Inmunohematología y Hemoc. - T.7

T.7.- INMUNOHEMATOLOGÍA Y HEMOCOMPATIBILIDAD Sonia G. M.  1.- ¿EN QUÉ CONSISTE UNA TRANSFUSIÓN? La transfusión es un procedimiento mediante el cual se pasa sangre, o alguno de sus componentes, de una donante a un receptor. Los objetivos de las transfusiones pueden ser diverso...

T.7.- INMUNOHEMATOLOGÍA Y HEMOCOMPATIBILIDAD Sonia G. M.  1.- ¿EN QUÉ CONSISTE UNA TRANSFUSIÓN? La transfusión es un procedimiento mediante el cual se pasa sangre, o alguno de sus componentes, de una donante a un receptor. Los objetivos de las transfusiones pueden ser diversos: Reponer el volumen sanguíneo Aumentar la hemoglobina y la capacidad de transporte de oxígeno Corregir los niveles de proteínas Corregir la cantidad de otros componentes de la sangre Un factor determinante para poder realizar una transfusión es la compatibilidad entre el donante y el receptor, es decir, la garantía de que no se producirá una reacción inmunológica entre antígenos y anticuerpos de donante y receptor. 1.-¿EN QUÉ CONSISTE UNA TRANSFUSIÓN? Las células sanguíneas poseen en su membrana proteínas y polisacáridos que pueden actuar como antígenos y provocar la formación de anticuerpos en las personas que carecen de ellos. Los antígenos presentes en las células sanguíneas determinan el grupo sanguíneo, que condiciona la compatibilidad entre la sangre de las distintas personas. Un sistema de grupo sanguíneo consiste en uno o más antígenos presentes en las células sanguíneas y que están consideradas por un locus o por dos o más genes homólogos estrechamente ligados. 2.-LOS GRUPOS SANGUÍNEOS En 1900, Karl Landsteiner Investiga las causas de que algunas personas murieran en las transfusiones mientras que otras se curaban. Landsteiner descubrió que en la superficie de los hematíes puede haber dos tipos de antígenos que denominó A y B y también que en el plasma puede haber anticuerpos que reaccionan con esos antígenos: anti-A y anti-B. De esta manera, identificó los 4 grupos sanguíneos principales A, B, AB y O que forman el sistema ABO. Landsteiner también identificó otro antígeno importante el factor Rh. 2.-LOS GRUPOS SANGUÍNEOS 2.-LOS GRUPOS SANGUÍNEOS En 1980 la sociedad internacional de transfusión sanguínea ISBT, formó una asociación para unificar la terminología de los distintos grupos identificados. En la actualidad hay 34 grupos identificados, asociados a un número y una abreviación, que todos los profesionales utilizan (Tabla de grupos sanguíneos) Cada uno de los sistemas de grupos sanguíneos está codificado por un gen o un clúster de genes estrechamente ligados, todos ellos han sido identificados y secuenciados. 2.-LOS GRUPOS SANGUÍNEOS La identificación de los antígenos es de especial importancia en las transfusiones ya que si la sangre del receptor posee anticuerpos frente a los antígenos presentes en la sangre transfundida se producirá una reacción inmunológica que podrá llegar a poner en riesgo su vida. Los anticuerpos de mayor importancia en las reacciones debidas a transfusiones son de tipo IgG e IgM, y muy rara vez IgA. 2.-LOS GRUPOS SANGUÍNEOS Las IgG pueden fijar complemento. Debido a su tamaño, pueden atravesar la barrera hematoplacentaria y provocar la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN). Las IgA están presentes en secreciones. En el plasma se encuentran en forma de monómeros y en las secreciones en forma de dímeros. Las IgM son aglutininas muy potentes y algunas activan el complemento eficazmente. Tienen forma de pentámeros y un alto peso molecular por lo que no pueden atravesar la barrera hematoplacentaria. 3.- SISTEMA ABO En el sistema ABO los antígenos que determinan el grupo sanguíneo son cadenas cortas de oligosacáridos (carbohidratos) unidas a esfingolípido de la membrana eritrocitaria (ceramida), que sobresalen hacia el exterior de los hematíes. Los 3 antígenos que caracterizan a este sistema tienen una parte común y se diferencian solo en el residuo terminal de la cadena. La expresión de estos antígenos está controlada por dos genes: el gen H (situado en el cromosoma 19) y el gen ABO (situado en el cromosoma 9) que codifican para enzimas glicosiltransferasas. A partir de un oligosacárido precursor común, la transferasa H cataliza la incorporación de una L- fucosa generando el antígeno o sustancia H que es la base de la síntesis de los antígenos A y B. 3.- SISTEMA ABO 3.- SISTEMA ABO El gen ABO tiene tres alelos: Alelo A: Codifica para tranferasa A, que cataliza la adición de un residuo de N-acetil-galactosamina al antígeno H, originando el antígeno A. Alelo B: Codifica para transferasa B, que incorpora un residuo de D-galactosa al antígeno H, dando lugar al antígeno B. Alelo O: Codifica para proteína sin actividad glicosiltransferasa y que, por tanto, no puede modificar la sustancia H. 3.- SISTEMA ABO Dependiendo del antígeno o antígenos presentes en la superficie de los hematíes, se diferencian cuatro grupos sanguíneos: Grupo A: Hematíes presentan antígeno A. Grupo B: Hematíes presentan antígeno B. Grupo AB: Hematíes presentan antígenos A y B. Grupo O: Hematíes presentan solo antígeno H (no tienen ni A ni B). 3.1.- SUBGRUPOS DE A Y B Se han descrito varios subtipos dentro del sistema ABO, hablándose de subgrupos o variantes. Son debidos a mutaciones en el gen ABO que alteran la eficiencia de la transferasa codificada o modifican su afinidad por el sustrato sobre el que actúan. De esta forma, la mayor parte de los subgrupos de A y B son variantes cuantitativas que presentan menor cantidad del antígeno A o B sobre la membrana de los hematíes. Hay también alguna variante cualitativa que afecta a la estructura antigénica sobre todo al grado de ramificación del antígeno. 3.1.- SUBGRUPOS DE A Y B Los subgrupos A son más comunes que los B Los dos subgrupos mayoritarios y más importantes del grupo A son el A1 (80% de las personas con grupo A) y A2 (cerca del 20% de las personas con grupo A) Entre ambos existen diferencias cuantitativas y cualitativas. 3.1.- SUBGRUPOS DE A Y B El subgrupo A2 presenta menor cantidad de antígeno. El antígeno A2 está poco ramificado, mientras que el A1 está muy ramificado. Esta diferencia cualitativa es suficiente para provocar que los hematíes del subgrupo A1 aglutinen con una lectina (proteína de reconocimiento de algunos vegetales) de la planta Dolichos biflorus, mientras que los hematíes del subgrupo A2 no lo hacen. Esta lectina, es útil para diferenciar ambos subgrupos. 3.1.- SUBGRUPOS DE A Y B Los subgrupos A y B débiles tienen gran importancia transfusional porque no aglutinan con los antisueros convencionales anti-A y anti-B y en la prueba celular pueden ser falsamente identificados como grupo O. Habitualmente, se detectan por la discrepancia entre la prueba celular y la prueba sérica, ya que solo presentan un anticuerpo (anti-B los subgrupos débiles A y anti-A a los grupos B débiles), mientras que los auténticos grupos O presentan dos anticuerpos (anti-A y anti-B). El grupo AB también tiene varios subgrupos siendo los más importantes A1B y A2B. 3.2.- GRUPO BOMBAY Con relación al sistema ABO, cabe mencionar un grupo muy poco frecuente denominado Bombay (grupo Oh). Las personas que tienen este grupo poseen dos alelos recesivos del gen H (hh) por lo que carecen de transferasa H, no pueden producir sustancia H y, por tanto, tampoco antígenos A ni B. Fenotípicamente, con la prueba celular estas personas se clasifican como grupo O, pero cuando se analiza su suero en la prueba sérica se obtienen una fuerte aglutinación con hematíes de todos los grupos, incluidos los de grupo O. Esto es debido a que los individuos O Bombay poseen anticuerpos anti-A, anti-B y anti-H y la sustancia H es el antígeno presente en los hematíes del grupo O. 3.3.- HERENCIA DEL SISTEMA ABO El grupo ABO se hereda mendelianamente, los alelos A y B son codominantes entre sí y el alelo O es recesivo. (A = B) > O 1. ¿Puede una madre de grupo sanguíneo A y un padre de grupo sanguíneo B, tener un hijo O? 2. En una familia cuyos abuelos paternos son del grupo O y cuyo padre es también O siendo la madre AB si el hijo de ambos es B, ¿Podría ser posible que no fuera su hijo? 3. Si tenemos una abuela AB++ y un abuelo OO-- ¿Con quién se tendrían que juntar sus hijos para que el abuelo pudiera tener un Nieto con su mismo grupo sanguíneo? 4.-SISTEMA RH El sistema Rh debe su nombre del animal en que se descubrió: el macaco Rhesus. Se han descrito más de 50 antígenos en este sistema, pero los principales son 5: D, C, c, E y e. Estos antígenos son glicoproteínas integrales de membrana de los hematíes. Los términos Rh positivo y negativo se refieren a la presencia o ausencia del antígeno D en los hematíes ya que es altamente inmunológico. 4.-SISTEMA RH Las personas que tienen el antígeno D son Rh positivo (Alrededor del 85% de las personas) y solo pueden donar sangre a personas con Rh positivo. Las personas que NO tienen antígeno D son Rh negativas y pueden donar sangre a individuos Rh positivos y Rh negativos. El antígeno D puede ser detectado por una prueba de aglutinación directa con un suero anti-D 4.-SISTEMA RH En el sistema Rh se incluyen dos genes situados en el cromosoma 1 estrechamente ligados y con alto grado de homología: Gen RHD, que codifica para el antígeno D. La expresión de este gen genera el fenotipo Rh positivo, la ausencia de expresión por deleción u otras alteraciones genéticas, determina el fenotipo Rh negativo. Gen RHCE, Que codifica para los antígenos C, c, E y e. En principio hay 4 formas alélicas de este gen cada una de las cuales determina la expresión de una pareja de antígenos: CE, Ce, cE y ce. 4.-SISTEMA RH Al igual que el sistema ABO, el sistema Rh requiere para poder expresarse un tercer gen denominado RHAG que codifica para una glicoproteína asociada a Rh. Este gen constituye también un sistema de grupo sanguíneo independiente del sistema Rh (sistema 030 de la clasificación ISBT). Los anticuerpos contra los antígenos Rh suelen ser activos a 37ºC, no fijan complemento, son clínicamente significativos, generan destrucción eritrocitaria extravascular en el sistema mononuclear fagocítico y también pueden provocar enfermedad hemolítica del recién nacido. Los que se presentan con mayor frecuencia son los anti-D, anti-E y anti-c. 4.1.-FENOTIPOS El sistema Rh presenta una gran diversidad y complejidad fenotípica originando múltiples variantes parciales y débiles del antígeno D: Fenotipos D parcial. Se identifican como D, pero carecen de una parte del antígeno. Se destaca la denominada DVI; la sangre de las personas con esta variante reacciona débilmente a la prueba de antiglobulina humana, pero puede generar una respuesta importante ante una transfusión. Fenotipos D débil. Los eritrocitos tienen antígeno D, pero niveles muy bajos. Esto hace que no se detecte el antígeno mediante los métodos serológicos de rutina. Se detecta mediante la prueba de antiglobulina indirecta. 4.1.-FENOTIPOS En el contexto transfusional, la presencia de variantes parciales o débiles del antígeno D debe ser interpretada: Rh positivo si se trata de un donante Rh negativo si se trata de un receptor de transfusión 4.2.- RH NULL Otro fenotipo raro del sistema Rh es el Rh nulo o null, los eritrocitos de estos individuos carecen de todos los antígenos del sistema Rh. La principal causa de esto es debido a una mutación en el gen Rh que determina la ausencia o alteración funcional de la glicoproteína asociada a Rh. Esto provoca una anemia hemolítica crónica con aumento de la fragilidad osmótica, esferocitosis y estomatocitosis. 4.3.- HERENCIA DEL FACTOR RH El factor Rh se hereda mendelianamente, pero en lugar de hablar de dos alelos codificantes, uno paterno y otro materno, hablamos de copias funcionales del gen RDH: dos copias (DD), una copia (D_) o ninguna copia (_ _). Las personas Rh positivas tienen al menos una copia funcional del gen (DD o D_) Y las personas Rh negativas no tienen ninguna copia funcional del gen (_ _). 4.3.- HERENCIA DEL FACTOR RH 4. ¿Puede una mujer Rh positivo tener un hijo con un hombre Rh positivo que sea Rh negativo? 5. Un hombre que es hijo de padres Rh positivos es positivo. ¿Puede tener una hija Rh negativa si su pareja es Rh negativo? 6. Cuatro amigas que viajan juntas tienen un accidente de coche, 3 de ellas salen ilesas pero la cuarta tiene una hemorragia grave que necesita de una transfusión sanguínea. La médico plantea una donación entre ellas y los datos que aportan son los siguientes: a) La chica con hemorragia es del grupo A+ b) La primera de las amigas es O y sus padres son ambos Rh – c) La segunda no conoce su grupo, pero sabe que sus padres son O y A d) La tercera tampoco sabe su grupo, pero sus padres son B+ 5.-LA COMPATIBILIDAD Al combinar estos dos sistemas, ABO y Rh, podemos llevar a una clasificación más detallada de los diferentes tipos de sangre: SISTEMA ABO SISTEMA Rh Ag en los hematíes Ac en el suero Ag en los hematíes A B Anti-A Anti-B D A+ Sí No No Sí Sí A- B+ B- AB+ AB- O+ O- 5.-LA COMPATIBILIDAD Al combinar estos dos sistemas, ABO y Rh, podemos llevar a una clasificación más detallada de los diferentes tipos de sangre: A QUIEN PUEDE DONAR DE QUIÉN PUEDE RECIBIR A+ A- B+ B- AB+ AB- O+ O- 5.-LA COMPATIBILIDAD Respecto a la compatibilidad ABO, aunque para algunos grupos existen varias opciones, siempre es preferible recurrir a la sangre del mismo grupo y solo como segunda opción al grupo O. Para receptores con grupo AB (receptor universal), la primera opción es un grupo AB, la segunda un grupo A, la tercera un grupo B y como última opción un grupo O. 6.- OTROS SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS Algunos de los sistemas con importancia transfusional son: sistema Ii, sistema Lewis, sistema P, sistema MNS, sistema Kell, sistema Kidd, sistema Duffy y sistema Luthran. 6.1.-SISTEMA Ii Los antígenos del sistema Ii son carbohidratos cuya raíz es el mismo oligosacárido que el de los antígenos A, B, H. El antígeno i, no ramificado, está presente en los eritrocitos del neonato mientras que el antígeno I ramificado, se encuentra en la mayoría de los hematíes de los adultos. Esto se debe a que durante los primeros años de vida se activa una enzima ramificadora que hace que el antígeno i y se convierta en I. 6.1.-SISTEMA Ii Muchas personas tienen anticuerpos fríos con especificidad anti-I y anti-i, que son inactivos a temperatura corporal pero que producen hemólisis cuando pueden reaccionar a 30ºC, causando una anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos fríos. En estos casos, si la transfusión es necesaria las unidades deben calentarse a temperatura fisiológica mediante dispositivos adecuados antes de su administración. Los anticuerpos anti-I suelen asociarse con Mycoplasma y los anti-i con enfermedades del sistema retículo endotelial y con la mononucleosis infecciosa. 6.2.-SISTEMA LEWIS Los antígenos del sistema Lewis son solubles. Se encuentran en el plasma como glucoesfingolípidos y en las glándulas epiteliales como glucoproteínas. Los que se detectan en la superficie eritrocitaria en realidad no proceden de los eritrocitos, sino que se absorben reversiblemente a partir del plasma. El antígeno Lea se encuentra en los portadores del gen Lewis pero NO del gen secretor, mientras que el antígeno Leb se produce cuando se asocian el gen Lewis y el gen secretor. El gen secretor hace que la persona presente antígenos en sus secreciones glandulares. Los anticuerpos del sistema lewis se producen de forma natural y suelen tener poca relevancia clínica. A pesar de ello ante la detección de anticuerpos anti-Lea, anti-leb y anti-Lea+leb en una persona que requiere una transfusión, deben seleccionarse hematíes compatibles a 37ºC y realizar el test de antiglobulina. 6.3.-SISTEMA P El sistema tiene un único antígeno que se denomina P1. Las personas cuyos eritrocitos expresan el antígeno P1 tienen el fenotipo P1 y las que carecen de él tienen el P2. El anti-P1 es generalmente un IgM natural que se encuentra en personas P2 y que no es activa a 37ºC pero en otras ocasiones es una IgG que si se activa a 37ºC, por lo que puede producir reacciones transfusionales hemolíticas. 6.4.-SISTEMA MNS Los principales antígenos de este sistema (M, N, S, s y U) son determinantes peptídicos presentes en las sialoglucoproteínas del eritrocito, conocidas como glicoforinas. Los antígenos M y N se asocian a la glicoforina A, mientras que los S, s y U se asocian a la glicoforina B. Los antígenos M y N (codificados por alelos codominantes) se destruyen con un tratamiento de proteólisis enzimática. El S y el s son menos sensibles, y los U suelen ser resistentes a enzimas. 6.4.-SISTEMA MNS Por lo general, los anticuerpos anti-M y anti-N son naturales; el anti-M es bastante frecuente y el anti-N es raro. Los anticuerpos anti-M pueden ser IgM o IgG. Las IgM suelen ser activas por debajo de la temperatura corporal y tienen un escaso interés clínico; las IgG pueden tener relevancia clínica si son activas a 37ºC. Los anticuerpos anti-M y anti-N muestran un efecto dosis, por lo que las muestras con anticuerpos débiles solo aglutinan eritrocitos homocigotos MM o NN. Los anticuerpos de este sistema pueden provocar hemólisis, por lo que hay que transfundir sangre que carezca de los antígenos correspondientes. 6.5.-SISTEMA KELL El antígeno Kell (K) es un inmunógeno potente, pero como es muy poco frecuente, es fácil encontrar sangre negativa para la transfusión (es muy improbable que la sangre donada lo contenga). El antígeno antitético del K (Kell) es el k (Cellano) que es muy frecuente y por ello es complicado encontrar sangre carente cuando es necesaria para una transfusión (lo más probable es que la sangre donada lo contenga). Otros antígenos antitéticos del sistema son los pares antitéticos Kpa y Kpb, Jsa y Jsb. 6.5.-SISTEMA KELL Los anticuerpos del sistema Kell son IgG inmunes y se detectan con la prueba de la antiglobulina indirecta. Este sistema contiene muchos antígenos clínicamente significativos, que pueden producir reacciones hemolíticas postransfusionales como la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN). 6.6.-SISTEMA KIDD Los antígenos primarios del sistema son Jka y Jkb, codificados por dos alelos codominantes del gen HUT11, que interviene en el transporte de urea a través de la membrana. El fenotipo Jk (a_b_) es raro. Los anticuerpos Kidd tienen carácter evanescente y después de la inmunización su título desciende hasta niveles que resultan indetectables, por lo que ocasionan frecuentemente reacciones hemolíticas retardadas. 6.7.-SISTEMA DUFFY El sistema está constituido por dos alelos codominantes localizados en el cromosoma 1 y presenta dos antígenos: Fya y Fyb. Estos antígenos son moderadamente inmunogénicos y se detectan mediante la prueba del antiglobulina indirecta o test de Coombs. Entre la población blanca son muy comunes los fenotipos Fy (a+b-), Fy (a+b+) y Fy (a-b+) y muy infrecuente el Fy(a-b-), que suele abundar entre la población negra. 6.7.-SISTEMA DUFFY Bioquímicamente los antígenos del sistema Duffy son glicoproteínas que tienen un enlace externo que puede ser destruido por enzimas tales como ficina, papaína y tripsina. Los antígenos Fya y Fyb poseen receptores para él parásito de la malaria (Plasmodium vivax), por lo que los individuos que son fenotípicamente Fy(a-b-) tienen una resistencia natural a este parásito. Los anticuerpos del sistema Duffy se observa más frecuentemente en individuos de raza negra y en pacientes politransfundidos. El anti- Fya es mucho más común que el anti-Fyb. 6.8.-SISTEMA LUTHERAN Las moléculas portadoras del sistema Lutheran son dos glicoproteínas de membrana ligadas una a otra procedentes del mismo gen. los principales antígenos Lutheran son el par antitético Lua y Lub; los anticuerpos causan patología leve. 7.-PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA HEMOCOMPATIBILIDAD La transfusión de sangre puede ser causa de distintas patologías. Destacamos las reacciones transfusionales, la enfermedad hemolítica del recién nacido y las anemias hemolíticas. 7.1.- REACCIONES TRANSFUSIONALES Durante las tres últimas décadas ha mejorado la seguridad en las transfusiones sanguíneas. Sin embargo, la transfusión con sangre incompatible continúa siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Una transfusión con sangre ABO incompatible produce la destrucción de los hematíes a nivel intravascular y es inmediata, produciendo coagulación intravascular diseminada (CID), fallo renal y muerte. Las causas más comunes se deben a fallos administrativos en la identificación de los pacientes o en las unidades de trasfundir. Las relaciones transfusionales pueden ser inmunológicas o infecciosas. 7.1.1- REACCIONES TRANSFUSIONALES INMUNOLÓGICAS Se deben a la presencia en la sangre de antígenos para los que el receptor tiene anticuerpos o es capaz de sintetizarlos. REACCIÓN TRANSFUSIONAL HEMOLÍTICA AGUDA Tiene lugar durante las 4 horas posteriores a la transfusión; se produce por la reacción de los anticuerpos existentes en el receptor con los hematíes transfundidos. La más habitual es debida al sistema ABO. Los anticuerpos se unen a los antígenos de los hematíes y activan el complemento, lo que ocasiona una hemólisis en el torrente vascular. A su vez, la hemólisis activa el sistema de coagulación y se produce una coagulación intravascular diseminada (CID), hipotensión, hemoglobinemia, hemoglobinuria, choque y fallo renal. Cuanto mayor sea el volumen de sangre transfundida más grave será la reacción por lo que es fundamental detener una transfusión en cuanto se observe cualquier reacción. REACCIÓN TRANSFUSIONAL HEMOLÍTICA RETARDADA La reacción se debe a una producción de anticuerpos que tienen lugar entre los 5 y los 14 días posteriores a la transfusión. Son anticuerpos que no están presentes antes de la transfusión, por lo que no es posible prever esta reacción a partir del estudio de una muestra pretransfusional. Cuando se producen los anticuerpos se detecta una bajada inexplicable de hemoglobina y una elevación de la bilirrubina, todo ello con poca sintomatología. En estos casos hay que identificar el antígeno causante de la reacción para que las sucesivas transfusiones que se realicen carezcan de él. REACCIÓN TRANSFUSIONAL FEBRIL NO-HEMOLÍTICA Se debe a anticuerpos del receptor dirigidos contra los leucocitos o las plaquetas de la sangre que recibe. Su incidencia disminuye con la leucorreducción de los componentes celulares sanguíneos. Se caracteriza por tiritona, fiebre y escalofríos a veces hipertensión, pero nunca hipotensión. LESIÓN PULMONAR AGUDA ASOCIADA A LA TRANSFUSIÓN Es un edema pulmonar no cardiogénico producido por transferencia de anticuerpos antigranulocito del donante al receptor. REACCIÓN ALÉRGICA (URTICARIA) Se produce por hipersensibilidad a alérgenos del plasma del donante. Ocasionalmente puede provocar reacciones anafilactoides en pacientes con defectos del IgA, debido a la IgA transfundida o por fármacos presentes en el plasma del donante. ENFERMEDAD POSTRANSFUSIONAL DEL INJERTO CONTRA HUÉSPED (EICH-T) Se produce en pacientes inmunodeprimidos y se debe a que los linfocitos existentes en los componentes sanguíneos transfundidos atacan a las células del huésped. La irradiación de los componentes sanguíneos previene el EICH-T porque destruye la capacidad de los linfocitos para replicarse. 7.1.2- REACCIONES TRANSFUSIONALES INFECCIOSAS Los componentes sanguíneos pueden trasmitir agentes infecciosos, bien procedentes del donante o bien por contaminación. REACCIÓN TRANSFUSIONAL SÉPTICA POR CONTAMINACIÓN BACTERIANA Se debe a la contaminación de los componentes sanguíneos transfundidos. En caso de detectarse esta reacción, hay que analizar las bolsas para identificar el microorganismo causante y obtener el antibiograma; mientras, se inicia un tratamiento con antibióticos de amplio espectro. Las bacterias que contaminan los concentrados de hematíes suelen ser gramnegativas y las que contaminan las plaquetas grampositivas. INFECCIÓN VIRAL Y OTRAS INFECCIONES Muchos virus pueden transmitirse a través de las transfusiones sanguíneas. virus de la hepatitis (A, B, C y G), virus de Epstein-Barr, VIH, HTLV-I y II, citomegalovirus, etc. También se pueden transmitir enfermedades bacterianas consideradas de transmisión sexual como la sífilis (por transmisión de Treponema pallidum) y enfermedades parasitarias como la enfermedad de Chagas (por transmisión de Trypanosoma cruzi). Para evitar estos contagios la normativa establece unas pruebas que hay que realizar obligatoriamente a la sangre que se va a usar en transfusiones, así como una serie de criterios de exclusión de donantes. 7.2.- ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) Se denomina enfermedad hemolítica del recién nacido a la hemólisis fetal o neonatal de los hematíes debido al paso de anticuerpos maternos atraviesan la barrera placentaria. La hemólisis ocasiona anemia y aumento de bilirrubina; si la hemólisis es grave puede producir la muerte intraútero. El aumento de bilirrubina no produce un riesgo durante la vida uterina porque se elimina a través de la placenta, pero si persiste tras el parto puede depositarse en el cerebro y producir Kernicterus o encefalopatía neonatal bilirrubínica. 7.2.- ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) Cuando los hematíes de la madre no contienen un determinado antígeno que sí contiene el del feto, la madre puede sensibilizarse y producir anticuerpos contra ese antígeno. Si los anticuerpos atraviesan la barrera placentaria provocan la enfermedad hemolítica del recién nacido. 7.2.- ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) Los anticuerpos producidos pueden ser de distintos tipos: Si son IgM no habrá EHRN debido a que son moléculas de gran tamaño y no pueden atravesar la placenta. Las IgG, en cambio, si pueden atravesarla y unirse al antígeno presente en los hematíes del feto, produciendo la hemólisis. Este paso de anticuerpos comienza en la semana 24 de la gestación, por lo que no se produce la hemólisis antes de esa fecha. Las IgG se identifican mediante la prueba indirecta de antiglobulina (Coombs), o por otros potenciales con alto contenido de proteínas (albúmina) o baja fuerza iónica (LISS), enzimas proteolíticas (ficina) o polietilenglicol (PEG). 7.2.- ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) Las IgG que producen EHRN con más frecuencia son anti-D (anti Rh) y en menor medida, anticuerpos anti-Kell, aunque puede haber otros. Afortunadamente suele cursar con un cuadro de ictericia leve que cede con fototerapia. La EHRN debida al sistema ABO se produce por lo general en fetos y recién nacidos A o B de madres O; a diferencia de lo que sucede en la incompatibilidad Rh, puede ocurrir en el primer embarazo. 7.2.1.- CONTROL ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO A todas las mujeres, tras confirmarse un embarazo, hay que hacerles el grupo ABO y Rh, incluyendo prueba del D débil en los casos con Rh negativo, además de un estudio de anticuerpos irregulares. A partir de estos resultados: Para evitar la inmunización frente al antígeno D a las mujeres con Rh negativo se les debe administrar una dosis de inmunoglobulina anti-Rh a las 28 semanas de embarazo y otra dentro de las 72 horas siguientes al primer parto si el recién nacido es Rh positivo; también se administra en situaciones de riesgo de sensibilización como abortos, amniocentesis, etc. 7.2.1.- CONTROL ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO Con las técnicas moleculares es posible obtener ADN fetal presente en la circulación materna ya sea de células fetales o de ADN fetal libre en el plasma materno y así conocer el Rh fetal. Esto es importante para aplicar la antiglobulina anti-Rh y también para mujeres sensibilizadas con pareja heterocigotos del gen RHD de manera que el feto Rh negativo no requiera posteriores evaluaciones mientras que el Rh de positivo debe ser controlado a lo largo de la gestación y en ocasiones es preciso realizar transfusión intrauterina. Tras el parto, debe realizarse al recién nacido una prueba de antiglobulina directa e investigación de posible hemólisis para realizar el tratamiento adecuado. 7.3.-ANEMIAS HEMOLÍTICAS Como ya sabéis las anemias hemolíticas se deben a la destrucción de los hematíes (hemólisis). Algunas de ellas se deben a problemas de hemocompatibilidad. Anemia hemolítica autoinmune (AHAI) Por anticuerpos calientes Por anticuerpos fríos o crioaglutininas Hemoglobinuria paroxística por frío Anemia hemolítica inducida por fármacos 7.3.1- AHAI POR ANTICUERPOS CALIENTES Los Ac muestran su máxima reactividad a 37ºC y son predominantes de clase IgG. Los hematíes recubiertos con los anticuerpos y/o complemento son destruidos por los macrófagos (hemólisis extravascular). Cuando no se identifica una causa aparente se denomina AHAI idiopática. Pero a menudo se debe a una alteración secundaria a enfermedades como linfoma, infecciones, uso de algunos fármacos en tratamientos con aloinmunización en trasplantes de médula ósea y de órganos. 7.3.2- AHAI POR ANTICUERPOS FRÍOS O CRIOAGLUTININAS Los Ac reaccionan de forma óptima a temperaturas inferiores a 37ºC y la mayoría de ellos son IgM. Predominan en las mujeres mayores de 50-60 años. Cuando se producen en grandes cantidades se unen a los hematíes en las zonas corporales periféricas y activan la cascada del complemento produciéndola lisis directa del hematíe (hemólisis intravascular) o la destrucción hepática y esplénica (bazo) de los mismos (hemólisis extravascular). La causa puede ser idiopática o secundaria. Algunos ejemplos de secundaria son: Síndromes linfoproliferativo dando lugar a una anemia moderado con ictericia y esplenomegalia (agrandamiento del bazo) Infecciones como mononucleosis, VIH e infecciones por Mycoplasma pneumoniae. 7.3.3-HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA POR FRÍO Los Ac son de la clase IgG; se unen al eritrocito a bajas temperaturas, pero causan la hemólisis a 37ºC, cuando se completa la secuencia del complemento. Se distingue una forma idiopática y otra secundaria a sífilis e infecciones del tracto respiratorio en niños. 8.-TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA HEMOCOMPATIBILIDAD La aglutinación es la técnica más utilizada para la detección de antígenos eritrocitarios, pero la metodología ha sufrido sucesivas transformaciones, hasta su aplicación en tarjetas con columnas de gel, que pueden usarse en sistemas automatizados. 8.-TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA HEMOCOMPATIBILIDAD Las técnicas moleculares ayudan a la resolución de problemas que no pueden ser resueltos con técnicas de hemaglutinación, como son: o La imposibilidad de identificar ciertos antígenos debido a la débil reactividad de algunos reactivos frente a ellos. o La tipificación de pacientes con transfusiones recientes. o La identificación de riesgo de EHRN. o La mejora de la fiabilidad de las unidades antígeno negativas para transfusión. Cabe destacar que las técnicas moleculares son muy costosas y que la identificación de un genotipo no significa necesariamente que todos los antígenos codificados en él se vayan a expresar en los hematíes. 8.1.-TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Todas las técnicas de aglutinación son técnicas inmunológicas que se basan en la capacidad que tienen algunos antígenos para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista. Esto es posible porque las moléculas de anticuerpos tienen varios sitios de unión al antígeno, 2 en el caso de los IgG 10 y en el caso de las IgM, lo que les permite unirse a dos o más antígenos próximos. 8.1.-TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Cuando los antígenos son particulados y tienen una gran densidad antigénica (múltiples moléculas de antígeno en la superficie de las partículas) los anticuerpos sirven de puentes de unión entre partículas próximas formando una red de partículas unidas que precipitan en forma de agregados. Los anticuerpos que dan mejores resultados en este tipo de técnicas son los IgM 8.1.-TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN En las técnicas de aglutinación aplicadas en pruebas de hemocompatibilidad, el antígeno particulado es el hematíe que porta en su membrana numerosas moléculas antigénicas de los grupos sanguíneos. En este caso, la formación de inmunocomplejos se detecta por hemaglutinación (macro agregados de hematíes visibles a simple vista) Para detectar un antígeno presente en un hematíe se debe poner en contacto una suspensión de los hematíes con el anticuerpo específico para ese antígeno. Para detectar un anticuerpo presente en plasma o suero, se debe poner en contacto una muestra de suero con hematíes que contengan el antígeno específico para ese anticuerpo. 8.2.-PREPARACIÓN DE MUESTRAS Para aplicar correctamente estas técnicas se requiere: Preparar adecuadamente la muestra de sangre Por ejemplo, para determinar la presencia o no de un antígeno eritrocitario será necesario elaborar una suspensión de células con una concentración adecuada y libre de elementos que puedan generar falsos positivos. Disponer de los antígenos o anticuerpos específicos para la determinación Para determinar la presencia o no de un antígeno eritrocitario es necesario disponer de anticuerpo específico para ese antígeno, o para determinar un anticuerpo sérico se deberá disponer del antígeno eritrocitario correspondiente. 8.2.1.-PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN DE HEMATÍES Para que estas determinaciones sean válidas hay que: Lavar los hematíes con solución salina para eliminar el plasma, hematíes hemolizados y coágulos que puedan ocasionar falsos positivos. Seguidamente, se prepara una suspensión de hematíes cuya concentración estará determinada por las pruebas que se vayan a realizar a continuación. 8.2.1.-PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN DE HEMATÍES Para hacer esta preparación se toma una muestra de sangre recogida en un tubo con EDTA y se sigue este procedimiento: 1. Centrifugar los tubos con las muestras 5 minutos a 3500 rpm. 2. Verificar que los tubos no presentan hemólisis, ni coágulos de fibrina. Si se detecta presencia de fibrina, centrifugar nuevamente a 3500 rpm otros 5 minutos. 3. Retirar el plasma sobrenadante con una pipeta Pasteur dejando los hematíes con la mínima cantidad de plasma posible. 4. Poner 0,2-0,5 ml de hematíes en un tubo de ensayo. 8.2.1.-PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN DE HEMATÍES 5. Agregar solución salina al 0,9 hasta 1 cm del borde del tubo. Tapar el tubo e invertir suavemente varias veces para que los hematíes se le resuspendan en la solución salina. 6. Centrifugar durante 2 minutos a 3500 rpm y decantar la solución salina. 7. Agregar un poco de solución salina y agitar para resuspender los hematíes. De esta forma se completa un lavado. 8. Repetir los pasos 5 a 7 hasta completar 3 lavados. En el último, la solución salina debe quedar clara sin signos de hemólisis. 9. Agregar solución salina. La concentración de hematíes que se debe conseguir depende de la técnica que se vaya a aplicar. 8.2.2.-PREPARACIÓN DE CÉLULAS A, B Y O Para realizar pruebas para determinar anticuerpos en suero se necesita disponer de los antígenos correspondientes. El procedimiento es el siguiente: 1. Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo A y practicarle una prueba con lectina anti-A1 para verificar que es a A1. 2. Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo B 3. Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo O 4. Centrifugar las muestras 5 minutos a 3500 rpm y decantar el plasma sobrenadante con una pipeta Pasteur. 8.2.2.-PREPARACIÓN DE CÉLULAS A, B Y O 5. Colocar 1 ml de paquete globular en un tubo de ensayo y lavar las células 4 veces con solución salina (las centrifugaciones son de 3500 rpm, 5 min). Descartar cada vez el sobrenadante, en el último lavado procurar eliminarlo completamente. 6. Tomar el recipiente destinado para el almacenamiento que corresponda, que previamente ha sido esterilizado y etiquetado e introducir en el 0,5ml de hematíes lavados y 9,5 ml de solución salina. 7. Almacenar a 4ºC. Los frascos se deben refrigerar rápidamente porque a temperatura ambiente las células tienden a hemolizarse. La vigencia de estos preparados es de un máximo de 7 días y si antes de este tiempo se detecta hemólisis se debe descartar. 8.3.-AGLUTINACIÓN EN TUBO Y EN PLACA Las metodologías clásicas que se siguen aplicando son las técnicas de aglutinación en tubo en placa o en microplaca. 8.3.1.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN PLACA Es una técnica que tiene muchas aplicaciones, la más tradicional en hematología es la determinación del grupo ABO, cuyo procedimiento básico es el siguiente: 1. Depositar sobre una placa y con una separación de unos centímetros una gota de suero anti-A, un anti-B y un anti-AB 2. Depositar una gota de hematíes problema en suspensión al 10% junto a la gota de anti-A, mezclar ambas gotas con una varilla haciendo un movimiento circular hasta conseguir un círculo de 2 2,5 cm de diámetro. 3. Repetir con los otros antisueros. 4. Aplicar a la placa un suave movimiento de rotación. 5. Observar cada gota y ver si se ha producido aglutinación La presencia de aglutinación en una gota indica que la sangre es positiva para ese grupo 8.3.1.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN PLACA 8.3.1.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN PLACA AGLUTINACIÓN EN PLACA GRUPO Anti-A Anti-B Anti-AB + - + A B AB O 8.3.2.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN MICROPLACA La técnica de aglutinación se puede realizar en microplacas que cuentan con un número variable de pocillos en los que tienen lugar las reacciones. Estos pocillos están tapizados con anticuerpos. Para usarlas, se van depositando las suspensiones de hematíes de las muestras de estudio en los pocillos, se incuba y se observa si hay aglutinación. Los pocillos con reacción positiva presentan un aspecto rojo uniforme porque los hematíes se unen a los anticuerpos y cubren la superficie del pocillo mientras que, los pocillos con reacciones negativas presentan un botón celular en el centro del pocillo porque los hematíes que no se han unido a los anticuerpos sedimentan en la región central. En la placa los pocillos deben estar rotulados mediante letras en vertical y números en horizontal de forma que cada pocillo se identifica con una letra y un número para identificar correctamente cada muestra. 8.3.2.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN MICROPLACA 8.3.3.-TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN TUBO El fundamento es el mismo, pero la prueba se realiza en tubos. Se realiza de la siguiente manera: 1. Pipetear en un tubo pequeño de hemólisis una gota de antisuero correspondiente y una gota de una suspensión de los hematíes en estudio. 2. Mezclar por agitación y centrifugar un minuto a 1000 rpm 3. Visualizar la presencia de aglutinación, dando suaves toques en la base del tubo: Si no hay aglutinación los hematíes se resuspenden homogéneamente, mientras que si hay aglutinación se observan grandes grumos que no se disgregan. 8.4.- AGLUTINACIÓN EN COLUMNA DE GEL La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los eritrocitos que hayan aglutinado, lo cual se consigue mediante un proceso de centrifugación en un gel poroso colocado en una columna. 8.4.- AGLUTINACIÓN EN COLUMNA DE GEL El tamaño de poro del gel permite el paso de los hematíes que no han reaccionado con el antisuero y que por tanto mantienen sus membranas intactas y elásticas. Por el contrario, el tamaño de los agregados y la pérdida de elasticidad de las membranas eritrocitarias por su reacción con el antisuero, impiden o dificultan su migración a través de la columna de gel. En consecuencia, en las reacciones fuertemente positivas los hematíes aglutinados son retenidos en la superficie de la columna- En las reacciones débilmente positivas los microagregados se distribuyen en la zona media de la columna En las reacciones negativas los hematíes acumulan en el fondo de la columna. 8.4.- AGLUTINACIÓN EN COLUMNA DE GEL 8.4.1- TARJETAS DG GEL Las DG Gel son tarjetas con varias columnas de gel, en cada una de las cuales tiene lugar una prueba hematoinmunológica. Existen distintos tipos de tarjetas según la combinación de pruebas que incluyan: ABO, Rh, detección de anticuerpos irregulares, pruebas cruzadas, test de Coombs directo e indirecto. 8.4.1- TARJETAS DG GEL Las columnas tienen las siguientes partes: Cámara de reacción/incubación: Es la zona donde se deposita la muestra y tiene lugar la reacción antígeno-anticuerpo. Cuello: Proporciona una mayor resistencia a la caída de los reactivos hacia el gel de la columna, debido a que en esta zona se produce un efecto vacío. Columna: Contiene un gel compuesto por microesferas de dextranos que permite una alta definición de la reacción aglutinación, debido al tamaño de sus partículas y una distribución globular homogénea. Fondo en forma de V que proporciona mayor definición de los resultados negativos o compatibles y débilmente positivos. 8.4.2-LA AUTOMATIZACIÓN Las tarjetas DG Gel funcionan en procedimientos manuales, semiautomatizados y automatizados. Los equipos automatizados suelen incluir: Tarjetas de gel para las pruebas inmunohematológicas, los reactivos y hematíes necesarios. Sistema automatizado de procesamiento de tarjetas que incluyen la dispensación automática de muestras y reactivos, la centrifugación e incubación integradas de las tarjetas y las de lectura automatizada de los resultados. Sistemas de seguridad para detectar discrepancias e incidencias y alertar sobre ellas, sistema manual de apoyo que permite suplir cualquier fallo de equipo realizando manualmente el proceso afectado. Sistema informático comunicado con el centro de transfusión y con el sistema informático del hospital Etiquetas para tubos y brazaletes para pacientes, generalmente con código de barras para trazabilidad y seguridad transfusional 8.5.-LECTURA DE LOS RESULTADOS Es importante determinar la intensidad de la aglutinación que se valora en una escala del 0 (no aglutinación) a 4+ (aglutinación con un fondo limpio que no tiene hematíes sin aglutinar). 9.-PRUEBAS DE HEMOCOMPATIBILIDAD Las pruebas de hemocompatibilidad están encaminadas a evitar la reacción hemolítica aguda, es decir, asegurar la compatibilidad entre el donante y el receptor. 9.1.-DETERMINACIÓN DEL GRUPO ABO Esta tipificación se hace de forma doble: Por determinación directa: grupo celular. Se usan anticuerpos anti-A anti-B para establecer la presencia o ausencia de antígenos A y B en los hematíes. Por determinación en inversa: grupo sérico. Se usan hematíes reactivos A y B para establecer la presencia o ausencia de anticuerpos anti A y anti B en el suero. Los dos grupos obtenidos deben ser coherentes. Por ejemplo, un grupo celular A se debe corresponder con un grupo sérico anti-B 9.1.-DETERMINACIÓN DEL GRUPO ABO De forma general hay que tener en cuenta que: Los anticuerpos anti A y anti B séricos de la mayoría de los pacientes y donantes suelen ser demasiado débiles para aglutinar los glóbulos rojos sin centrifugación o una incubación prolongada, por lo que son necesarias pruebas serológicas con métodos que detecten los anticuerpos en tubos, microplacas o aglutinación en columnas. En la determinación del grupo celular, además de anticuerpos anti-A y anti-B, se usan también anticuerpos anti-AB para no pasar por alto antígenos A y B débiles. Los anticuerpos de este reactivo poseen gran afinidad por los antígenos débiles y pueden provocar aglutinación aunque los anti-A y los anti-B no la hayan provocado. 9.1.-DETERMINACIÓN DEL GRUPO ABO De forma general hay que tener en cuenta que: Los principales subgrupos dentro del sistema ABO son los subgrupos A1 y A2. Recordemos que la distinción serológica de las células A1 y A2 se logra mediante pruebas que utilizan lectina anti-A1 de Dolichos biflorus; los que aglutinan se clasifican como A1 y los que no como A2. 9.2.-DISCREPANCIAS ENTRE LAS PRUEBAS CELULAR Y SÉRICA Las reacciones que se observan entre el grupo directo el grupo inverso o sérico son complementarias y representan un buen control de calidad, aunque a veces, existen discrepancias que hay que investigar. 9.2.1.-DISCREPANCIAS POR PROBLEMAS DE HEMATÍES ANTÍGENO A DÉBIL O AUSENTE. No se detecta antígeno A, pero tampoco anticuerpo anti-A en el suero. ANTÍGENO B ADQUIRIDO. Se detecta una pequeña cantidad de antígeno B y también anticuerpos anti-B. Esto ocurre en pacientes con cáncer colorrectal, infección por bacterias gram negativas y obstrucción intestinal. GLÓBULOS POLIAGLUTINABLES. Se detectan antígenos A y B y también anticuerpos anti-A anti-B (el grupo sérico es el correcto en esta situación). Este es un fenómeno posible in vivo o in vitro por diversas causas que hacen a los eritrocitos aglutinen frente a cualquier suero. 9.2.1.-DISCREPANCIAS POR PROBLEMAS DE HEMATÍES CAMPOS MIXTOS. Es el patrón en el que unos hematíes aglutinan y otros no, quedando en suspensión. Esto se debe a la presencia de más de una población celular. Existen 3 causas: Transfusión ABO no isogrupo reciente, quimerismo (un organismo único compuesto por células con más de un genotipo distinto) o hematíes de los subgrupos A débiles frente a suero anti-A ANTICUERPOS ESPERADOS NO PRESENTES: No se detectan los anticuerpos ABO recíprocos. Se observa en personas de avanzada edad y neonatos. El test de Coombs directo negativo debe alertar a la posibilidad de un antígeno débil en los eritrocitos. 9.2.2.-DISCREPANCIAS POR ERRORES TÉCNICOS Conservación incorrecta de los antisueros. Muestra de sangre contaminada. Se detecta por el olor desagradable y además se advierte hemólisis. Formación de pilas de monedas o roleaux. Suele producirse en el suero de pacientes con proporción albúmina/globulina anormal y se puede confundir con hemaglutinación. Ante esta situación se agrega una gota de solución salina hipertónica (1,5%). Si es una pseudoaglutinación las formaciones desaparecen mientras que si es una aglutinación verdadera persiste. 9.2.2.-DISCREPANCIAS POR ERRORES TÉCNICOS Presencia de gelatina de Wharton. Esta recubre el cuerpo y el cordón umbilical del recién nacido, y a menudo contaminan las muestras de sangre del cordón umbilical. Para retirarla se lavan las células en solución salina calentada a 37ºC varias veces. Presencia de autoanticuerpos y anticuerpos de reacción en frío. La sangre de algunos pacientes contiene autoanticuerpos que reaccionan con las células ABO en la determinación inversa del grupo. Se corrige incubando la preparación a 37ºC. Técnica incorrecta. Resultados de no aplicar la técnica correspondiente de forma rigurosa. Por ejemplo, no usar una solución celular con la concentración correcta, no aplicar los parámetros establecidos para la centrifugación o incubación o no interpretar los resultados según las pautas 9.3.-DETERMINACIÓN DEL GRUPO RH En la tipificación Rh de rutina de donantes y pacientes, solo es preciso determinar el antígeno D. La investigación de otros antígenos Rh solo se efectúa en circunstancias especiales como las pruebas de paternidad. Las técnicas tienen el fundamento y el funcionamiento básico que se ha explicado. También se determina el positivo o negativo en función de que exista o no aglutinación y se valora la intensidad de la aglutinación con una escala de 0 a 4+. 9.4.- DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES Los anticuerpos aloinmunes contra antígenos eritrocitaria diferentes a los anticuerpos naturales del sistema ABO se denominan anticuerpos irregulares (AI). Un aloanticuerpo es un anticuerpo producido por un individuo que está dirigido contra un antígeno eritrocitario que el individuo no tiene y suelen aparecer por: Respuesta a la exposición a un antígeno eritrocitario extraño, por transfusión o trasplante. Incompatibilidad materno fetal Se pueden detectar de forma idiopática. Los anticuerpos irregulares más frecuentes son anti-Lea anti-K anti-E y anti-D. 9.4.- DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES Si se detectan AI, se realiza una prueba autocontrol, en la que se enfrenta el suero del receptor con sus propios eritrocitos. Prueba de autocontrol positiva. Es probable que la persona esté produciendo autoanticuerpos, es decir anticuerpos producidos por un individuo que están dirigidos contra un antígeno que expresan sus eritrocitos. A pesar de ello, se deben determinar si existen aloanticuerpos enmascarados por esos autoanticuerpos. Prueba de autocontrol negativas. Se confirmaría que se trata de aloanticuerpos. 9.4.1.- TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES Las técnicas se basan en la aglutinación y así como en las pruebas anteriores era indiferente usar suero (fibrinógeno) o plasma en este caso se debe tener en cuenta que el uso de plasma podría impedir la detección de anticuerpos irregulares que se revelan solamente por la presencia de complemento adherido a los eritrocitos. Mediante una prueba de screening enfrentamos el suero de estudio con dos o tres suspensiones de hematíes de composición antigénica conocida que incluyen todos los posibles antígenos con importancia clínica. Los paneles de hematíes para la identificación de anticuerpos irregulares deben expresar al menos los siguientes antígenos: D,C,E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb. 9.4.1.- TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES El suero en estudio se enfrenta con cada una de las células del panel y se registra la presencia o ausencia de aglutinación en cada caso. El perfil de aglutinación se compara con una tabla que recoge la composición antigénica de cada tipo celular, lo que permite la identificación inequívoca del presente AI. Tanto para detección como para identificación de anticuerpos irregulares, las pruebas de aglutinación se deben realizar a temperatura ambiente a 37º C y con reactivo de Coombs. 9.4.1.- TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES 9.5.- PRUEBAS CRUZADAS Una vez considerados los grupos y los anticuerpos irregulares se realiza un último grupo de pruebas también basadas en la aglutinación que enfrentan la sangre seleccionada para la transfusión con el receptor concreto. Existen dos tipos de pruebas cruzadas: PRUEBA CRUZADA MAYOR, que detecta anticuerpos en el receptor contra antígenos presentes en las células que se van a transfundir. Utiliza suero o plasma del receptor y hematíes del donante. PRUEBA CRUZADA MENOR, que detecta anticuerpos en el donante contra antígenos presentes en los hematíes del receptor. Utiliza suero del donante y hematíes del receptor. 10.- PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGIAS DIAGNÓSTICAS Estas pruebas no forman parte de los estudios rutinarios de compatibilidad, pero permiten diagnosticar patologías hematoinmunológicas. 10.1.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA Las pruebas de antiglobulina o test de Coombs consisten también en reacciones de hemaglutinación. Se basan en el uso del reactivo de Coombs que es un antisuero animal contra globulinas humanas y/o complemento. El reactivo de Coombs puede ser: Monoespecífico: con anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM o anti-C3-C4. Poliespecífico: incluye anti-IgG y anti-C3. Existen dos variantes de esta prueba la de antiglobulina directa y la de antiglobulina indirecta 10.1.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) En la prueba de antiglobulina directa se enfrentan los eritrocitos del paciente con suero antiglobulina humana y/o anticomplemento. Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos (normalmente IgG) unidos a antígenos eritrocitarios de membrana y/o complemento (C3) unido a la membrana de los hematíes. Es especialmente útil para diagnosticar anemias hemolíticas autoinmunes y por fármacos. La prueba se realiza especialmente a donantes de sangre y a neonatos Rh positivos nacidos de madres Rh negativas candidatas para profilaxis con inmunoglobulina anti-Rh. 10.1.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) El procedimiento básico para la realización de esta prueba en tubos es el siguiente: 1. Preparar una suspensión de hematíes al 50% y lavar 4 veces utilizando una solución isotónica. Cuando se practica neonatos, hay que hacer 6 lavados para eliminar la gelatina de Wharton. 2. Colocar una gota de la suspensión en un tubo de hemólisis y agregar una gota de reactivo de Coomps. 3. Mezclar por agitación e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente. 4. Centrifugar a 1000 rpm durante un minuto. 5. Observar si hay aglutinación golpeando suavemente con los dedos en el fondo del tubo para despegar el botón hemático, si existe aglutinación el resultado de la prueba es positivo. Todos los tubos negativos, se someten a un control de Coombs que consiste en añadir una gota de hematíes sensibilizados (reactivo comercial) y volver a centrifugar, con lo que se producirá aglutinación. Esto indica que el suero de Coombs funciona bien y no ha sido bloqueado por inmunoglobulinas libres. Si el control se considera negativo se invalida la prueba porque el suero no funciona bien. 10.1.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) 10.2.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA (PAI) Permite aumentar la sensibilidad de las pruebas clásicas de hemaglutinación. Concretamente, permite detectar la formación de complejos antígeno-anticuerpo en casos en los que la cantidad de antígeno es muy pequeña o cuando la concentración de anticuerpos es muy baja o se trata de anticuerpos no aglutinantes. Cuando la técnica clásica de hematoaglutinación da un resultado negativo a pesar de que hay unión de anticuerpos a antígenos eritrocitarios, una segunda reacción de los anticuerpos contenidos en el reactivo de Coombs con las inmunoglobulinas unidas a los antígenos propicia la formación de macroagregado y aglutinación. 10.2.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA (PAI) Un ejemplo es la utilización para la detección en el suero materno de inmunoglobulina anti-Rh, la técnica se aplica en dos pasos: 1. Incubación del suero materno con hematíes Rh positivos. Si hay anticuerpos anti-Rh se unirán los hematíes. Esta incubación suele realizarse a 37ºC. 2. Incubación de la mezcla anterior con reactivo de Coombs, si los hematíes estaban recubiertos de anticuerpos anti-Rh procederán del suero materno y se producirá su aglutinación. Como en la PAD, los tubos negativos, se someterán a un control de Coombs con hematíes sensibilizados para asegurar el buen funcionamiento del reactivo. 10.2.- PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA (PAI) 10.3.-TEST DE DONATH-LANDSTEINER La hemoglobinuria paroxística por frío suele dar positivo a C3 y negativo a IgG en la prueba de antiglobulina directa. Pero este resultado no es determinante y es necesaria una prueba específica: el test de Donathd-Lahnsteiner. El procedimiento es el siguiente 1. Extraer dos muestras de sangre del paciente en dos tubos sin anticoagulante. 2. Poner las pruebas en un baño a 37º durante 10 minutos. 3. Centrifugar las muestras 10 minutos a 3000 rpm y separar el suero. 4. Preparar 4 tubos rotulados con los números 1,2,3 y 4. Depositar dos gotas de suero del paciente y dos gotas de una suspensión eritrocitos O. 5. Añadir al tubo 4, dos gotas de suero normal fresco como fuente de complemento. 10.3.-TEST DE DONATH-LANDSTEINER 6. Incubar Tubo 1 en hielo 0 ° C durante 90 minutos. Tuvo 2 a 37 °C durante 90 minutos. Tuvo 3 a 0ºC durante 30 minutos y seguidamente a 37ºC durante 60 minutos. Tuvo 4 a 0ºC durante 30 minutos y seguidamente a 37ºC durante 60 minutos. 7. Concluidas las incubaciones centrifugar los 4 tubos a 3000 rpm durante 10 minutos. 8. Observar el aspecto de los sobrenadantes en busca de signos de hemólisis. 9. La prueba se considera positiva cuando se detecta hemolisis en los tubos 3 y 4 y no en los tubos 1 y 2