Medicinska Biologija B3 Skripta (2020) PDF

MEDICINSKA BIOLOGIJA SKRIPTA ZA 3. KOLOKVIJ 2. IZDANJE // 2020. JELENA BENČIĆ © Medicinski fakultet Zagreb molekularna genetika humani genom molekularna biologija tumora...

MEDICINSKA BIOLOGIJA SKRIPTA ZA 3. KOLOKVIJ 2. IZDANJE // 2020. JELENA BENČIĆ © Medicinski fakultet Zagreb molekularna genetika humani genom molekularna biologija tumora stanična i genetska osnova novih terapija SADRŽAJ REKOMBINATNA DNA TEHNOLOGIJA (P13., V13. – V16.) 4 RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE 4 VJEŽBA 15. 10 KLONIRANJE ŽELJENIH FRAGMENATA DNA in vitro 11 LJUDSKI GENOM 13 o MINISATELITI 13 o MIKROSATELITI 15 o (IN SITU) HIBRIDIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA 15 o BLOTTING 16 o SEKVENCIRANJE DNA 17 o CRISPR Cas9 18 BAKTERIJSKA GENETIKA (P14.) 21 TRANSFORMACIJA 21 TRANSDUKCIJA 21 KONJUGACIJA 23 OPERONI 24 REGULACIJA GENSKE EKSPRESIJE (P15., P16.) 26 METILACIJA 26 REGULACIJA TRANSKRIPCIJE 28 POSTTRANSKRIPCIJSKA KONTROLA 31 HISTONSKA MODIFIKACIJA 32 ATP – OVISAN KROMATINSKI REMODELING 33 NEKODIRAJUĆE RNA 33 GENOMSKI IMPRINTING 35 MUTACIJE (P16.) 36 PODJELA 36 POPRAVAK MUTACIJA 44 TUMORI (P17., V17.) 47 PODJELA 48 (PROTO)ONKOGENI 51 GENI SUPRESORI TUMORA 54 GENSKA TERAPIJA (P18., S7.) 59 KLONIRANJE (P19.) 64 REPRODUKTIVNO KLONIRANJE 64 o POVIJEST KLONIRANJA 64 TERAPIJSKO KLONIRANJE 66 POZICIJSKO KLONIRANJE 66 GENOMIKA I PROTEOMIKA (P20., S8.) 69 FIZIČKA I GENETIČKA MAPA 70 LJUDSKI GENOM 71 o TRANSPOZONI 71 HAPLOTIP 73 PROTEOMIKA 73 POLITENI KROMOSOMI 73 UZORAK ISPITA ZA B3 76 DODACI SKRIPTI 88 2 MEF ZG / 2020. JB © PREDGOVOR Bok svima! Prije 2 godine pisala sam skriptu iz biologije za B3 zajedno s još dvoje kolega koji su pisali B1 i B2. Tijekom ove karantene, a potaknuta znanjem koje sam skupila u dodatne dvije godine na Medicinskom fakultetu u Zagrebu, odlučila sam da je vrijeme za obnovu skripte s boljim objašnjenjima (jer sada i ja više toga shvaćam), više slika, boljim rasporedom i duplo većim brojem stranica. Ipak, neka te to ne preplaši jer količina informacija nije povećana, samo su dodane slike i laička objašnjenja (što sam više mogla jer ja volim kad mi se kao djetetu pojašnjava i naglašava stalno ono što sam već pročitala i povezuje s novim gradivom) te nije sve više onako nagurano kao u prvoj verziji jer sam shvatila da ljudi možda žele dopisati svoje bilješke, a nemaju gdje. Također i font je veći i margine su sužene isto iz praktičnih razloga. No, da ponovim, gradivo je i dalje svojim obujmom jednako. Ono što je također novo jest zbirka pitanja za samoprovjeru znanja koju sam nazvala Uzorak ispita iz B3, a koja je danas jako popularna na LMSu haha. Na kraju zbirke nalaze se i točni odgovori! Zbirka nije prepisana baza! Pitanja su dosad neviđena na našem faksu (osim ako ne koristiš američku literaturu, ali i dalje sam većinu prilagodila ili sama osmislila, a i koristila sam toliko velik broj izvora tih pitanja da mislim da je nemoguće da si ih sve negdje susreo). Ipak, sva pitanja u potpunosti odgovaraju gradivu i razini znanja koja je vama potrebna, samo nisu klasična, nego sam se potrudila da povezuju gradivo i da treba nekad uključiti i pokoji kliker da se nešto izračuna ili poveže, a što nije nužno naglašeno u skripti. Ipak, sa znanjem iz skripte, svaki se zadatak može riješiti, a ako negdje zapne, uvijek mi se možeš obratiti! Nadam se da će ti biti od koristi. Ako je riješiš, molila bih te da mi pošalješ feedback (na bilo koju društvenu mrežu) jer mi je ovo prvi pokušaj pisanja ovakve zbirke i voljela bih znati kako sam se snašla u tome, a i imam u planu pisati neke dodatne skripte pa da znam u kojem smjeru ići. Dakle, sve što ti se sviđa i ne sviđa – koliko ti je vremena trebalo, jesu li pitanja preteška ili prelagana, misliš da neko gradivo zahtijeva veći broj pitanja (jer nisam sve gradivo jednako iskoristila jer smatram da pitanja poput „Kada je otkrivena struktura DNA?“ ima dovoljno i u samoj bazi), je li ti u potpunosti beskorisno, na kojem si pitanju bio „ajme kad će kraj“, itd. Također, na kraju se nalazi i mali dodatak sa kraticama koje sam ispisivala dok sam učila za usmeni. Ostavila sam prostora kako bi je ti mogao nadopuniti nekim svojim koje sam ja možda previdjela. Također i njih mi možeš poslati kako bih mogla revidirati skriptu. (A i dobit ćeš credits ako išta znači ). Skripta je pisana po Cooperu (odakle je uzet i velik dio slika, 3. izdanje), po Kunsteljičinoj velikoj skripti i po prezentacijama na LMS-u. Skripta nije ničija kopija! Sve greške molim te mi javi (trudila sam se da ih je što manje, ali naravno da ne mogu sve pohvatati u ovih par čitanja dok sam pregledavala), kao i sve nejasnoće ili ako misliš da neki dio treba drugačije objasniti. Stojim ti na raspolaganju! Nadam se da će skripta biti od koristi svima koji još nisu riješili Biologiju kao i svim generacijama koje dolaze barem dok se literatura ne promijeni. Skriptu je dozvoljeno dijeliti među kolegama kako na MEF ZG tako i dalje, ali molim te da mi javiš ako šalješ nekome na drugom faksu, itd. čisto radi moje evidencije gdje se sve koristi i tko joj sve ima pristup. Mislim da bi to autor bilo koje skripte volio znati. Hvala! Sretno i javi se što god da trebaš (kako sam demos na fizici i histi (zasad), ako i s tim nekad bude bilo problema, znaš gdje me možeš pronaći)! Jelena Benčić, studentica III. godine MEF ZG U Dugom Selu, travanj 2020. 3 MEF ZG / 2020. JB ©  REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA Pod pojmom rekombinantne DNA tehnologije smatramo stvaranje umjetne DNA nastale kao rezultat “spajanja” dvije DNA iz različitih izvora. 2 su osnovne pretpostavke od kojih polazimo u rekombinaciju: 1. genetički je kod univerzalan 2. RNA polimeraza jednog organizma može prepisati gen bilo kojeg drugog organizma. 4 su osnovna koraka u rekombinaciji: 1. izolacija DNA molekule iz organizma 2. cijepanje izvađene DNA restrikcijskim enzimima = restrikcijskim endonukleazama* 3. spajanje DNA fragmenata iz različitih izvora 4. amplifikacija (= umnožavanje) rekombinantne DNA iako se amplifikacija može činiti kao možda ne tako koristan korak, iznimno je važna radi mogućnosti višestrukih eksperimenata na istoj rekombinantnoj DNA Restrikcijske su endonukleaze (= molekularne škare) enzimi koji potječu samo i isključivo iz prokariota (napose bakterija) u kojima vrše funkciju zaštite od infekcija (npr. virusom – slika I.). Bakterije imaju velik broj različitih restrikcijskih endonukleaza koje kidaju DNA na više stotina specifičnih mjesta prepoznavanja, a svako od tih mjesta sastoji se od specifičnog slijeda od 3 do 8 parova baza (primjeri su navedeni u tablici I.). Naziv molekularne škare dobile su jer režu DNA samo na specifičnim mjestima u obliku palindroma (= sekvenca koja se jednako čita i s lijeva na desno i obrnuto). Sekvence koje se režu nazivaju se restrikcijska mjesta, a cijepanjem tim enzimima na dobivenom fragmentu DNA molekule stvaraju se ljepljivi i tupi krajevi koje spaja DNA ligaza (slika 2.). Slika 1. Kada virus (tj. strana DNA) napadne Slika 2. Ljepljivi i tupi krajevi. Vrsta kraja koji bakterijsku stanicu, restrikcijske endonukelaze cijepaju će nastati ovisi o endonukleazi kojom djelujemo tu stranu DNA čime one prestaje biti viralna. Kako na DNA. (Što je ljepljivo? Vodikove veze u postoji mogućnost da i na bakterijskoj DNA (tzv. host slobodnom dijelu fragmenta!) Prisjeti se DNA) postoji isti restrikcijski fragment koji bi bio kako se povezuju nukleotidi u DNA: pocijepan, osigurana je metilacija DNA (vidi Regulacija ekspresije gena, zasada shvatiti kao svojevrsnu zaštitu DNA) kako bi se izbjeglo cijepanje host DNA, dakle možemo reći kako restrikcijske endonukleaze NE PREPOZNAJU METILIRANU DNA. 4 MEF ZG / 2020. JB ©  Tablica 1. 2 NAPOMENE koje je zgodno znati za ispit: 1. Nomenklatura izabranih restrikcijskih endonukleaza: EcoR I – izoliran iz E. coli Više o ovim ▪ E označava prvo slovo roda bakterijama učit ćeš ▪ co označava prva dva slova vrste na Mikrobima na 3. ▪ R označava soj bakterije godini, dotada samo ▪ I (jedan) označava redni broj izoliranog enzima po kronologiji nauči napamet BamH I – izoliran iz Bacillus amyloliquefaciens imena ovih triju za potrebe ovog Sau3A I – izoliran iz Staphylococcus aureus 3A kolegija. 2. Proučavanjem restrikcijskih mjesta može se odrediti tzv. restrikcijsku mapu = fizička karta u parovima baza na kojima su označena mjesta djelovanja pojedinih restrikcijskih endonukleaza (slika 3a., slika 3b.) Slika 3b. Restrikcijska mapa plazmida (vidi kasnije) pBR322, najpoznatnijeg Slika 3a. Restrikcijska mapa DNA bakteriofaga λ i plazmida. adenovirusa. Položaj mjesta kidanja DNA bakteriofaga λ i adenovirusa enzimima BamHI, EcoRI i HindIII. Imena ovih dvaju virusa nisu bitna, ne moraš ih učiti, navedeni su samo kao primjer. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Nakon što je DNA jednog organizma pocijepana endonukleazama., potrebno ju je prenijeti u drugu stanicu s drugačijom, vlastitom DNA. (Zašto je ovo bitno? Ovaj je korak nužan kako bismo amplificirali dobivenu rekombinatnu DNA (= fragment + vektor). Međutim, takva se rekombinatna DNA ne može replicirati sama od sebe u praznom prostoru. Da bi iskoristila svoje svojstvo „samostalno se replicira“ ipak joj treba neki organizam u kojem će se replicirati, na slici 5. taj je organizam bakterija E. coli). Da bismo to učinili, moramo koristiti vektore, 5 MEF ZG / 2020. JB © tj. fragment DNA ugrađuje se u vektor, a potom se takva rekombinatna DNA (= fragment + vektor) ubacuje u neki drugi organizam. VEKTOR = komadić DNA sa sljedećim osobinama: samostalno se replicira (pocijepani fragment najčešće nema svoj ORI = origin of replication stoga ga vektor mora posjedovati da bi se kombinacija vektor + fragment mogla replicirati i stvoriti mnogo istovjetnih kopija koje se mogu ugraditi u što više stanica) posjeduje 1 restrikcijsko mjesto (jer je važno da se na točno određeno mjesto ugradi fragment, a ne da postoji više mjesta na koji se fragment može ugraditi, onda ne možemo znati na koje se ugradio) i to je restrikcijsko mjesto istovjetno onome na fragment, tj. pocijepani su istom endonukleazom Vektore odabiremo prema veličini fragmenta koji amplificiramo, a razlikujemo eukariotske i prokariotske vektore: EUKARIOTSKI PROKARIOTSKI 1. YAC – od 250 do 400 kb plazmidi – do 10 kb = yeast artificial chromosome (umjetni kromosom kvasca) kozmidi – od 30 do 45 kb 2. virusi (v. genska terapija) = hibridi plazmida i faga a. adenovirusi* b. retrovirusi bakteriofag – od 70 do 100 kb c. adenoassociated virusi BAC – od 120 do 300 kb 3. liposomi!** *2. a. – ne ubacuju fragment u jezgru, stoga je potrebno = bacterial artificial chromosome ponavljati proces = opetovati proces Što su liposomi? Ova tema obrađena je na seminaru tijekom B1, ipak bit će ovdje kratko opisana kako bih osigurala da su svi studenti upoznati s tim terminom. Liposomi su šuplje strukture omeđene fosfolipidnim dvoslojem slično kao membrane naših stanica. Koriste se kako bi se osigurala dostava nekih tvari, poput lijekova, na točno ciljano mjesto u tijelu. Hidrofilne tvari prenose se u šupljini liposoma, a hidrofobne u njegovoj membrani. Različiti prikazi liposoma za lakše učenje i vizualizaciju. 6 MEF ZG / 2020. JB © Postavlja se pitanje kako sve možemo ubaciti dobivenu rekombinatnu DNA u neku drugu stanicu. Postoji nekoliko NAČINA UNOSA REKOMBINATNE DNA U DRUGI ORGAIZAM: 1. pucanje zlatnim zrncima (koji nose vektore i fragment) na membranu (npr. bakterije) 2. elektrošok (izlaganje bakterije djelovanju električne struje koja otvara kanalne proteine membrane) 3. kemijska transformacija (otopina CaCl2) - Ca2+ zamaskira negativan naboj DNA (koji ona posjeduje zbog fosfata) – neutralizirana je DNA, ali nedostaju pore na membrani za vektor što je osigurano heat-shockom - Cl- nemaju veću ulogu 4. heat shock (bakterija se ostavi na ledu nekoliko minuta pa se prebaci na 42°C te ponovno na led ne bi li njezina membrana postala permeabilnija za strana tijela) ✓ tehnike 3. i 4. korištene su na vježbama, V. 15. Ipak, postoje neke prepreke u ovom prijenosu. Naime, bakterije i vektori (pojam vektor bit će dalje korišten umjesto pojma rekombinantne DNA, a označava spoj fragment + vektor) – uzmimo za primjer da je vektor plazmid pBR322 koji nosi DNA fragment – nasađeni su na istu podlogu, no to ne znači da će sve bakterije unijeti plazmid niti da će ga one, koje ga unesu, ugraditi u svoju DNA (ako se ugradi u DNA, onda se vektor takoreći „zamaskirao“ i bakterija „ne zna“ da to nije njezin dio genoma, stoga, kada počne dioba bakterije, i vektor će se umnožiti, a to smo rekli da je 4. korak stvaranja rekombinantne DNA – amplifikacija). Kako onda znati koje su bakterije rekombinantne? Ključna je činjenica u ovom procesu da na plazmidu postoje geni rezistencije na antibiotike. Koja je ideja svega ovoga? Ideja je da će samo one bakterije, koje su ugradile plazmid, biti rezistentne na određene antibiotike. Pa tako pBR322 u sebi nosi gene rezistencije na tetraciklin i amplicilin (ovo su 2 antibiotika o kojima ćeš više učiti na Mikrobima i Farmi, ono što je sada nužno znati jest da oba gena moraju imati restrikcijska mjesta za restrikcijske enzime koje koristimo!). Što se događa? Na plazmid se djeluje enzimom koji cijepa gen za tetraciklin, „unutar“ gena za tetraciklin ubaci se željeni fragment, i zatim se vektor (plazmid + fragment) ubaci u bakteriju (procesom transformacije – vidi poglavlje Bakterijska genetika) – dakle one bakterije koje NE rastu na mediju s tetraciklinom ugradile su plazmid (jer je gen za tetraciklin pocijepan i unutar njega nalazi se željeni fragment, dakle plazmid nije rezistentan na tetraciklin). Bakterije se potom nasade na ampicilin i samo one koje su rezistentne na antibiotik rastu na toj podlozi (dokazali smo da je bakterija ugradila plazmid, ali ne i da je to plazmid koji sadrži željeni fragment; taj dio provjerili smo s tetraciklinom – kao što vidiš, ovaj korak (s amplicilinom) nije nužan, ali jest nužan ako se fragment ne ugrađuje unutar gena za tetraciklina, već na neko drugo, nepoznato mjesto kao što je primjer na slici 6.). Sada se traže one bakterije koje su osjetljive na tetraciklin jer to znači da su ugradile željeni plazmid sa željenim fragmentom (da odmah razriješim dilemu, tetraciklin ne mora nužno „ubiti bakteriju“, može ju samo „uspavati“, ovisno o dozi koju upotrijebimo – više o ovome, ponovno, na Mikrobima; ako bi ih antibiotik samo ubijao, onda cijeli ovaj postupak ne bi imao smisla jer bi onda bakterija bila mrtva, a mi trebamo da bude živa kako bi se mogla replicirati i tako replicirati i našu rekombinantu DNA). Na ovaj se način mogu proizvoditi ljudski proteini – ugradnjom gena za inzulin u DNA bakterije ona će moći kodirati za taj protein. Ipak, postoji uvjet da ti proteini moraju biti oni koji ne prolaze posttranslacijsku modifikaciju u ER – u jer bakterije ne posjeduju organele i time ne bi mogle učiniti protein potpuno odgovarajućim i funkcionalnim za naš organizam. 7 MEF ZG / 2020. JB ©  Slika 4. Povezivanje molekula DNA. Vektor i fragment DNA koji treba ugraditi razgrađuju se istom restrikcijskom endonukleazom (npr. EcoRI) koja kida DNA ostavljajući produžene jednolančane ljepljive krajeve. DNA vektora i fragmenta koji se ugrađuje prvo se povezuju komplementarnim sparivanjem baza, a zatim djelovanjem DNA – ligaze nastaju kovalentne veze koje stabiliziraju rekombinatnu molekulu. Slika 5. Proizvodnja rekombinatnih molekula DNA. Fragment humane DNA ugrađen je u DNA λ vektora. Takva rekombinantna molekula zatim se unosi u E. coli gdje se umnožava i stvara rekombinatno potomstvo. 8 MEF ZG / 2020. JB ©  Slika 6. NAPOMENA: U ovom procesu preskočen je korak s tetraciklinom jer se fragment ne ugrađuje unutar gena za taj antibiotik, već na neko drugo mjesto u plazmidu. 9 MEF ZG / 2020. JB © VJEŽBA 15. – TRANSFORMACIJA BAKTERIJA (VAŽNO!) često pitanje na usmenom ispitu kod nekih nastavnika ŠTO KORISTIMO? - plazmid: pGLO - bakterija: E. coli HB101 - gen koji ugrađujemo: GFP (green flourescent protein, izoliran iz meduze Aequorea victoria) Kako bismo transformirali bakterije, potreban nam je medij u Petrijevoj zdjelici na kojem će bakterije rasti, a ovdje je to LB agar. LB sadrži triptofan, sol i kvaščev ekstrakt, no tekuć je, stoga, kada se doda agar, dobiva se čvrst medij (jer bakterije nisu kancerogene, ne mogu rasti na tekućem, već samo na čvrstome mediju – vidi poglavlje Tumori). Koji je postupak? 1. korak – nasađivanje bakterija na LB agar: rastu sve bakterije i neke iz zraka 2. korak – nasađivanje na LB agar + ampicilin*: rastu samo transformirane (jer plazmid aka vektor sadrži naš fragment (gen za GFP) i gen rezistencije za ampicilin ) i neke iz zraka ako su u međuvremenu, ne našom odlukom, postale rezistentne 3. korak – nasađivanje na LB agar + ampicilin + arabinoza: rastu samo transformirane (i tek sada svijetle zeleno jer dosada Ara operon** nije bio aktiviran) i neke iz zraka ako su rezistentne i posjeduju Ara operon (ali NE svijetle zeleno jer u njihovu DNA sigurno nije ugrađen plazmid) *ampicilin je također jedan antibiotik, više na Mikrobima **što je operon i više o njima vidi kasnije Slika 7. Nakon što su uzgojene na LB agaru i transformirane (dio, naravno, bakterija nije transformiran i postaje kontrolna skupina: -pGLO/LB/amp), bakterije se nasađuju na LB/amp te LB/amp/ara medije. Rezultati pokusa vidljivi su na slici 8. Kontrolna skupina vrlo je važna kako bismo znali jesmo li pogriješili (npr. kad bi -pGLO bakterije svijetlile, znali bismo da nešto nije u redu jer u njih nismo željeli ugraditi plazmid). 10 MEF ZG / 2020. JB ©  KLONIRANJE ŽELJENIH FRAGMENATA DNA in vitro Ponekad, iz različitih razloga (v. Primjena) želimo posjedovati više kopija jedne DNA, stoga koristimo PCR = polymerase chain reaction. Ključna je činjenica u tom procesu da se DNA na višoj temperaturi ne uništava, već se lanci odvajaju, a zatim se sniženjem temperature ponovno spontano spajaju. DNA koju želimo amplificirati (= umnožiti) Slika 8. Rezultati transformacije E. coli HB101 GFP- stavlja se u otopinu koja sadrži: om plazmidom pGLO. DNA primeri (da se može započeti sinteza novog lanca jer to i želimo – nove lance) dušične baze (koje će stvarati, odnosno činiti te nove lance – kao što se dušične baze dodaju pri replikaciji DNA u S fazi ciklusa, ovdje je ista analogija) DNA polimeraza (nazvana Taq polimeraza) o izolirana je iz bakterije Thermus aquaticus koja živi na termalnim izvorima do 90°C, no optimalna joj je temperatura 42°C (temperatura ključna u rekombinantnoj tehnologiji) PROCES (slika 9., slika 10.) 1. razdvajanje DNA molekula na visokoj temperaturi 2. snižavanje temperature i vezanje primera na jednolančanu DNA 3. sinteza drugoga lanca odsječka DNA između dva primera 4. povišenje temperature i rastaljivanje novosintetizirane DNA da bi se amplificirala Dobiveni se klonirani, amplificirani geni čuvaju u DNA bibliotekama u genomskim bibliotekama: takvi se fragmenti mogu u bilo kojem trenu ubaciti u vektor – npr. za proizvodnju inzulina. Ipak, ponovno postoji prepreka. Kako bakterije nemaju introne, tako ih ni ne prepoznaju, stoga u bakteriju treba unijeti kodirajuću sekvencu bez introna. Takva se sekvenca dobiva koristeći reverznu transkriptazu (DNA polimeraza koja sintetizira DNA prema kalupu mRNA (a ta je mRNA dobivena tako da je željeni gen iz DNA biblioteke potaknut na transkripciju). Dobivena dvolančana molekula DNA, komplementarna mRNA, ali bez introna (dakle identičan je kao i izvorni gen, ali bez introna kako bi se ugradio u bakteriju) naziva se cDNA (copy DNA). GDJE SVE MOŽEMO PRIMIJENITI PCR? kloniranje gena koji kodiraju za već poznati protein amplificiranje gena – pri proučavanju evolucije gena Meme. Konačan rezultat amplificiranje klonirane DNA iz vektora rada s PCR – om. 11 MEF ZG / 2020. JB ©  detekcija bakterijske ili virusne infekcije – kod AIDS – a i tuberkuloze (prvenstveno se ovo koristi kod virusnih infekcija jer je u serumu preniska razina virusne DNA (ili RNA) kako bi se ona dijagnosticirala i kako bi se dokazalo koji je virus uzrokovao infekciju, tada se DNA (ili RNA, ovisno koja je vrsta virusa) amplificira, a zatim se, kada postoji u većoj količini, vrlo jednostavno i detektira i dijagnosticira – više na Mikrobima) forenzika, dokazivanje očinstva – vidi Minisateliti Slika 9. Amplifikacija DNA PCR – om. Ako je n broj ponavljanja, tada je broj dobivenih lanaca 2n. Slika 9. Slika 10. Amplifikacija DNA PCR – om. Ako je n broj ponavljanja, tada je broj dobivenih lanaca 2n. 12 MEF ZG / 2020. JB © LJUDSKI GENOM GENI NEKODIRAJUĆE SEKVENCE DNA - sekvence koje kodiraju za proteine (1,5% genoma) - regulatorne sekvence - sekvence koje ne kodiraju za promotori, pojačivači (enhancer) proteine (2% genoma), već za: & utišivači (silenceri) tRNA - junk DNA rRNA introni siRNA repetitivna DNA 99,9% kodirajuće DNA identično u različitih ljudi velika varijabilnost među ljudima Svi navedeni dijelovi spadaju u tzv. jedinstvene sekvence, dok se repetitivna DNA dalje može podijeliti u: visoko ponovljene sekvence – satelitna DNA (centromere, telomere) srednje ponovljene sekvence o uzastopna ponavljanja (vidi dalje) ▪ mini – sateliti → VNTR ▪ mikro – sateliti → STR o umetnute, raspršene sekvence = RETROTRANSPOZONI (v. Genomika, proteomika) ▪ SINE (najčešće je ponavljanje tzv. sekvence Alu) ▪ LINE MINISATELITI Minisateliti ponavljajuće su sekvence veličine od 1 kb do 20kb, a čitava regija naziva se VNTR (engl. variable number of tandem repeats). Broj ponavljanja razlikuje se od jednog do drugog VNTR – a, no te varijablinosti ne utječu na fenotip (tj. ne postoji fiziološki raspon ponavljanja pa da možemo reći da je neki broj ponavljanja iznad tog raspona nekakva patologija). Mogu nam poslužiti u identifikaciji (tj. u DNA fingerprintingu*) jer su karakteristični za pojedinca. Ako DNA pojedinca pocijepamo endonukleazama, dobit ćemo fragmente različitih duljina, stoga su ti fragmenti nazvani RFLP (eng. restriction fragment length polymorphism) – slika 11. Kako se nasljeđuju po Mendelu (slika 12.), mogu poslužiti i kod dokazivanja očinstva. Minisateliti se ne moraju naslijediti, mogu i nastati sporadično, tj. zbog pojave polimorfizma kao što je SNP (eng. single nucleotide polymorphism, varijabilnost koja nastaje zbog zamjene jednoga nukleotida) – i to se događa kada je sekvenca takva da, zamjenom samo jednoga nukelotida, ona postaje minisatelit. o ako je takva zamjena nastala u intronu, bezopasno je o ako je nastala u kodirajućem dijelu, može doći do mutacija (NE NUŽNO! Mutacija može biti samesense – vidi Mutacije.) 13 MEF ZG / 2020. JB © Može se također dogoditi da je sekvenca takva da nakon SNP gubi svoje restrikcijsko mjesto što ima svoju upotrebu u dijagnostici (npr. srpasta anemija – slika 13.) Minisateliti mogu poslužiti i kao markeri specifičnih gena. Ako je gen vezan za polimofrni marker, tj. RFLP (i oni su dovoljno blizu da se može gotovo isključiti utjecaj crossing overa, odnosno da su slučajno završili jedno blizu drugoga), može se pratiti prijenosa gena za neke bolesti – slika 14. *DNA fingerprinting uključuje restrikciju, elektroforezu, prebacivanje fragmenta na membranu (v. postupak u Southern blot) te identifikaciju uz pomoć konstruiranih komplementarnih proba (v. Hibridizacija) Slika 11. Enzim Eco RI cijepa u svojoj prepoznavajućoj sekvenci – ako ima više Slika 12. Kako se VNTR fragmenti nasljeđuju Mendelovski, vidljivo ponovljenih sekvenci između dva restrikcijska je da je DAD1 otac samo djetetu TWIN 1, a DAD2 otac je djetetu mjesta, fragment će biti dulji – razlika između TWIN 2, tj. djeca nisu blizanci kako slika pretpostavlja. Nadalje, osobe A i B, M je za određivanje duljine svaka osoba ima 2 banda. Jedan band (= pruga) svako dijete fragmenta – vidi kasnije. naslijedilo je od svoga oca, a drugi od majke. Slika 13. Zamjenom CTT u CAT gubi se restrikcijsko mjesto te dolazi do manjega broja fragmenata od kojih je barem jedan duljine kao dva kraća (iz kojih je nastao). Slika 14. A1 lokus vezan je za pojavu bolesti (iako nije gen koji uzrokuje bolest!), dakle on je marker gena. D je lokus gena koji uzrokuje bolest (eksperimentalno utvrđeno). 14 MEF ZG / 2020. JB © MIKROSATELITI Mikrosateliti su sekvence dužine od 1 do 6 pb (dakle, nekoliko tisuća puta kraći od minisatelita), stoga su regije koje sadrže nekoliko mikrosatelita nazvane STR (eng. short tandem repeats). Nasljeđuju se kodominantno, dakle kod homozigota su oba alela iste duljine, a kod heterozigota različite te se mogu elektroforetski odvojiti i tada razlikovati jedan od drugoga, dok bi kod homozigota elektroforeza pokazala 1 crtu (jer oba fragmenta dospiju na istu udaljenost, eventualno bi ta linija bila deblja jer sadrži 2 fragmenta jedan na drugome). U forenzici se koristi 13 različitih STR lokusa jer nije moguće da dvije osobe imaju toliki broj istih lokusa. (IN SITU) HIBRIDIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA = formiranje dvostruke uzvojnice zbog komplementarnosti parova baza dviju jednolančanih molekula nukleinskih kiselina. Kod rekombinatne DNA spomenuto je kako postoji mogućnosti njihova pretraživanja, ipak nije navedeno koji je mehanizam koji se pritom koristi. Odgovor je hibridizacija nukleinskih kiselina. Također se koristi i kod DNA fingerprintinga, preimplantacijske i prenatalne dijagnostike, … Koji je naš cilj ove metode, što njome želimo postići? Želimo, u recimo DNA biblioteci, pronaći sekvencu koja kodira za nešto čemu već znamo slijed baza, ali ne i lokus (važno je da je DNA koju pretražujemo JEDNOLANČANA!, a tu jednolančanost možemo dobiti, kao i u PCR – u, upotrebom visoke temperature ili u alkalnim otopinama, npr. NaOH). Koja je naša ideja? Ideja je konstruirati hibridizacijsku sondu (proba) = jednolančana molekula nukleinske kiseline točno poznatoga redoslijeda parova baza označena nekim biljegom Slika 15. kako bi hibridizacija bila vizualizirana (najčešće je proba mRNA, cDNA ili neki sintetski oligonukleotid). Najčešće je taj marker 32P, dakle flourescentan je pri detekciji, stoga se metoda naziva FISH (eng. flourescent in situ hybridisation*). Tako označenu probu inkubiramo (= kupamo u istoj otopini) s jednolančanom DNA iz biblioteke (odnosno s više DNA, a preko probe pronaći ćemo onu koja nam treba jer će spoj probe i željene DNA flourescirati). Kako su proba i jednolančana DNA komplementarne, vezat će se i ondje gdje nastane dvostruki lanac svijetlit će flourescentno zbog radioaktivnoga markera. Razlikujemo hibridizaciju visoke točnosti (postiže se formiranje potpuno komplementarne dvostruke uzvojnice, na 42°C) i onu smanjene točnosti (stvaraju se 15 MEF ZG / 2020. JB ©  uzvojnice koje nisu posve komplementarne, a tom se metodom mogu otkriti srodni geni, primjerice u evoluciji, a događa se na nižim temperaturama). *in situ hibridizacija jest ona hibridizacija koja se događa direktno u jezgri/citoplazmi stanice (prednost je da nije potrebno izolirati DNA) gdje se mogu locirati sekvence karakteristične za kromosom, pojedine gene ili mRNA u citoplazmi. *FISH se metoda koristi i u preimplantacijskoj dijagnostici kod otkrivanja spola i bolesti. Može se vršiti do stadija blastociste u tri stadija: polarno tijelo – otkrivaju se samo mejotičke anomalije, tehnički je zahtjevno blastomere – otkrivaju se: mejotičke i mitotičke anomalije, mozaiciam (pitanje: reprezentira li jedna blastomera embrij?) trofoblast – analiza neembrionskih stanica, otkriva se poliploidija Završetkom metode zametak se može vratiti u uterus i normalno razvijati (jer preimplantacijski zametak posjeduje sposobnost da bez ikakvih posljedica nadoknadi gubitak nekoliko izgubljenih stanica ili da posve propadne – pravilo sve ili ništa). Postimplantacijski zametak u slučaju gubitak stanica mogao bi preživjeti, ali bi se taj gubitak očitovao u vidu oštećenja organa (kongenitalne ili prirođene malformacije). → za prenatalnu dijagnostiku vidjeti skriptu B2. BLOTTING Općenito se blotting metode koriste u svrhu dokazivanja postojanja neke od željenih molekula u npr. izoliranoj krvi ili tkivu (za tehniku v. Slika 16.). Tri su vrste blottinga: Southern – za DNA Northern – za RNA Western – za proteine MNEMOTEHNIKA: temeljna dogma molekularne biologije: DNA → RNA → protein S N O W Slika 16. DNA fragmenti (dvolančani) elektroforetski se razdvoje. Zatim se na običnome filter papiru umočenom u alkalnu otopinu odvajaju lanci DNA uzvojnice. Na filter se postavlja gel, a na gel nitrocelulozni filter. Na vrh dolazi puno slojeva suhog papira i pritisne se utegom. Kapilarnom elevacijom preko filtera kroz gel u papir putuje jednolančana DNA na nitrocelulozni filter koji se inkubira s radioaktivnom sondom i autoradiografijom traži se prisutnost neke od molekula (DNA/RNA). Za pretraživanje proteina umjesto sondi koriste se antitijela za određene proteine. 16 MEF ZG / 2020. JB ©  Slika 17. Slika 17. SEKVENCIRANJE DNA = određivanje redoslijeda nukleotida, tj. primarne strukture DNA molekule (za nekoliko povijesnih činjenica v. Genomika, proteomika). Isto tako, ovo je i način otkrivanja točkastih mutacija koje se ne mogu otkriti PCR metodom, a 2 su metode koje se koriste: 1. SANGEROVA DIDEOKSI METODA – brojnim kopijama iste jednolančane DNA dodaju se: radioaktivni primeri i DNA polimeraza (za sintezu novog lanca) 4 različita deoksiribonukleozidtrifosfata (dTTP, dATP, dCTP, dGTP – obični nukleotidi) Svi ovi sastojci idu u sve četiri epruvete… Zatim, u svaku epruvetu se dodaje samo jedna vrsta dideoksiribonukleozidtrifosfata (ddTTP, ddATP, ddCTP, ddGTP – nukleotidi kojima manjka slobodna OH- skupina na 3' – kada se oni vežu, nije moguća daljnja sinteza lanca) → za dodatno objašnjenje vidjeti: https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ i sliku 19. 17 MEF ZG / 2020. JB ©  NAPOMENA: u svakoj od Erlenmayerovih tikvica nastaju fragmenti različitih duljina (u onome s ddATP svaki završava nukleotidom s bazom A, u onome s ddCTP s bazom C, …), no i broj tih fragmenata je drugačiji, npr. ako sekvenciramo fragment: TGAACAGTA (komplementarno: ACTTGTCAT) u tikvici s ddTTP, nastat će određen broj fragmenata ACT, određen broj ACTT, zatim ACTTGT i ACTTGTCAT – broj ovih fragmenata nije važan jer će na elektroforezi svi fragmenti iste duljine doputovati do istoga mjesta, a broj fragmenata utječe samo na debljinu tog banda na tome mjestu (dakle, ako nekog fragmenta ima više ili manje, to je nevažno jer će svi ACT doputovati do iste točke, svi ACTT do iste, nama je samo važno da je barem jedan fragment od svake vrste (ACT, ACTT, …)). 2. MAXAM – GILBERTOVA METODA – koristi jednolančanu DNA označenu s 32P na 5' kraju. Ponovno se koriste 4 različite epruvete u koje se ubacuju 4 različite kemikalije pa se svaka od njih razgrađuje DNA na određenom mjestu (G, G + A, T + C, C). CRISPR Cas 9 Sustav u bakterijama čija je temeljna uloga „imunost bakterija“, a kasnije je iskorištena u editiranju genoma. Naime, strana DNA iz virusa ili plazmida izreže se u u bakteriji na male fragmente koji se ugrađuju u CRISPR lokus usred niza kratkih ponavljanja (oko 20 parova baza/pb). Na taj način bakterija „pamti“ kojim je virusima bila izložena i koji su je virusi prije napali. Ti fragmenti unutar CRISPR lokusa prepišu se/transkribiraju, a transkripti se obrađuju kako bi se generirale male RNA (crRNA – CRISPR RNA) koje se koriste za usmjeravanje endonukleaza (enzim Cas9) koje na temelju komplementarnosti sekvence ciljaju stranu DNA. Ukoliko Cas9 naoružan s RNA iz CRISPR – a prepozna da se radi o virusnoj DNA, pocijepat će je i obraniti bakteriju od napada virusa (analogija s primarnom i sekundarnim imunosnim odgovorom u našemu organizmu). Lokus – specifično prepoznavanje i cijepanje strane DNA Cas9 izvodi u kompleksu s crRNA i tzv. trans-aktivirajućom crRNA (tracrRNA, tj. trRNA). Slika 18. NAPOMENA: SDS – poliakrilamidni gel jedan je od najčešćih gelova koji se koriste u ovakvim postupcima. Detalji o njegovom sastavu nisu bitni. 18 MEF ZG / 2020. JB © Za svoju aktivnost Cas9 također zahtijeva i postojanje tzv. PAM domene = kratke, 2 – 5 nukleotida duge, konzervirane (= sekvencijski očuvane kroz evoluciju u organizmima) sekvence smještene nesporedno nakon 3' kraja sekvence DNA koju treba izrezati enzimom Cas9 – slika 20. Primjena je u editiranju genoma (metoda pojednostavljeno objašnjena na slici 21. i slici 22., više na dolje navedenim linkovima), a ciljana sekvenca (koju želimo izmijeniti jer je, npr. mutirana i želimo izliječiti pacijenta) mora: o biti unikatna s obzirom na ostatak genoma o biti pristuna neposredno uz PAM domenu (PAM domena ne nalazi se na gRNA* i navodi Cas9 enzima ka željenoj sekvenci) Slika 19. DODATNI LINKOVI ZA CRISPR Cas9: https://www.abmgood.com/mar keting/knowledge_base/CRISPR _Cas9_gRNA_Design.php https://www.youtube.com/watc h?v=5gQGWJraptU 19 MEF ZG / 2020. JB ©  Slika 20. Građa CRISPR Cas9 kompleksa. NAPOMENA: *gRNA = tracrRNA + crRNA (gRNA sintetska je RNA napravljena za potrebe editiranja gena). Slika 21. Editiranje gena CRISPR Cas9 sustavom. Slika 22. Uređivanje gena (eng. gene editing) koristeći CRISPR Cas9. A – ciljna sekvenca B – DNA C – vodeća RNA (gRNA) D – Cas9 E – nova DNA sekvenca 1. gRNA veže se s ciljnom DNA sekvencom (na temelju komplementarnosti!) 2. Cas9 enzim povezuje se s vodećom RNA 3. Cas9 enzima kida oba lanca DNA 4. nova DNA sekvenca na mjestu prekida lanca 20 MEF ZG / 2020. JB ©  BAKTERIJSKA GENETIKA U prirodi bakterije mogu prenijeti svoju DNA u drugi VAŽNE NAPOMENE za BAKTERIJE: organizam na 3 načina: haploidne ne postoje mitoza i mejoza, već 1. transformacija samo jednostavna dioba 2. transdukcija jedan gen = jedan protein! 3. konjugacija (nema introna) TRANSFORMACIJA = uzimanje DNA iz okolnoga medija u kojem se bakterija nalazi Na staničnoj membrani bakterije nalazi se receptor za prihvaćanje i prodiranje DNA pri čemu se jedan lanac razgrađuje, a drugi ulazi u stanicu – receptor se naziva kompetencijski faktor. Transformaciju je dokazao Griffith u pokusu s bakterijom Streptococcus pneumoniae. zaštitna polisahari- dna kapsula Slika 23. Griffithov pokus sa Streptococcus pneumoniae. Ako se u miša ubaci: a) živa kolonija s kapsulom, miš umire b) živa kolonija bez kapsule, miš preživi c) ubijena kolonija s kapsulom, miš preživi d) živa kolonija bez zaštitne kapsule + ubijena kolonija s kapsulom, miš umire (došlo je do transformacije u zaštitnu kapsulu) TRANSDUKCIJA = prijenos bakterijskih gena uz pomoć (bakterio)faga (= virus koji inficira bakterije) Bakteriofage dijelimo na virulentne (ulaze samo u litički ciklus) i umjerene (ulaze i u lizogeni i u litički ciklus). Hershey i Chase dokazali su da samo DNA bakteriofaga ulazi u bakteriju, ali njegov proteinski omotač ostaje vani. LITIČKI CIKLUS 21 MEF ZG / 2020. JB ©  Virulentni fagi pričvršćuju se na mjesto na bakteriji i enzimom lizozimom razaraju stijenku bakterije te ubacuju svoj genetički materijal preuzimajući metabolizam bakterije, ali ne ugrađuju svoju nukleinsku kiselinu u bakterijsku DNA. Virus se potom replicira u više kopija i stanica puca (liza stanice → litički ciklus) te dolazi do oslobađanja stotine novih virusnih čestica. LIZOGENI CIKLUS Umjereni fagi (koji ugrađuju svoju Slika 24. DNA u kromosome domaćina – tada se ta virusna DNA zove profag) i dolazi do prijenosa infomacija na stanice kćeri bakterije i te stanice kćeri NAPOMENA: postaju otporne na infekcije. U Pneumococcus = Streptococcus pneumoniae nepovoljnim uvjetime virusna DNA može izaći iz bakterijskog kromosoma i Detalji oko toga što je S, a što R soj nisu bitni, bitno je samo shvatiti mehanizam transformacije. ući u litički ciklus. Dakle, samo bakterije inficirane umjerenim fagom u lizogenom ciklusu i njihove stanice kćeri sadrže novu DNA i samo je takva bakterija rekombinatno promijenjena (jer je nužna ugradnja nove DNA u bakterijsku DNA). POSTOJE DVA TIPA TRANSDUKCIJE: 1. OPĆA U općoj transdukciji sudjeluju i virulentni i umjereni fagi jer nije potrebna integracija genoma virusa u kromosom domaćina (temelji se na litičkome ciklusu virusa). LITIČKI dio podrazumijeva kad fag inficira bakteriju svojom DNA, a bakterijski enzimi pomažu u proizvodnji proteina tog faga, a NOVI dio (odnosno kako sada iskoristiti tu infekciju na prijenos na nove generacije kako bismo mogli reći da su te bakterije rekombinatne? ) podrazumijeva sljedeći događaj. Ako se jedna glava bakteriofaga (tijekom njegove replikacije) formira oko bakterijskog fragmenta DNA umjesto oko fragmenta nukleinske kiseline faga te ako takav novonastali fag (s bakterijskom DNA) inficira novu bakteriju, zapravo tu novu bakteriju transformira jer joj donosi DNA neke druge bakterije. 2. SPECIFIČNA U specifičnoj transdukciji sudjeluju samo umjereni fagi jer se ugrađuju u kromosom domaćina (temelji se na litičkom i lizogenom ciklusu virusa). LIZOGENI dio podrazumijeva da je stvoren profag. 22 MEF ZG / 2020. JB ©  LITIČKI dio podrazumijeva da je DNA bakterije raspadnuta u fragmente, ali se može dogoditi da nastane takav fragment koji sadrži dio bakterijske i dio virusne DNA. NOVI dio identičan je kao u I. Slika 25. Litički i lizogeni ciklus virusa. Primjer λ (lambda) fag E. coli uvijek se ugrađuje između lokusa gal i bio unutar DNA bakterije (u lizogenom ciklusu) te će prilikom transdukcije uvijek ponijeti jedan od ta dva gena u novu bakteriju. KONJUGACIJA = fizički kontakt bakterija i izmjena DNA uz formiranje konjugacijskoga mostića (tzv. F pilus mostić) Kod G- (gram negativne) bakterija pilus proizvode bakterije donori i ti se pilusi potom vežu na bakteriju primaoca, a skraćivanjem pilusa dolazi do kontakta. Kod G+ (gram pozitivnih) bakterija površina je obložena ljepljivim molekulama pa se lako stupa u direktan kontakt. Konjugacija zahtijeva prisustvo F plazmida (tzv. fertility factor) koji potiče stvaranje konjugacijskog mostića i potom prenosi 25 gena na druge bakterije. Bakterija s F plazmidom naziva se F+ (muška), a ona bez njega F- (ženska) – analogno kao i u ljudi: muška bakterija oplodit će žensku, odnosno stvorit će konjugacijski mostić i dat će joj plazmid). Iako je nužno prisustvo F plazmida koji započinje konjugaciju, u drugu se bakteriju uz F plazmid mogu prebaciti i drugi plazmidi poput dolje navedenih, ali oni ne mogu započeti konjugaciju (osim R plazmida!). Neki plazmidi su i: R plazmidi – ovi plazmidi sadrže gene rezistencije na antibiotike i otrove, također mogu stvarati piluse (dakle, jedini koji ipak može također samostalno vršiti konjugaciju) o Konjugacija R – plazmidom podrazumijeva identičan postupak kao kod F plazmida pri čemu se jedan lanac R plazmida odvaja od donora (dakle, ne prelazi cijeli plazmid) i prelazi u primaoca gdje se potom stvara komplementarna DNA. col – plazmidi – ovi plazmidi sadrže gene za kolicine, a kolicini su prirodni antibiotici koji ubijaju druge bakterije (korisno kada bakterija želi proširiti svoj teritorij) plazmidi virulencije – ovi plazmidi pretvaraju nepatogenu bakteriju u patogenu 23 MEF ZG / 2020. JB ©  F plazmid može se ugraditi u bakterijski genome što se naziva Hfr konjugacijomm, a soj se naziva Hfr soj bakterije (eng. high frequency recombination). Ako je plazmid bio ugrađen u genom bakterije, može se dogoditi da prilikom izrezivanja (izrezuje se iz genoma bakterije netom prije nego što će započeti konjugaciju) ponese i dio bakterijskoga genoma = abnormalno izrezan F plazmid = tzv. F' plazmid OPERONI KAO VAŽAN MEHANIZAM METABOLIZMA BAKTERIJA = dio DNA koji sadrži regulatorne sekvence, strukturne gene i promotor Ara – operon 5' 3' araC araO araI CAP - bs Po araB araA araD uvijek operator inicijator promotor strukturni geni aktivan transkripcija AraC proteina u smjeru 3' → 5' araI a) kada arabinoze nema (= negativna regulacija) AraC prot - AraC protein koji sada djeluje kao represor veže se na araI i araO araO stvarajući petlju (eng. loop) što onemogućava vezanje RNA polimeraze te ne dolazi do transkripcije b) kada je u prisustvu arabinoze (= pozitivna regulacija) - arabinoza se veže na AraC protein te se naziva aktivatorski kompleks (AraC protein vezanjem arabinoze promijenio je konformaciju pa se ne može vezati na promotor araI i araO i time onemogućiti vezanje RNA polimeraze) - istodobno se kompleks cAMP i CAP kompleks veže na CAP – binding site (neke literature ne navode CAP – binding site (= CAP – bs), već da se ovaj kompleks veže na araI) - vezanjem je došlo do zakrivljenja DNA i povećanja afinitieta za RNA polimerazu - RNA polimeraza sjeda na promotor i dolazi do transkripcije u 5' → 3' smjeru s gena araB, araA i araD (dat će proteine koji će metabolizirati arabinozu) – transkribira se policistronska mRNA (svi geni prepisani su na jednu mRNA, naša je pak mRNA monocistronska – jedan gen prepisuje se na jednu mRNA) - represor/aktivator AraC i cAMP – CAP kompleks jednake su jakosti, dominantnosti - link na mehanizam: https://www.youtube.com/watch?v=l0Vtb350vWA Operoni su mehanizam regulacije ekspresije gena u prokariota, regulacijom ekspresije gena u eukariota obrađuje sljedeće poglavlje. Također, jako dobru sistematizaciju ove regulacije možeš pronaći na dolje navedenom linku (i u prokariota i u eukariota): https://www.youtube.com/watch?v=J9jhg90A7Lw 24 MEF ZG / 2020. JB © Lac – operon 5' 3' lacI CAP - bs Po lacO lacZ lacY lacA promotor operator strukturni geni transkripcija represor/aktivator proteina u 3' → 5' Mehanizam isti, razlika je samo što ovisno o regulaciji postoji razlika: dominantnosti između cAMP – CAP kompleksa te represorskog/aktivatorskog proteina vezanju represor/aktivator proteina na Po, a ne na neke posebne regulatorne sekvence (što su araI i araO kod ara – operona) a) kada nema laktoze (= negativna regulacija), a ima glukoze - represor se veže na Po i djeluje kao dominantna komponenta ove regulacije - glukoza pak inhibira enzim adenilciklazu (AC – nije prikazan) koja katalizira hidrolizu ATP – a u cAMP (dakle nema te hidrolize) te stoga nema cAMP – CAP kompleksa (jer nema cAMP – a) pa nema ni prepisivanja strukturnih gena za razgradnju laktoze b) kada je u prisustvu laktoze (= pozitivna regulacija), a manjku glukoze - vezanjem laktoze za represor, represor se ne može vezati za promotor Po jer je doživio konformacijusku promjenu (te molekule laktoze koje se vežu nazivaju se alolaktoza i tek kad se sve ostale molekule laktoze, koje nisu vezane na represore, razgrade, slijedi razgradnja alolaktoze – isto vrijedi i za arabinozu) - cAMP – CAP kompleks ima dominantnu funkciju → vezanjem se zakrivljuje DNA i povećan je afinitet za RNA polimerazu - slijedi prepisivanje strukturnih gena za razgradnju laktoze Slika 26. Konformacijska promjena proteina vezanjem alolaktoze. Isti mehanizam vrijedi i kod arabinoze. Slika 27. 25 MEF ZG / 2020. JB ©  REGULACIJA EKSPRESIJE GENA U EUKARIOTA Razlikujemo 4 razine regulacije gena u eukariota: postreplikacijska, transkripcijska, posttranskripcijska i posttranslacijska kontrola, tj. regulacija. Svaki gen ima više regulacijskih proteina koji kontroliraju njegovu ekspresiju, ali također svaki regulacijski protein kontrolira ekspresiju više gena jer jedan eukariotski gen ima veliko regulacijsko područje. POSTREPLIKACIJSKA TRANSKRIPCIJSKA POSTTRANSKRIPCIJSKA POSTTRANSLACIJSKA - metilacija DNA - promotori, - alternativni splicing - histonska modifikacija silenceri i enhanceri - kontrola transporta - ATP – ovisan kromatinski - kontrola stabilnosti remodeling - kontrola translacije - nekodirajuće RNA NAPOMENA: svi mehanizmi spadaju pod epigenetiku, no četiri posebno važna epigenetska mehanizma jesu metilacija DNA, histonska modifikacija, ATP – ovisan kromatinski remodeling te nekodirajuće RNA. Za njih stoga definiramo tzv. writerse (molekule koje omogućuju modifikaciju), readerse (molekule koje je prepoznaju i molekule čiju funkciju ta modifikacija definira) te eraserse (molekule koje brišu, uklanjaju modifikaciju). MODIFIKACIJA WRITERS READERS ERASERS metilacija DNMT 1, DNMT 3A/3B 3 različite obitelji MBP – a TET (koji imaju 2 funkcije) histonska modifikacija HAT, HMT, … različite molekule sa HDAC, HDM, … specifičnim domenama ATP – ovisan kromatinski 5 obitelji molekula - || - nemaju brisače remodeling nekodirajuće RNA nije definirano METILACIJA DNA = dodavanje metilne skupine na 5. C atom citozina te time nastaje nova baza* 5 – metilcitozin (5 – mC) – metilna se skupina može nadodati i na adenin, timin, … ali to je puno rjeđe. Slika 28. Metilacija *5 – mC je tzv. peta baza (nadodane su nove informacije (npr. ta metilna dušične baze citozina. skupina sada govori hoće li se neki protein moći stvoriti ili ne), ali nisu promijenjena svojstva citozina – i dalje se veže na gvanin) Metilna skupina dolazi iz molekule S - adenozin – L – metionin (SAM), a dodaje ju DNA metiltransferaza (DNMT). Postoje više vrsta DNMT – a od kojih su najvažnije: DNMT 1 – pronađena je na hemimetiliranoj DNA (dakle prilikom replikacije DNA jedan (stari) lanac je već metiliran, a sada treba metilirani i drugi (novi) što obavlja DNMT I) DNMT 3A i 3B – nemaju afinitet prema hemimetiliranoj DNA, već vrše de novo metilaciju (primjerice, prilikom oplodnje, nakon što jajna stanica i spermij dožive 26 MEF ZG / 2020. JB ©  potpunu demetilaciju**, ove DNMT vrše novu metilaciju budućega organizma) – djeluju od stadija blastociste i to samo u embrioblastu (jer on predstavlja stadij najmanje metilacije) **jajna je stanica gotovo je nemetilirana, a spermij je izrazito metiliran jer njegov genski materijal nema nikakvu ulogu dok ne dođe do jajne stanice koja se priprema za oplodnju Najčešće se metilira citozin u tzv. CpG otocima (područja bogata citozinom) koji se najčešće nalaze na 5' kraju promotora ili prvoga egzona nekog gena čiju ekspresiju treba regulirati, a mogu se metilirati i tzv. CpG obale s nešto manjim udjelom citozina. Primjer 1 – inaktivacija X Slika 29. Uspostavljanje kromosoma u žena – Barrovo tjelešece (inaktivacijski centar nalazi se metilacijskoga obrasca na Xist genu te uzrokuje da je inaktivnost CpG otoka X kromosoma tijekom razvoja. stabilna – dakle Xist gen jest onaj koji počinje metilaciju, ali je jedini koji neće biti metiliran) Primjer 2 - kako se epigenom (u ovom slučaju, metilacija) uspostavlja još za vrijeme ranoga razvitka, prehrana velikom količinom donora metilne skupine u trudnoći može promijeniti ekspresiju gena (posebnice folna kiselina i B vitamini) → metilne skupine otpuštaju se tada tijekom raznih metaboličkih procesa iz hranjivih tvari i prenose na DNA Primjer 3 - miševi i ljudi posjeduju agout gen koji je odgovoran za pretilost i proizvodnju inzulina: ako je metiliran (normalno stanje), miš će imati smeđe krzno, bit će mršav i imat će nizak rizik od razvitka; ako je nemetiliran, gen će dati žuto krzno, bit će debeo i sklon razvoju dijabetesa i raka (iako su oba miša genetički IDENTIČNA) Primjer 4 - jednojajčani blizanci, iako naslijede identičan set gena, što su stariji, sve se više razlikuju što ovisi o vanjskim faktorima (prehrana, fizička aktivost, pušenje, …), ali i o povećanju epigenetske modifikacije METILACIJA OPADA STARENJEM! Slika 30. Nakon što je molekula metilirana (dakle, writersi su izvršili zadatak), kako to utječe na ekspresiju gena, gdje se vidi utjecaj metilacije, tj. kako rade readersi? MBP (eng. methyl – CpG – binding protein) pripadaju trima obiteljima, a djeluju na dva načina: o privlače ostale epigenetske faktore (npr. enzime koji kataliziraju histonske modifikacije) o onemogućuju vezanje transkripcijskih faktora, a time i transkripciju 27 MEF ZG / 2020. JB © Kao što je navedeno u žuto označenom okviru, metilacija godinama opada, no tko to vrši i kako? Erasersi! oksidacijom 5 – mC u 5 – hidroksimetilcitozin (5 – hmC) koji je kataliziran TET – ovima (ten – eleven – translocation familiy TET 1, 2 i 3 (unutar obitelji enzima TET, oni označeni brojevima 1, 2 i 3 imaju ovu funkciju) koji spadaju u metilcitozin dioksigenaze) TET enzimi mogu dalje oksidirati 5 – hmC u 5 – formilcitozin (5 – fC) i 5 – karboksilcitozin (5 – caC) o 5 – hmC definira se kao tzv. šesta baza, 5 – fC i 5 – caC mogu biti 7. i 8. baza REGULACIJA TRANSKRIPCIJE Gen se sastoji od regulatorne i kodirajuće regije između kojih se nalazi promotor, a regulatornu regiju čine, između ostalog, i silenceri (utišivači) i enhanceri (pojačivači). Regulatore dijelimo u dvije skupine: 1. CIS REGULATORI = promotori, pojačivači i utišivači Promotor je mjesto vezanja RNA polimeraze, … (vidi B1), a njegova lokacija određuje se metodom otiska stopala (DNA footprinting) – slika 30. Fragment DNA radioaktivno se označi i inkubira s RNA polimerazom. Doći će do parcijalne razgradnje enzimom DNA – zom, no ondje gdje je vezana RNA polimeraza neće doći do razgradnje jer RNA polimeraza štiti taj dio DNA od fragmentnog sredstva (ovdje DNA – za) te neće biti fragmenta na elektroforezi. Enhanceri i silenceri sekvencu su DNA koje aktiviraju korištenje promotora, a time i kontroliraju jačinu transkripcije. Bez njih bi transkripcija bila na niskom bazalnom nivou (a ponekad je treba ubrzati, primjerice u trčanju trebamo više enzima koji su odgovorni za namicanje (= stvaranje) energije). Mogu aktivirati samo cis vezane promotore (promotori koji su na istom kromosomu kao i enhancer/silencer), ali ne mora biti blizu njega; najčešće se nalaze blizu gena koji se puno prepisuju (npr. imunoglobulinski gen jer nam treba puno Ig za brojne antigene s kojima se susrećemo). Primjer - Burkittov limfom primjer je nastanka tumora u kojem se, između ostaloga, protoonkogen c – myc translocira pokraj enhancera za imunoglobulin M (IgM), stoga se sada i c – myc pretjerano prepisuje što vodi u nastanak tumora. RNA polimeraza Slika 30. DNA footprinting. zaštićeni footprint Slika 31. Burkittov limfom očituje se karakterističnim deformacijama čeljusti. Endemski pogađa djecu u Africi. 28 MEF ZG / 2020. JB © TRANS REGULATORI = proteini, tzv. specifični transkripcijski faktori* koji se vežu na regulatorni dio DNA (ne djeluju samo na cis vezane regulatorne sekvence) *specifični su faktori tkivno – specifični i aktiviraju se često u samo određenim razdobljima razvoja (npr. Hox homeodomena – vidi B2) i u samo određenim tkivima, dok su bazalni transkripcijski faktori ubikvitarni (u svim su stanicama jednako prisutni i tu većinom spadaju transkripcijski faktori koji djeluju tijekom transkripcije, tj. oni koji sudjeluju u samome procesu transkripcije, dok u specifične spadaju oni koji kontroliraju transkripciju ovisno Slika 32. o tkivu kako bi osigurali specijalizaciju stanica) Razlikujemo dvije vrste trans regulatora, odnosno transkripcijskih faktora: 1. TRANSKRIPCIJSKI REGULACIJSKI AKTIVATORI – slika 32., slika 33., slika 34. o regulacijski proteini koji se vežu na regulacijske sekvence promotora, a sintetiziraju se u citoplazmi stanice i dijele se na: a) cinkovi prsti – dobili su ime po karakterističnoj strukturi koja oblikuje petlje u obliku prstiju, a svaki je prst stabiliziran centralno smještenim cinkovim ionom vezanim s dva cisteina i histidina (više na: https://www.youtube.com/watch?v=K49MlD2IF7Q&list=PLYPf1eWI8CbxF RjZ4yUm4F5Q0X6yBXQe8&index=1) b) steroidni receptori – drugi tip proteina koji također sadrži motiv cinkovih prstiju u svojoj strukturi, no to su receptori za razne hormone po svojoj funkciji, stoga smo ih izdvojili iz skupine a) - s obzirom na to da su receptori, sadrže regije za vezivanje liganda, za vezivanje za DNA (kako bi se vezali na DNA jer to je, u suštini, funkcija transkripcijskog faktora – regulacija gena vezanjem za DNA) i regiju odgovornu za aktivaciju ciljnog gena c) helix – turn – helix – najpoznatiji od ove vrste transkripcijskih faktora homeotički su proteini koji kontroliraju ekspresiju u embrionalnom razdoblju i odgovorni su za pojavu kranio – kaudalne osi (ako ih nema, može doći do homeoze – zamjena jednog dijela tijela drugim): https://www.youtube.com/watch?v=DOKgVY59h8Q d) helix – loop – helix – slično kao c), djeluju kao dimeri (dakle, moraju biti 2 transkripcijska faktora povezana kako bi djelovali) e) leucinski zatvarač – također djeluju kao dimeri, imaju oblik slova Y i vežu se za simetrične dijelove DNA kao homodimeri (= sastoje se od dvije identične jedinice), dok se heterodimeri sintetiziraju iz dva različita proteina i vezuju različite slijedove nukleotida DNA (više na: https://www.youtube.com/watch?v=votsLuI32us ) 29 MEF ZG / 2020. JB © Ovo je popis proteina određenih naziva (koji su dobile po nekoj karakteristici), a zajedničko im je da se vežu na DNA (tj. na promotor i time reguliraju ekspresiju gena). Sadržaj navedenih linkova nije gradivo ovoga kolegija, oni služe kako bi student što bolje vizualizirao ove molekule. Ipak, njihova imena proizlaze uglavnom iz njihova 3D oblika (osim steroidnih receptora, oni su ime dobili prema funkciji). Ovaj je dio gradiva kompleksan za shvatiti, o njemu nema mnogo informacija u literaturi koja je primjerena ovoj razini znanja, stoga, ako zapne, slobodno me potraži na nekoj društvenoj mreži pa ću ti pokušati pomoći u objašnjavanju. Na sreću, ovaj dio nije toliko ni bitan, ne znam pita li ijedan ispitivač ovaj dio Slika 33. Motiv cinkovih prstiju koji se gradiva. nalazi u strukturi brojnih transkripcijskih faktora. 2. TRANSKRIPCIJSKI REGULACIJSKI INHIBITORI – oni će vezanjem za DNA inhibirati ekspresiju gena Još jedan link koji bi mogao biti koristan u razumijevanju gradiva o transkripcijskim faktorima: Domain, Motifs and Turns: https://www.youtube.com/watch?v=aZCZCbanfe0. Slika 34. Transkripcijski regulatori aktivatori. Steroidni receptori nisu prikazani jer su oni vrsta faktora s motivom zinkovih prstiju. 30 MEF ZG / 2020. JB © POSTTRANSKRIPCIJSKA KONTROLA 1. ALTERNATIVNI SPLICING = različita obrada pre mRNA pri čemu jedan gen može dati više sličnih proteina (1 gen = 1 familija proteina), a pojavljuje se kod skeletnih i glatkih mišića (npr. gen za α – tropomiozin – vidi B1), fibroblasta (npr. gen fibronektin) i u mozgu 2. KONTROLA TRANSPORTA Iz jezgre u citoplazmu moguć je transport samo potpuno obrađene mRNA koja mora imati: izrezane introne na 5' kraj dodanu kapu 7mG na 3' kraj dodan poli A rep Primjer - virus HIV – a koji ugrađuje DNA kopiju svoga RNA genoma u DNA stanice domaćina (pomoću reverzne transkriptaze…). Prilikom transkripcije virusnog genoma, jedan gen iz virusnoga genoma daje mRNA različite duljine: duljina što se s tom mRNA događa mRNA 9 kB ne idu u citoplazmu samostalno (jer nisu obrađene), već samo uz Rev 4 kB protein 2 kB potpuno izrezana, izlazi iz jezgre i prevodi se u Rev protein koji omogućuje transport druge dvije mRNA 3. KONTROLA STABILNOSTI Kako je poluživot mRNA od 0,5 h do 20 h, a njihova razgradnja započinje skraćivanjem poli A repa i odstranjivanjem 5' kape, utjecanjem na ove faktore može se utjecati i na stabilnost. Primjer - u stanici postoji IRE (eng. iron response element) binding protein koji regulira sintezu proteina za metabolizam željeza Kod niske količine dolazi do vezanja IRE binding protein na mRNA (koja bi, da je ništa ne zaustavi, bila translatirana u protein za metabolizam željeza) koji sprječava njezinu translaciju jer nema željeza, pa nam ne trebaju ni proteini za njegov metabolizam. Također, IRE štiti takvu od razgradnje, omogućavajući da u stanici postoji adekvanta količina mRNA ukoliko u stanici dođe do povećanja koncentracije željeza. Ako u stanici postoji adekvantna količina željeza, dolazi do njezine translacije (i kasnije njezine razgradnje na 3' kraju). 4. KONTROLA TRANSLACIJE Kao što je navedeno u 3., kod svih mRNA dolazi do postupne razgradnje poli A repa u citoplazmi, ali isto tako postoji kontrola određenih poli A repova koji se mogu produljivati ili skraćivati (kontrola se vrši preko AU sekvenci unutar poli A repa – postojanje takvih sekvenci znak je za brzu razgradnju) 31 MEF ZG / 2020. JB ©  Primjer 1. - kod sazrijevanja organizma potreba za proteinima raste te se dodavanjem poli A repa stimulira početak translacije Primjer 2. - mRNA za histone nema poli A rep, već petlju kao znak za brzu razgradnju HISTONSKA MODIFIKACIJA Histonska modifikacija temelji se na 60 – ak različitih načina modifikacije histona, tj. aminokiselina od kojih su sastavljeni, od kojih su najvažnije: acetilacija koja odstranjuje pozitivan naboj te smanjuje afinitete između histona i DNA te povećava mobilnost nukleosoma duž DNA (podsjeti se što je nukleosom!) čime je olakšana transkripcija gena o writersi su u acetilaciji molekule HAT Kako pamtiti što radi acetilacija, a što metilacija? (eng. histone acetyltransferases), a METILACIJA UVIJEK INAKTIVIRA, i kod erasersi su HDAC (eng. histone metilacije DNA i kod metilacije histona! deacetylases) metilacija koja inaktivira kromatin o writersi su u metilaciji molekule HMT (eng. histone mehyltransferases), a erasersi su HDM (eng. histone demethylases) Također, kod metilirane DNA, 5mC (odnosno, MBP jer smo rekli da je njihova funkcija privlačenje drugih epigenetskih modifikatora) privlači histonske deacetilaze gdje dolazi do inaktivacije kromatina. DNA kod govori: „Ovo iz tebe može nastati“, a tzv. histonski kod govori: „Ovo će iz tebe nastati.“ Slika 35. Acetilacija histona. Acetilacija se može vršiti na ostacima aminokiseline lizina (više o tome učit ćeš na MKBK I, sada takvi detalji nisu bitni). 32 MEF ZG / 2020. JB © ATP – OVISAN KROMATINSKI REMODELING 5 različitih obitelji molekula dodatno remodelira kromatin (uz utrošak ATP – a, zato se tako i zovu) čime: o mijenjaju poziciju i gustoću vezanja nukleosoma za DNA o mijenjaju histonske komponente (npr. izmjenjuju H2A i H2B dimere – vidi B1) o privlače druge epigenetske faktore NEKODIRAJUĆE RNA – utišavanje gena pomoću RNAi* Dio DNA kodira i za RNA koja se ne prevodi do proteina, već djeluje kao regulacijska komponenta stanice – takve se RNA nazivaju nekanonske RNA, označavaju se s ncRNA i dijele se u dvije skupine: o tzv. housekeeping ncRNA (tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA) o i epigenetski relevantne ncRNA (tzv. long ncRNA (>200 nukleotida) i tzv. short ncRNA ( transkriptom (jer se svi geni ne prepisuju) proteom > transkriptom (zbog alternativnoga splicinga) POLITENI = GOROSTASNI KROMOSOMI* (nisu dugački, već debeli kromosomi) Prekomjerno veliki kromosomi, pojavljuju se u žlijezdama slinovnicama Drosophile melanogaster, ali kod sisavaca, pa tako ni kod ljudi ovakve amplifikacije NE POSTOJE (ako postoje, onda je to patološko stanje). Tijekom diobe ne odvaja se centromera, već se kromatide podijele 10 puta (= ENDOMITOZA), stoga postoje 1024 kromatide (DNA uz samu centromeru pak nije umnogostručena). Ovakva amplifikacija gena događa se zbog mnogo prijeko potrebnih proteina, a relativno malog broja kromosoma, a time i gena (2n = 8). 73 MEF ZG / 2020. JB © Valja se prisjetiti i bojanja gena jer nam je to bitno za mapiranje gena i za dodatno shvaćanje slike 73., 74. kako bismo znali razlikovati eukromatin od heterokromatina. Dakle, kod bojanja (da se mapiraju geni, 1 pruga = 1 gen): tamno područje = heterokromatin = manje aktivan dio DNA (pamti da je taj dio DNA skriven kao što je noću sve skriveno i tamno) svijetlo područje = eukromatin = više aktivan dio DNA Slika 73. Pruganje politenih kromosoma. Transkripcija se odvija u puffovima (= zadebljanja), a ta se pojava može izazvati hormonima (npr. ecidison). Razlika između lampbrush i politenih kromosoma: https://www.youtube.com/watch?v =D_Kbv8tTnnE Slika 74. Politeni kromosomi. Strelicama su označeni puffovi. Još malo o politenim kromosomima : Vizualizacija politenog kromosoma vinske mušice (kao na slikama 73. i 74.) pokazuje da se područja genoma, koja aktivno sintetiziraju RNA, podudaraju s dekondenziranim kromosomskim dijelom = puffom. *Naša literatura ne razlikuje pojmove politeni i gorostasni kromosom. Ipak, zgodno je napomenuti da su politeni kromosomi, kao i lampbrush kromosomi (vidi B2) zapravo dvije podvrste gorostastnih kromosoma. 74 MEF ZG / 2020. JB ©  svojstvo politeni kromosomi četkasti kromosomi gdje ih žlijezde slinovnice D. melanogaster oocite kralježnjaka, ali i beskralježnjaka nalazimo? (žabe, ne i ljudi!) izgled kako nastaju? diobom DNA, ali ne i odvajanjem dekondenzacijom postojećeg kromatida (dakle DNA se umnožila!) kromatina kako bi se olakšao pristup polimerazama za sintezu RNA (dakle, DNA se samo „opustila“ i stvorila petlje = loops) 75 MEF ZG / 2020. JB © UZORAK ISPITA IZ MEDICINSKE BIOLOGIJE – 3. dio Napomena: pitanja nisu uzeta iz baze, već sam ih sama smišljala ili su kombinirana s pitanjima koja sam pronašla na internetu, a koja se primarno koriste na studijima u SAD-u. Gradivom odgovaraju ovoj skripti, ali nisu „štreberska“, barem ne sva, posebno ne ona vezana uz poglavlje Rekombinantna DNA. Doista nisu jednostavna, zato nema straha ako za dosta njih „baciš oko“ na rješenje – bit je shvatiti iz tih rješenja principe kako bi u budućnosti posve razumio gradivo i nekad kasnije dobro baratao informacijama. Sretno! Ako imaš neduomica, slobodno mi se javi. 1. Slika prikazuje dio segmenta DNA mačke. Koji je od ponuđenih mačića najvjerojatnije potomak odrasle mačke? a. 1 b. 2 c. 3 d. 4 2. U ljudskoj DNA, koji se nukleotid metilira na 5' poziciji? a. adenozin b. tiamin c. citozin d. gvanin 3. Policajac istražuje mjesto zločina. Ubojicu (falon) je žrtva ogrebla i dio njegove kože nađen je ispod žrtvinih noktiju. Učinjen je DNA test. Koji je od sumnjivaca ubojica? a. S1 b. S2 c. S3 4. Koji je enzim odgovoran za „kopiranje“ metilacijskog zapisa s roditeljskog na lanac kći tijekom DNA replikacije? a. DNMT1 b. DNMT3A c. DNMT3B d. DNMT3L 76 MEF ZG / 2020. JB ©  5. Obitelj gospodina Kadavića čine mama, tata i četvero djece. Roditelji imaju jednu kći i jednog sina zajedno, druga kći potječe iz majčina prethodna braka, a jedan je sin posvojen. Prikazana je DNA analiza. a) Koje je dijete posvojeno? _____ b) Koje je dijete iz majčina prva braka? _____ c) Koja djeca su potomci oba roditelja? _____ i _____ 6. U laboratoriju student je uzgojio E. coli u Petrijevoj zdjelici koristeći transformaciju kao rekombinacijsku proceduru kako bi unio plazmidnu DNA s genom rezistencije na antibiotik kanamicin u bakteriju. Prikazani su rezultati. a. U kojoj Petrijevoj zdjelici rastu samo transformirane bakterije? i. I ii. II iii. III iv. IV b. Koja Petrijeva zdjelica predstavlja kontrolu u kojoj netransformirane bakterije ne mogu rasti zbog prisustnosti antibiotika? i. I ii. II iii. III iv. IV c. Ako student želi provjeriti da je transformacija bila uspješna, što mora učiniti? i. Prebaciti stanice iz zdjelice I na zdjelicu s LB agrom i inkubirati. ii. Prebaciti stanice iz zdjelice II na zdjelicu s LB agrom i inkubirati. iii. Prebaciti stanice iz zdjelice II na zdjelicu s LB agrom i kanamicinom i inkubirati. iv. Prebaciti stanice iz zdjelice III na zdjelicu s LB agrom, potom na zdjelicu s LB agrom i kanamicinom te inkubirati. 7. Odredi točnost sljedećih tvrdnji. a. Duži fragmenti DNA putuju dalje na elektroforezi nego kraći fragmenti. T N b. Udaljenost koju prijeđe fragment obrnuto je proporcionalna duljini fragmenta. T N c. Nefragmentirana DNA putuje dalje nego DNA izrezana endonukleazama. T N 77 MEF ZG / 2020. JB ©  8. Koristeći dolje prikazanu restrikcijsku mapu predvidi duljine fragmenata u 3 slučaja: fragmentacija samo s EcoRI, fragmentacija samo s XbaI te fragmetnacija s kombinacijom EcoRI/XbaI. Zacrni polja s točnom duljinom fragmenta na elektroforezi kao što je prikazano. 9. Prikazana je restrikcijska mapa dviju endonukleaza: EcoRI i BamHI. Nekoliko je fragmentacija učinjeno koristeći ili samo jedan enzim ili njihove kombinacije. Odgovori na pitanja. a. Koja traka prikazuje fragmentaciju samo s BamHI? i. I ii. II iii. III iv. IV v. V b. Koja traka prikazuje fragmentaciju samo s EcoRI? i. I ii. II iii. III iv. IV v. V c. Koja traka prikazuje fragmentaciju s oba enzima? i. I ii. II iii. III iv. IV v. V 10. Restrikcijski enzim djeluje na sljedeći segment DNA tako da reže oba lanca između tiamina i citozina. Koji od ovih parova predstavlja ljepljive krajeve koji time nastaju? ………TCGCGA…….. ……..AGCGCT……. a. …GCGC CGCG… b. …TCGC TCGC… c. …T T… d. …GA GA… e. …GCGC …GCGC… 11. Koje su dvije vrste short ncRNA prema mjestu nastanka? _________ i _________. 78 MEF ZG / 2020. JB ©  12. Segment DNA ima dva restrikcijska mjesta – I i II. Kad se inkubira s restrikcijskim enzimima I i II, nastaju tri fragmenta – a, b i c. Koji je od ponuđenih gelova produkt ove restrikcije? 13. Student je zaboravio plazmid s kojim antibiotikom je koristio u svojoj transformaciji E. coli. Mogućnosti su – kanamicin, ampicilin ili tetraciklin. Odluči napraviti poseban niz Petrijevih zdjelica u kojima je nasadio E. coli na podloge s različitim antibioticima. Rezultati su prikazani na slici. a. Gen za rezistenciju na koji antibiotik se nalazi na plazmidu? i. kanamicin ii. ampicilin iii. tetraciklin b. Kako objašnjavaš rezultate? i. Bakterije na pločama I i II sadrže plazmide koji im daje rezistenciju na antibiotik. ii. Ploča III sadrđava antibiotski agar, ali E. coli je transformirana te je sada rezistentna na tetraciklin te može porasti u toj zdjelici. iii. Ploča IV ne sadrži antibiotik. iv. Ne postoje tetraciklin – rezistentne stanice na ploči II. 14. Što su Waterland i Jirtle uočili kada su u prehranu trudnim mišicama žute agouti dlake dodali donore metilne grupe kao što su folna kiselina i vitamina B12? a. Potomci su bili deblji od onih čija je majka hranjena neobrađenom hranom. b. Potomci imaju veću vjerojatnost imati tamniju dlaku od potomaka čija majka nije hranjena neobrađenom hranom. c. Metilacija u agouti lokusu promijenila se kako su potomci rasli i razvijali se, odnosno mijenja se s vremenom neovisno o vrsti prehrane. 15. Prikazan je dio ljudskog genoma koji sadrži gen za koji se pokazalo da je abnormalno reguliran u tumorima kože. Identificirane su 4 sekvence koje se režu restrikcijsim enzimima HindIII, AvaII i SmaI. 79 MEF ZG / 2020. JB ©  a. Ako je rezano samo sa SmaI, koliko fragmenata očekuješ? ____ b. Na praznom elektroforetskom gelu razdvoje se fragmenti. Nacrtaj shemu koju očekuješ. Pripazi na označavanje + i – pola na gelu. Označi pokraj i duljine fragmenata u bp prema ravnalu na početnoj slici. c. Ako je rezano samo s HindIII, koliko fragmenata očekuješ? ____ d. Ako je rezano s SmaI i s HindIII, koliko fragmenata očekuješ? ____ 16. Radiš kao asistent na Medicinskom fakultetu u Zagrebu na istraživanju bakterija i njihova metabolizma jednog monosaharida, teoze. Metabolizam zahtijeva 3 enzima: X, Y i Z. Ovi enzimi kodirani su genima koji se svi nalaze na jednom operonu, a produkt gena N (protein N) regulira njihovu transkripciju. U normalnim stanicama, protein A uvijek je prisutan. Dijagram operona prikazan je malo niže. a. U stanici s visokom koncentracijom N proteina detektiraš kako nema transkripcije gena X, Y i Z. Zaključuješ kako je protein N aktivator / represor. (zaokruži točno) b. U daljnjem istraživanju otkriješ da je transkripcija gena N pod kontrolom proteina A koji je produkt gena A. Proučavaš kakva je transkripcija gena N, X, Y i Z prisutna u stanicama gdje je funkcija proteina A održana (A+), gdje je A nefunkcionalan (A-), potom kada ima teoze (+) i kada nema teoze (-). Rezultati su dani u tablici. i. Prema rezultatima, koja je uloga proteina A? ________________ ii. Prema rezultatima, koja je uloga teoze? ________________________________________________________ ________________________________________________________ 80 MEF ZG / 2020. JB ©  17. Na slici je prikazano stanje povezano s poremećajem regulacije ekspresije gena. a. O kojem se stanju radi? ___________________ b. Na kojoj je razini poremećena regulacija? i. metilacija DNA ii. regulacija transkripcije iii. histonska modifikacija iv. posttranskripcijska modifikacija RNA c. Koja je etiologija ovog stanja? c-myc protoonkogen translociran je uz promotor za imunoglobulin A / G / M / D / E. d. U ovoj bolesti mutiran je protoonkogen / tumor supresor gen. e. Ova bolest okarakterizirana je dvama koracima u mutacijama. Jedan od tih koraka dijeli s drugom bolesti, a ona je ___________________ f. Kako se ovo stanje prezentira u Kini? _________________ 18. Na slici je prikazana regulacija enzima za metabolizam željeza. Nadopuni sliku sljedećim izrazima te zaokruži točno: a. poli A rep b. dostatno željezo u stanici c. 7mG kapa d. nedostatnost željeza e. IRE Radi se o epigenetskom mehanizmu koji kontrolira transport / translacijU / stabilnost RNA. 19. Genomske biblioteke sastavljene su od: a. genomske DNA organizma b. genomske RNA organizma c. genomske cDNA organizma d. genomske mRNA organizma 20. Nakon 4 ciklusa u PCR, koliko će novih lanaca DNA nastati u sljedećem ciklusu? a. 16 81 MEF ZG / 2020. JB ©  b. 8 c. 32 d. 64 21. Koji je enzim jedan od glavnih elemenata u Sangerovom sekvenciranju? a. giraza b. nukleaza c. helikaza d. polimeraza 22. Poveži pripadne pojmove s njihovim kliničkim obilježjima prikazanim na slikama te opisima (nemaju sve bolesti svoju pripadnu sliku). 1. Patau sindrom a. česte plućne infekcije 2. alkaptonurija b. „djeca leptiri“ 3. Huntingotn c. mutiran metabolizam tirozina, ali ne i fenilalanina 4. Marfanov sindrom d. fenomen anticipacije 5. fenilketonurija e. mikrocefalija 6. cistična fibroza f. frameshift mutacija 7. bulozna epidermoliza g. poremećaj u popravku DNA 8. Xeroderma pigmentosum h. disekcija aorte 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. a. b. c. d. e. f. 23. Prikazane su dvije sekvence DNA, lijeva je fiziološka, a u desnoj se dogodila mutacija. 82 MEF ZG / 2020. JB ©  a. O kojoj vrsti mutacije je riječ? ________________ b. Kako se zove stanje koje uzrokuje ova mutacija? _______________ c. Na kojoj se po redu aminokiselini dogodila mutacija? ___ ___ 24. Provedeno je Sangerovo sekvenciranje. Očitaj sekvencu DNA koja je sekvencirana prema rezultatima elektroforeze. ________________________ 25. Žena od 54 godine javlja se u ginekološku ambulantu nakon nekoliko godina neredovitih pregleda. Žena navodi kako je u posljednje 3 godine izmijenila 4 partnera. Na pregledu uzima se bris cervixa i radi se uzgoj na staničnoj kulturi, a postupak koji se primjenjuje istog je principa kao i za COVID-19. a. Ginekolog sumnja na infekciju virusom / bakterijom / gljivom. Daljnjim nalazom na