Materiały wykładowe Genetyka bakterii PDF 20.11.2024

Marzena Gajęcka_Materiały wykładowe_Genetyka bakterii – wybrane treści 20.11.2024 Genom bakteryjny – zbiór wszystkich genów, które znajdują się w bakterii – na chromosomie oraz na pozachromosomalnych elementach genetycznych (plazmidy). W chromosomie bakterii znajdować się może wbudowany materiał...

Marzena Gajęcka_Materiały wykładowe_Genetyka bakterii – wybrane treści 20.11.2024 Genom bakteryjny – zbiór wszystkich genów, które znajdują się w bakterii – na chromosomie oraz na pozachromosomalnych elementach genetycznych (plazmidy). W chromosomie bakterii znajdować się może wbudowany materiał genetyczny bakteriofagów. W odróżnieniu do Eukaryota, posiadających zazwyczaj dwie osobne kopie każdego chromosomu, bakterie posiadają tylko jeden chromosom – są haploidalne, dlatego każda zmiana w genach (np. mutacja) będzie miała znacznie wyraźniejszy efekt, w porównaniu do komórek diploidalnych. Nukleoid to obszar cytoplazmy komórek prokariotycznych bakterii i sinic, w którym znajduje się kolista nić kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) w postaci genoforu. Jej odpowiednikiem u eukariontów jest jądro komórkowe, które dodatkowo otoczone jest błoną jądrową. Translacja Translacja to proces syntezy łańcucha polipeptydowego białek na matrycy mRNA - przeniesienie informacji genetycznej zawartej pierwotnie w DNA na konkretną strukturę białka, zależną od uszeregowania aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, Powstawanie łańcucha polipeptydowego sterowane jest przez sekwencję mRNA. Translacja odbywa się w cytoplazmie lub na błonach siateczki śródplazmatycznej szorstkiej. Proces ten jest katalizowany przez rybosom obejmujący podjednostkami przesuwającą się nić mRNA. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, małej i dużej, które są zbudowane z białek i rRNA, a funkcję katalityczną pełnią enzymy (rybozymy) zawarte w dużej podjednostce rybosomu. Translacja na jednej cząsteczce mRNA może być prowadzona przez wiele rybosomów równocześnie. Translacja u prokariontów_inicjacja Inicjacja translacji wymaga małej i dużej podjednostki rybosomu, czynników inicjacji translacji, GTP (jako źródła energii) oraz inicjatorowego aminoacylo-tRNA (ze związanym aminokwasem formylometioniną), Mała podjednostka rybosomu wiąże się z czynnikiem inicjacji translacji IF3. 16S rRNA z małej podjednostki rybosomu 30S rozpoznaje i wiąże komplementarną sekwencję Shine-Dalgarno w mRNA. Czynnik inicjacji translacji IF2 wiąże się z fMet-tRNA i pomaga mu związać się z małą podjednostką rybosomu, W rybosomie są trzy miejsca, w których może znajdować się tRNA: 1 miejsce A, przez które wchodzi aminoacylo-tRNA (z wyjątkiem pierwszego aminoacylo-tRNA - fMet- tRNA, które wchodzi przez miejsce P), miejsce P, gdzie tworzy się peptydylo-tRNA, oraz miejsce E, przez które tRNA opuszcza rybosom po oddaniu aminokwasu. Aminoacylo-tRNA (fMet- tRNA) znajdujące się w miejscu P rybosomu rozpoznaje kodon inicjujący AUG. Inicjacja kończy się przyłączeniem dużej podjednostki rybosomu i uwolnieniem czynników inicjacji translacji. https://pl.wikipedia.org/wiki/Translacja_(genetyka) Translacja u prokariontów_elongacja i terminacja 2  Po wejściu fMet-tRNA do miejsca P miejsce A otwiera się i umożliwia związanie się kolejnego aminoacylo-tRNA. W tym wiązaniu bierze udział czynnik elongacji translacji EF-Tu. W ten sposób rozpoczyna się elongacja. Rosnący polipeptyd odłącza się od tRNA w miejscu P, a między ostatnim aminokwasem a aminokwasem przyłączonym do tRNA w miejscu A tworzy się wiązanie peptydowe. Reakcja ta jest katalizowana przez rybozym peptydylotransferazę - 23S rRNA w podjednostce 50S rybosomu. Rybosom przesuwa się o trzy nukleotydy na nici mRNA, z którą są związane tRNA. Dzięki temu polipeptyd przesuwa się z miejsca A do miejsca P, a nienaładowane tRNA trafia do miejsca E. Powstające białko wysuwa się z rybosomu przez otwór w dużej podjednostce. Elongacja trwa, dopóki rybosom nie natrafi na jeden z kodonów terminacyjnych w mRNA. Kiedy kodon terminacyjny znajdzie się w miejscu A rybosomu, następuje terminacja translacji. Kodony terminacyjne nie są rozpoznawane przez żadne tRNA, tylko przez czynniki uwalniające, które są odpowiedzialne za hydrolizę wiązania estrowego peptydylo—tRNA i uwolnienie nowo powstałego białka z rybosomu. U prokariontów za proces terminacji translacji odpowiedzialne są dwa czynniki — RF1 i RF2. Czynnik RF1 rozpoznaje kodony UAA i UAG, a RF2 rozpoznaje kodony UAA i UGA. Po terminacji mRNA i tRNA są uwalniane z rybosomu, a on sam dysocjuje na podjednostki, które mogą zostać ponownie wykorzystane do inicjacji translacji kolejnego mRNA. 27.11.2024 Materiały wykładowe Genetyka bakterii – wybrane treści, c.d. Ekspresja genów u drobnoustrojów_1 Bakterie wytworzyły mechanizmy służące szybkiej i skutecznej adaptacji wobec zmieniających się warunków środowiskowych, mechanizmy te umożliwiają koordynację i regulację ekspresji genów odpowiedzialnych za tworzenie wieloskładnikowych struktur lub enzymów szlaków metabolicznych; Bakterie mogą produkować do 6 czynników sigma (dla polimerazy RNA, biorącej udział w transkrypcji) stosowanych w regulacji odpowiedzi na stres, szok, głód, a także do koordynacji produkcji skomplikowanych struktur, np. rzęsek; Określone stężenie produkowanych przez bakterie małych cząsteczek sygnałowych (autoinduktorów) prowadzi do włączenia genów zjadliwości, np. w procesie tworzenia biofilmu przez Pseudomonas spp.; Geny niektórych mechanizmów zjadliwości zgrupowane są w tzw. wyspach patogeniczności, znajdujących się pod kontrolą jednego promotora, co umożliwia jednoczesną ekspresje genów w sprzyjających warunkach; Ekspresja genów u drobnoustrojów_2 3  U bakterii istnieje mechanizm kontroli ekspresji genów tzw. regulowanie transkrypcji przez translację. Brak błony jądrowej u Prokaryota umożliwia rybosomom łączenie się z nicią mRNA, której część wciąż ulega transkrypcji z matrycy DNA. ‚Ruch’ rybosomów może doprowadzić do powstania na mRNA pętli, która uniemożliwia polimerazie RNA dalszą syntezę, co skutkuje terminacją transkrypcji; Proces transkrypcji ulega kontroli negatywnej oraz pozytywnej: Geny znajdujące się pod kontrolą negatywną ulegają ekspresji, dopóki ich transkrypcja nie zostanie zahamowana przez białko represora (białko represora wiążąc się do sekwencji operatorowej, hamuje wiązanie polimerazy RNA z promotorem i rozpoczęcie procesu transkrypcji). Geny znajdujące się pod kontrolą pozytywną nie ulegają ekspresji przy braku aktywnego białka regulatorowego. Białko to wiąże się ze swoistą sekwencją DNA i ułatwia przyłączenie się do niej polimerazy RNA (dokładny mechanizm nie jest poznany), która rozpoczyna proces transkrypcji. Ekspresja genów u drobnoustrojów_3 Operony dzielą się na indukowane oraz kontrolowane przez represjonowanie. W przypadku operonów indukowanych, wprowadzenie induktora (substratu) prowadzi do ekspresji genów odpowiedzialnych za jego metabolizm. Natomiast wysokie stężenie produktu końcowego szlaku metabolicznego prowadzi do zatrzymania ekspresji lub zmniejszenia jej wydajności przez inhibicję genów kodujących enzymy katalizujące powstawanie produktów. Operon laktozowy lac jest odpowiedzialny za degradację laktozy. Lac należy do operonów indukowanych znajdujących się pod kontrolą pozytywną oraz negatywną. Także ekspresja mechanizmów wirulencji jest koordynowana przez składniki regulacyjne operonu. Takie parametry jak temperatura, osmolarność, pH, dostępność składników odżywczych lub stężenie określonych cząstek, mogą prowadzić do włączenia lub wyłączenia transkrypcji pojedynczego genu lub ich grupy. Operon – zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów, położonych obok siebie w genomie. W skład pojedynczego operonu wchodzą: geny kodujące białka i enzymy (geny struktury lub też geny strukturalne), dwa odcinki DNA niekodujące białek: promotor i operator. Operon zawiera też terminator (odcinek genu, na którym kończy się transkrypcja operonu). W skład operonu może też wchodzić atenuator - sekwencja położona między promotorem a genami struktury. Po transkrypcji tej sekwencji powstaje fragment RNA, który może tworzyć strukturę przestrzenną działającą jako sygnał do terminacji transkrypcji. 4 Promotor to miejsce rozpoznawane przez polimerazę RNA, zaś operator jest miejscem, gdzie "przyczepia" się regulator (białko), które reguluje operon. Mechanizm regulacji polega na włączaniu lub wyłączaniu transkrypcji. Rodzaje operonów bakteryjnych: indukowane (kataboliczne) - produkcja enzymów jeśli substrat obecny w środowisku ulegające represji (anaboliczne) - produkcja enzymów jeśli substancja syntetyzowana nie istnieje w komórce podlegające regulacji pozytywnej – blokowanie transkrypcji przez represor związany z aktywatorem podlegające regulacji negatywnej – blokowanie transkrypcji przez wolny represor Przykładowe operony: operon laktozowy (regulacja szlaków katabolicznych), operon tryptofanowy (regulacja szlaków anabolicznych), operon arabinozy operon ramnozy operon maltozy. Replikacja DNA Replikacja bakteryjnego DNA rozpoczyna się w specyficznej sekwencji w chromosomie – miejscu OriC (Origin of replication); W procesie replikacji konieczne są enzymy, w tym: helikaza rozplatająca nić DNA, prymaza syntetyzująca startery, zależne od DNA polimerazy DNA; Nowa nić DNA syntetyzowana jest w sposób semikonserwatywny – jako matryce używane są obie nici macierzyste. Replikacja DNA_2 Synteza nici DNA ma miejsce w tzw. widełkach replikacyjnych i postępuje w dwóch kierunkach: Nić ‚wiodąca’ kopiowana jest w sposób ciągły w orientacji 5’-3’, podczas gdy nić ‚opóźniona’ syntetyzowana jest w sposób nieciągły z wytworzeniem tzw. fragmentów Okazaki. Fragmenty te są łączone z udziałem enzymu ligazy. Jeden cykl replikacji zajmuje ok. 40 min., następnie ma miejsce trwająca ok. 20 min. przerwa. 5  Aby zachować wierność w procesie replikacji, polimeraz DNA posiada funkcję korektorską. Wzrost bakteryjny W wyniku replikacji bakteryjnej powstają dwie komórki potomne, Replikacja chromosomu ma miejsce w pobliżu błony cytoplazmatycznej, każdy z chromosomów potomnych łączy się z inną jej częścią i wraz z rozrostem błony, chromosomy oddalają się od siebie; Rozrost błony pociąga za sobą podział komórki, którego widoczną cechą jest wytworzenie ściany poprzecznej. Bakterie wprowadzone do nowego środowiska potrzebują czasu, aby się do niego zaadaptować (faza spoczynkowa), w czasie fazy logarytmicznego wzrostu bakterie rosną i ulegają podziałom. Gdy hodowla ostatecznie zużyje wszystkie metabolity lub gdy w środowisku wzrośnie znacząco stężenie substancji toksycznych, bakterie przestają wzrastać i wchodzą w fazę stacjonarną. Mutacje mutacje spontaniczne pojawiają się ze stałą małą częstością, prawidłowo między 10-4 i 10-10 na jeden podział bakterii, zależnie od cechy, warunków środowiska, wieku hodowli i innych czynników, kolonia zawierająca ≥109 bakterii zawiera tysiące mutacji wielu genów, mutacje powodować mogą intensyfikację wzrostu w organizmie żywiciela - nabycie większej odporności na antybiotyki, - zwiększenie wirulencji, - zmianę antygenów powierzchniowych; w organizmie zakażonym bakterie z korzystnymi mutacjami namnażają się szybciej niż bez tych mutacji, dlatego też na skutek selekcji stają się komórkami dominującymi (wertykalna wymiana genów=wertykalny transfer genów), częstość mutacji można zwiększyć działając na komórki czynnikami mutagennymi, powodując mutacje indukowane; mutagenami mogą być czynniki chemiczne, fizyczne i biologiczne. Plazmidy Małe elementy genetyczne, których relokacja jest niezależna od chromosomu bakteryjnego; Większość plazmidów to kuliste, dwuniciowe cząsteczki DNA, o wielkości 1 500 – 400 000 pz; 6  Ale np. Borrelia burgdorferi (borelioza z Lyme) oraz Borrelia hermsii posiadają plazmidy liniowe; Zazwyczaj plazmidy nie niosą genów metabolizmu podstawowego, mogą jednak kodować produkty potrzebne w pewnych specyficznych warunkach, na przykład geny oporności na antybiotyki, warunkujące wytwarzanie bakteriocyn, toksyn, czynników wirulencji lub umożliwiające rozkład i asymilację różnych związków odżywczych; Plazmidy mogą być przekazywane pomiędzy komórkami bakteryjnymi w czasie podziału komórki lub poprzez horyzontalny transfer genów w procesie koniugacji, transdukcji i transformacji; Plazmidy bakteryjne znalazły zastosowanie w inżynierii genetycznej jako wektory. Obecnie używa się plazmidów rekombinowanych, zawierających elementy wielu plazmidów naturalnych jednocześnie. Treści tekstowe opracowano m.in. na podstawie Murray, Rosenthal i Pfaller, Medical Microbiology, 2018. Horyzontalny transfer genów 1. Transformacja bakteria pobiera fragmenty DNA ze środowiska i wbudowuje je do swojego genomu, kompetencja - naturalna zdolność bakterii do pobrania DNA z otoczenia np. u Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bacillus spp., Neisseria sp. ale u większości bakterii taka naturalna zdolność nie występuje – w celu np. wprowadzenia plazmidu do E. coli lub innych bakterii należy posłużyć się odczynnikami chemicznymi lub wysokimi napięciami pulsacyjnymi (technika elektroporacyjna). przekazywanie cech oporności na antybiotyki. Rekombinacja integracja DNA do chromosomu bakteryjnego ma miejsce w procesie zwanym rekombinacją; rekombinacja homologiczna – gdy dwie podobne sekwencje DNA wymieniają się swoimi miejscami na chromosomie; niezbędne są specyficzne enzymy, np. u E. coli są to enzymy kodowane przez geny rec; rekombinacja niehomologiczna – występuje między dwoma niespokrewnionymi ze sobą sekwencjami DNA i prowadzi do powstania insercji lub delecji, proces wymaga obecności enzymów rekombinacyjnych, takich jak te porodukowane przez transpozony lub bakterie lizogenne. 2. Koniugacja, Czynnik F i stan Hfr 7  często występujący proces transferu genów u większości bakterii, najczęściej pomiędzy bakteriami tego samego lub blisko spokrewnionego gatunku, ale również pomiędzy Prokaryota a komórkami roślinnymi, grzybów i zwierzęcymi. zdolność do pełnienia roli dawcy zależy od obecności ruchomej cząsteczki DNA, czynnika płciowego F (ang. fertility), czynnik F jest zamkniętą kolistą cząsteczką dwuniciowego DNA (plazmid), czynnik F zawiera geny odpowiedzialne za proces koniugacji, m.in. kodujące pilusy F (2 lub 3/komórkę, umożliwiające jednoczesny kontakt dawcy z kilkoma biorcami, tylko nieliczne bakterie mogą przekazywać chromosomowy DNA: cechę tę mają komórki, w których nastąpiła integracja czynnika F do chromosomu. Takie komórki nazywamy Hfr (z ang. high frequency of recombinants, o wysokiej częstości rekombinacji). Ruchome elementy genetyczne bakterii sekwencje insercyjne, IS (insertion sequences) należą do elementów genetycznych zdolnych do transpozycji, mogą włączać się w wiele miejsc genomu bakteryjnego bez spełnienia warunku homologii sekwencji, to krótkie (800-1400 pz) fragmenty DNA, zawierające gen transpozazy otoczony odwracalnymi sekwencjami powtarzalnymi; Komórki Escherichia mają zazwyczaj po kilka ich rodzajów w kilku kopiach. Przemieszczają się one z jednego miejsca chromosomu do innego replikatywnie (pozostawiają kopię w starym miejscu) lub konserwatywnie (kopia w starym miejscu zanika). Konsekwencją ich przemieszczania się są mutacje; wbudowując się (często) losowo mogą wpływać na funkcję genu. Wirusy bakteryjne Wirusy bakteryjne to bakteriofagi lub fagi. Mają własne geny umożliwiające replikację ich DNA (lub RNA) oraz produkcję powłok białkowych, ale mogą się rozmnażać tylko wewnątrz komórek, wykorzystując ich metabolizm. Fagi lityczne namnażają się intensywnie po wejściu do komórek i doprowadzają do jej rozpadu, czyli lizy komórki. Fagi lizogeniczne, np. fag lambda, mogą wbudować swój DNA do chromosomu bakterii i w tej ukrytej formie profaga dzielić się wraz z nim, zanim nastąpi produkcja fagów potomnych i rozpad komórki. 8  3. Transdukcja przeniesienie DNA z komórki dawcy do biorcy przez bakteriofaga, transdukcja niespecyficzna (ogólna), gdy każdy segment DNA gospodarza może zostać przeniesiony = gdy pobrane przez bakteriofaga geny są przypadkowe, i specyficzna, ograniczona do przekazania określonych segmentów DNA. 9