Prueba de Coombs - Unidad IV - 2023 - PDF

INMUNOHEMATOLOGÍA Tema: UNIDAD IV “PRUEBA DE COOMBS. FUNDAMENTO E IMPORTANCIA.” Docente. MGTS. CHILA GARCÍA KAREN CAROLINA 2023 Aplicaciones. De los sistemas serológicos usados para...

INMUNOHEMATOLOGÍA Tema: UNIDAD IV “PRUEBA DE COOMBS. FUNDAMENTO E IMPORTANCIA.” Docente. MGTS. CHILA GARCÍA KAREN CAROLINA 2023 Aplicaciones. De los sistemas serológicos usados para La prueba es usada para detectar demostrar la presencia de antígenos o anticuerpos incompletos anti-Rh en el suero o anticuerpos de grupos sanguíneos, la prueba para evidenciarla sensibilización de los de antiglobulina humana o de Coombs es glóbulos in vivo, así como también el considerada como la mas eficiente y de diagnostico de HERN mayor valor en el banco de sangre. El fundamento de la prueba de antiglobulina se basa en los siguientes 2- Si un animal (chivo, conejo) es inyectado principios: con globulinas humanas purificadas o con el 1- Los anticuerpos y el complemento suero total, este animal las reconoce como humano son globulinas y además son extrañas y elabora anticuerpos contar ellas; diferentes a las de otras especies; por lo estos anticuerpos tendrán especificidad tanto, se comportan como antígenos antiglobulina humana.. cuando se inyectan a otros organismos. 3- El suero antiglobulina humana obtenido reaccionara específicamente con las globulinas humanas. Si las moléculas de globulinas sean anticuerpos o complementos se fijan en la membrana de los glóbulos rojos el suero de antiglobulina se combinarán con ellas y causara aglutinación de las células. En cambio, si los glóbulos rojos no están sensibilizados no habrá aglutinación. En la actualidad el reactivo de antiglobulina se prepara inyectando colonias de conejos con gammaglobulinas humana purificada para obtener suero antiglobulina humana. En resumen, se puede decir que el principio de la prueba de antiglobulina humana o de Coombs es detectar inmunoglobulinas de la clase IgG o fracciones de complementos C3d unidos a los glóbulos rojos.  La sensibilización de los glóbulos rojos se puede producir en dos formas: a) In vivo: cuando la reacción del antígeno y su correspondiente anticuerpo se efectúa en el organismo mientras ambos están circulando. Ejemplos, anemias hemolíticas autoinmune, EHRN b) In vitro: la sensibilización de los glóbulos rojos por el anticuerpo se realiza en un tubo de ensayo en el laboratorio, donde se mezclan e incuban eritrocitos adecuados con el suero en estudio. Si en el suero existen anticuerpos contra los antígenos presentes en los eritrocitos se producirá la reacción Ag-Ac y los glóbulos rojos quedaran sensibilizados. NOTA: Es importante tener presente que el fundamento de la prueba de antiglobulina humana, es demostrar la presencia de anticuerpos y globulinas fijadas en la membrana de los glóbulos rojos por lo tanto es obligatorio lavar muy bien las células ya sensibilizadas para eliminar el resto de proteínas presentes en el suero y que puedan interferir negativamente en los resultados finales de la prueba.  Tipos de pruebas de Coombs Para demostrar la sensibilización de los glóbulos rojos sea in vivo o in vitro existen dos modalidades en la prueba de antiglobulina: Prueba directa Prueba indirecta  Se utiliza para detectar PRUEBA DE la sensibilización in Enfermedad hemolítica ANTIGLOBULINA vivo de los glóbulos del recién nacido DIRECTA rojos, es de gran valor en el diagnóstico de la: Anemia hemolítica y Investigación de Anemia hemolítica sensibilización reacciones autoinmune inducidas por drogas transfusionales  En un tubo de ensayo de 10 o 12 x75 mm colocar una gota de Realizar un proceso de 4 PROCEDIMIENTO células rojas al 5% suspendidas lavados en solución salina fisiológica. Inmediatamente después del Examinar el tubo para observar cuarto lavado y decantación se Centrifugar a: 3400 rpm x 15 si hay aglutinación, graduarla en procede a agregar dos gotas de segundos o 1000rpm x 1 minuto. cruces y anotar el resultado tubo reactivo de antiglobulina humana en mano. y mezclar. Las pruebas negativas deben comprobarse con células control de Coombs. Al tubo de la prueba negativa se agrega una gota de células control de Coombs mezclar, centrifugar leer y anotar los resultados, tubo en mano.  Si la prueba de antiglobulina muestra aglutinación se la interpreta como positiva significa que hubo sensibilización in vivo de los INTERPRETACIÓN: eritrocitos y se informa: prueba de antiglobulina o de Coombs positiva señalando en cruces la intensidad de reacción.. La prueba de antiglobulina negativa será válida solamente si la prueba Si no hubo aglutinación la prueba es control de Coombs es positiva. En negativa y significa que no existe este caso se informa: prueba de autosensibilización eritrocitaria. antiglobulina o de Coombs directo negativa  Actualmente se recomienda que las pruebas negativas se dejen incubar Para facilitar las lecturas es durante de un lapso de 5 a 10 min a recomendable la ayuda visual con el uso temperatura ambiente para luego lupas o lamparas para leer aglutinaciones centrifugar y leer. Algunas veces una la cual debe estar prevista de espejo COMENTARIOS prueba negativa puede hacerse positiva. amplificador. Se recomienda leer las No se debe recentrifugar la prueba de pruebas negativas al microscopio para antiglobulina si ha sido positivo débil por detectar aglutinaciones no visibles a que puede negativizarse si la reacción es simple vista. debida a IgG8. El principio de esta prueba se basa en que el si lavado fue correcto deberán a- Si la prueba control de Coombs es Es de primordial importancia controlar las haberse eliminado las inmunoglobulinas positiva demuestra que la técnica de pruebas negativas con (células control de libres no fijadas a los glóbulos rojos. Si la lavado fue correcta y que el reactivo de Coombs) células presensibilizadas con prueba ha sido negativa, el suero de antiglobulina tiene actividad anti-IgG por IgG. antiglobulina conservara su actividad lo tanto la prueba de antiglobulina es antigénica y aglutinara las células control válida. de Coombs. El resultado se interpretará:. b- Si la prueba control de Coombs es negativa la prueba de antiglobulina quedara invalidada. Y deberá repetirse correctamente todo el procedimiento.  La prueba de PRUEBA DE antiglobulina indirecta se usa en: En la parte final de la ANTIGLOBULINA prueba de compatibilidad INDIRECTA Detección e identificación de anticuerpos irregulares Pruebas especiales: Detección de antígenos consumo de antiglobulina, no demostrados por otras estudio de anticuerpos técnicas: Du, Kell, Duffy, antileucocitarios, Kidd, etc. antiplaquetarios etc.  En un tubo de ensayo de 10 o 12 x 75mm colocamos 2 Agregar 1 gota de una gotas de suero fresco en suspensión de células PROCEDIMIENTO lavadas una vez y estudio. preparadas al 5% en SSF.. Agregar 2 gotas de albumina bovina polimerizada o Incubar a 37°C por 15-30 Lavar 4 veces con suficiente albumina al 22% o al 30%. minutos. Centrifugar, leer y SSF como en la prueba Mezclar, centrifugar, leer y anotar los resultados tubo en directa, decantando cada anotar los resultados tubo en mano. vez toda la salina. mano. Centrifugas, leer y anotar los Agregar 2 gotas del reactivo resultados, tubo en mano. antiglobulina humana Comprobar las pruebas poliespecifico y mezclar. negativas con células control de Coombs  Prueba de antiglobulina negativa + prueba de INTERPRETACIÓN: control de Coombs positiva. Interpretación: prueba de antiglobulina negativa. Prueba de Antiglobulina negativa + prueba Repetir todo el control de Coombs procedimiento. Averiguar negativa. Interpretación: la causa del error. prueba no valida. FACTORES QUE AFECTAN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA a)Temperatura Los anticuerpos de la clase IgG Fase de reaccionan óptimamente a 37°C; la sensibilización por el complemento sensibilización (in también ocurre a 37°C. Temperaturas vitro) menores reduce la unión Ag-Ac y temperaturas mayores daña las células o el anticuerpo. c) Proporción de células y suero En la rutina de laboratorio se emplea b) Medio de reacción 2 gotas suero y 1 gota de suspensión El medio de suspensión para los al 5%. Se ha demostrado que glóbulos rojos puede ser SSF, aumentando la proporción del suero albumina, solución de fuerza iónica se puede detectar anticuerpos baja (LISS). débiles que no aparecen en los procedimientos de rutinas. Por ejemplo, usando 3 gotas de suero. d) Tiempo de incubación Un periodo de incubación de 15 a 30 min es suficiente para detectar la mayoría de los anticuerpos cuando se emplea albumina como medio de reacción. La solución de fuerza iónica baja (LISS) acorta el tiempo de incubación de 10 a 15 min sin perdida de la sensibilidad a la prueba. FACTORES QUE AFECTAN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA a) Tiempo lavado Tanto en la prueba de antiglobulina directa como en la indirecta, el lavado de Terminada la fase de incubación el Fase de lavado las células es un procedimiento muy importante debiéndose tomar en cuenta lavado de las células debe iniciarse inmediatamente y debe ser continuo para las siguientes consideraciones. evitarla elución del anticuerpo fijado a los glóbulos rojos c) Decantación de salina. b) Volumen de salina Para eliminar las globulinas no fijadas al d) Contaminación Deben usarse volúmenes de SSF glóbulo rojo es importante que después adecuados para diluir y eliminar de Si se tapa la boca del tubo con el dedo de cada lavado de salina sea decantada manera efectiva las globulinas no unidas para Resuspender las células, se expone totalmente. Ello se logra invirtiendo a los glóbulos rojos. Los tubos deben ser a la contaminación con proteínas completamente el tubo y sacudiéndolo llenados 1cm por debajo de la boca del provenientes de la piel las cuales pueden con un movimiento firme. Las células tubo y deben practicarse 4 lavados para inactivar el reactivo de antiglobulina. quedaras adheridas al fondo y serán remover todos los anticuerpos no fijados. resuspendidas. e) Elución El anticuerpo fijado puede separarse de los glóbulos rojos muy pronto si son dejados en suspensión salina. CAUSAS DE ERROR Lavado incorrecto por que conduce a la inactivación del Causas de reactivo. Contaminación del reactivo con el suero humano. resultados falsos Contaminación con proteínas por Elución del anticuerpo durante el ejemplo cuando se tapa el tubo negativos con el dedo para mezclar o proceso de lavado Resuspender. Suspensión de células muy fuerte El suero viejo, el calentamiento la Incubación inadecuada durante la o muy débil (mayor 5% o menor) congelación y descongelación fase de sensibilización Células mal conservadas, repetida alteran la actividad de los anticuerpos y del complemento. Perdida de células durante el hemolizadas, calentadas, o lavado cuando queda un botón envejecidas sufren alteración de El empleo de plasma interfiere con células insuficiente para una los antígenos y perdidas de su la actividad del complemento y lectura inadecuada. actividad. conduce a falsos negativos. El exceso de salina residual después del último lavado causa Omisión de reactivo de Coombs. dilución del reactivo antiglobulina. Retardo en agregar el reactivo de Los movimientos violentos para antiglobulina después de desprender el botón producen terminado el lavado. dispersión de los aglutinados débiles e interpretación errónea de la lectura. CAUSAS DE ERROR Causas de La contaminación bacteriana de la resultados falsos muestra de sangre y de los reactivos. positivos Tubos de ensayos mal lavados Glóbulos rojos provenientes de contaminados con polvos detergentes y pacientes sépticos. otros materiales como sulfato de cobre. Las muestras de sangres coaguladas y refrigeradas provenientes de personas con anticuerpos fríos pueden dar una prueba de Coombs directa positiva por activación no especifica de complemento. Ello se evita empleando glóbulos rojos de muestras tomadas con anticoagulantes (ACD, CPD, EDTA) que inactivan el complemento.