dado pelo exame clínico da lesão, confirmado por biópsia e pela identificação do tipo do HPV que é feita pelas técnicas de biologia molecular (captura híbrida e PCR). Tânia Sanches Pato INTRODUÇÃO ◦ O tratamento depende da lesão, e por isso, pode ser clínico e/ou cirúrgico, obtendo assim a cura clínica, pois o vírus permanecerá no epitélio da mucosa mesmo após o tratamento. ◦ Para prevenção dessa doença sexualmente transmissível, o HPV, deve-se fazer uso de preservativo (camisinha) nas relações sexuais, inclusive as orais e procurar realizar exames médico-odontológicos, periodicamente, a cada 6 meses. Tânia Sanches Pato INTRODUÇÃO o As manifestações orais associadas ao HPV são os papilomas, o condiloma acuminado, a verruga vulgar, a hiperplasia epitelial focal, algumas leucoplasias, o líquen plano e o carcinoma. o O diagnóstico é dado pelo exame clínico da lesão, confirmado por biópsia e pela identificação do tipo do HPV que é feita pelas técnicas de biologia molecular (captura híbrida e PCR). Tânia Sanches Pato 1. ELISA e Western Blotting ◦ Alguns exames laboratoriais não são muito utilizados na rotina odontológica, porém, com certeza, em algumas situações, são de extrema importância para o diagnóstico final.  ELISA, este exame ficou assim conhecido devido a sua sigla, oriunda do termo em inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ou seja, ensaio de imunoabsorção enzimática.  É um teste que permite a detecção de anticorpos específicos.  Baseado na interação antígeno-anticorpo, o ELISA vem sendo utilizado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas (ocorre como consequência da reação antígeno-anticorpo e que é biologicamente efetiva para a defesa do organismo), em especial para o vírus HIV. Tânia Sanches Pato  1. ELISA e Western Blotting No laboratório de análises, se usa uma placa inerte contendo poços nos quais serão distribuídos os antígenos de interesse, que após uma sequência de passagens formará um complexo, contendo um anticorpo e uma enzima que se acopla a ele, resultando assim, num produto colorido, que é lido por um equipamento específico, o espectrofotômetro. Essa leitura permite definir a positividade ou não do exame. Tânia Sanches Pato  1. ELISA e Western Blotting No caso do HPV, devido ao fato da maioria dos pacientes serem assintomáticos, o exame laboratorial de escolha é o ELISA, que caso seja positivo deve-se repetir a análise e na persistência da positividade faz-se necessário um exame confirmatório como o Western Blotting (WB) e o PCR em tempo real. O WB é uma técnica que permite a identificação, quantificação e detecção de proteínas, as quais são separadas por eletroforese em gel e transferidas para uma membrana adsorvente, as fases seguintes da técnica incluem o bloqueio de ligações inespecíficas (com leite ou albumina), adição de anticorpo específico e a detecção da reação (por Tânia Sanches Pato filmes de raios-X ou câmeras especiais que obtêm imagem digitalizada).  2. Exame histopatológico (Biópsia) no HPV ◦ Nesse exame, o material é preparado para a observação dos tecidos em microscópio, onde é feita uma análise da distribuição e arranjo das células na pele. ◦ O método não identifica o HPV, ele apenas observa as alterações patológicas características da infecção pelo vírus, como:  hiperplasia (acantose, que é a hipertrofia ou espessamento da camada espinosa da epiderme),  coilocitose (aumento do núcleo celular e da relação núcleo/citoplasma, com irregularidade do HE 10 x – Fragmento de colo uterino mostrando contorno nuclear, aumento da coloração do núcleo Neoplasia intra-epitelial cervical grau 1 (NIC1 – e halo claro em torno do núcleo), LSIL). Há paraceratose (1), pode dar epitélio  disceratose (ceratinização de células profundas do branco à colposcopia, coilocitose (2) e epitélio), hiperplasia atípica da basal (3) atingindo apenas  paraceratose (ceratinização anormal do epitélio o terço interno do epitélio. escamoso com persistência dos núcleos celulares nas células superficiais), Tânia Sanches Pato  atipias nucleares. 3. Imuno-histoquímica no HPV ◦ Essa técnica pode detectar o revestimento proteico das partículas virais do HPV, observado na microscopia óptica, em material incluído em parafina ou em preparados citológicos, utilizando anticorpos policlonais contra antígenos específicos aos vários tipos de HPV. ◦ Os laboratórios que realizam o exame escolherão os anticorpos mais indicados para cada caso e estes serão explicitados no laudo final. ◦ Apesar de ser um método relativamente simples, a imuno-histoquímica tem certas particularidades e seu resultado é influenciado por diversos fatores, começando pela fixação do espécime, passando pela escolha dos anticorpos a serem analisados em cada caso e pelas reações propriamente ditas, chegando até Tânia Sanches Pato a interpretação das lâminas  4. Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, no HPV ◦ A biologia molecular atualmente está consagrada na pesquisa do DNA de HPV e entre as técnicas disponíveis, a PCR em tempo real, destaca-se por apresentar sensibilidade e valor preditivo negativo elevados. ◦ O método detecta individualmente os tipos 16 e 18, responsáveis por 70% dos casos de câncer de colo uterino, além de informar, de modo agrupado, a presença de outros 12 tipos de HPV de alto risco oncogênico, também. Tânia Sanches Pato  4. Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, no HPV ◦ A PCR em tempo real para HPV identifica individualmente os tipos 16 e 18 e, em conjunto, os seguintes tipos: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. ◦ Além disso, possui controles internos individuais para cada amostra a fim de eliminar resultados falso-negativos e apresenta valor preditivo negativo superior a 99% e sensibilidade superior a 90% para amostras de colo uterino. Tânia Sanches Pato  4. Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, no HPV ◦ Essa técnica fornece resultados de modo qualitativo, ou seja, a carga viral reflete a quantidade de células presentes na amostra, e depende das condições de coleta, logo não se relaciona de modo preciso com a intensidade da infecção pelo HPV. ◦ Pode também haver influência pela reinfecção por novos tipos virais e pelo grau de integração no genoma do hospedeiro. ◦ Dessa forma, a quantificação da carga viral não pode ser considerada um meio eficaz de controle de tratamento ou prognóstico. Tânia Sanches Pato 5. HPV oral ◦ 1983 - observadas alterações citopáticas de HPV (coilócitos) em lesões orais, idênticas às encontradas nos carcinomas da cérvice uterina, e desde então, vários estudos têm abordado a possível presença do vírus na mucosa oral. ◦ O diagnóstico pode ser: clínico, citológico, por meio de biópsia ou por biologia molecular no qual o PCR é o mais sensível e específico, comparado aos outros métodos de biologia molecular. Tânia Sanches Pato  5. HPV oral ◦ O tratamento pode ser clínico ou cirúrgico, porém qualquer que seja o método adotado tem como objetivo a cura clínica, pois não há tratamento eficaz para a erradicação definitiva do vírus. Tânia Sanches Pato 5. HPV oral ◦ Pode-se considerar o epitélio que reveste a cavidade oral muito parecido com o epitélio que reveste a região da ectocérvix. Como o HPV é epiteliotrópico, podemos concluir que o mesmo vírus que contamina a cavidade oral, também pode contaminar a cérvix uterina. Tânia Sanches Pato  5. HPV oral ◦ Os processos de transmissão do HPV na mucosa oral ainda não estão claros, porém há quem admita que o mesmo possa ocorrer durante o parto vaginal, pela autoinoculação e devido à prática de sexo oral. Tânia Sanches Pato 5. HPV oral ◦ Na região anogenital, os tipos de HPVs mais frequentes são 6/11 e 16/18, os quais foram também observados na região da mucosa oral, significando uma possível transmissão orogenital, o que coloca esse vírus como um importante cofator no desenvolvimento do câncer oral, assim como é considerado no colo uterino. Tânia Sanches Pato  5. HPV oral ◦ As lesões do HPV podem se apresentar em qualquer localização, únicas ou múltiplas de diversos aspectos: couve-flor, exofíticas, sésseis ou pediculadas, e serão denominadas como papiloma escamoso, condiloma acuminado ou verrugas, manifestações mais comuns encontradas na mucosa oral. ◦ São causados principalmente pelo HPV 16 quando associados a carcinomas orais. Tânia Sanches Pato  5. HPV oral ◦ Verruga vulgar é uma hiperplasia focal do epitélio escamoso estratificado, benigna e induzida pelo vírus, é contagiosa e espalha-se com facilidade, comumente encontrada na pele e não na mucosa bucal, mas quando encontrada na boca quase sempre é branca. Tânia Sanches Pato  5. HPV oral ◦ Papiloma escamoso é mais prevalente em jovens, e se caracteriza pelo aumento de volume tecidual, por ser pediculado e por ter consistência amolecida, a superfície é irregular com aspecto digitiforme ou de couve-flor e com coloração esbranquiçada ou avermelhada. Tânia Sanches Pato  ◦ Condiloma acuminado 5. HPV oral também é considerado como uma proliferação do epitélio escamoso estratificado, encontrado na genitália, região perianal, boca e laringe. É possível encontrar vários tipos de HPV, porém os de maior frequência são os de alto risco 16 e 18. O condiloma é considerado uma doença sexualmente transmissível (DST). Se diagnosticado em crianças pode ser considerado abuso sexual. A presença concomitante do condiloma nas regiões anal e bucal é muito comum. Clinicamente os condilomas são maiores que os papilomas e geralmente estão aglutinados a outros Tânia Sanches Pato papilomas. 5. HPV oral Quando relatados em lesões orais, ocorrem com maior frequência na mucosa labial, palato mole e freio lingual. Bem visível com tamanho médio de 1 a 1,5 cm e em lesões bucais de até três centímetros apresentam-se como uma massa exofítica, séssil, rósea, firme e bem demarcada. Tânia Sanches Pato Tânia Sanches Pato