Spektroskopie: Grundlagen und Anwendungen
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Questions and Answers

Was beschreibt das Übergangsdipolmoment in der Spektroskopie?

  • Die Polarisation von elektromagnetischen Wellen
  • Die Fähigkeit eines Moleküls zur Absorption oder Emission von Energie (correct)
  • Die Datenanalyse nach einer spektroskopischen Messung
  • Die Frequenz des einfallenden Lichts

    • Welche Methode fällt unter resonante Spektroskopie?

  • Neutronenstreuung
  • X-ray Diffraction
  • Dynamische Lichtstreuung
  • Fluoreszenz (correct)

    • Was ist ein typischer Anwendungsbereich der Lambert-Beer-Gleichung?

  • Bestimmung der Lichtstreuung in Feststoffen
  • Messung von Molekülgrößen
  • Analyse der Proteinstruktur
  • Quantifizierung von Absorption in Lösungen (correct)

    • Welche Aussage über Fluoreszenz ist korrekt?

    <p>Fluoreszenz ist die Emission von Licht nach energetischer Anregung.</p> Signup and view all the answers

    Welche Methode gehört zur nicht-resonanten Spektroskopie?

    <p>Statische Lichtstreuung</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Fähigkeit, ein Dipolmoment für die Absorption zu haben?

    <p>Es hängt von der Größe des Dipolmoments ab.</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Phänomene wird in der nicht-resonanten Spektroskopie nicht untersucht?

    <p>Absorption von UV-Licht</p> Signup and view all the answers

    Was passiert bei der Absorption Licht?

    <p>Ein Elektron wird von einem niedrigeren in einen höheren energetischen Zustand angehoben.</p> Signup and view all the answers

    Was ist einer der Hauptvorteile des Spektral-Photometers mit Monochromator?

    <p>Echte Referenzmessung durch Io</p> Signup and view all the answers

    Welcher Nachteil ist mit dem Spektral-Photometer mit Diodenarray verbunden?

    <p>Weniger Genauigkeit im Vergleich zu Monochromatorgeräten</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage beschreibt am besten die Absorption bei 280 nm in einem Protein?

    <p>Primär durch aromatische Aminosäuren verursacht</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die molare Extinktionskoeffizient ε bei 280 nm berechnet?

    <p>ε = 5500 * nTrp + 1490 * nTyr + 125 * nCys-Cys</p> Signup and view all the answers

    Bei welchem Wert ist die maximale Konzentration einer Probe für das Spektral-Photometer mit Monochromator?

    <p>1.2 Abs</p> Signup and view all the answers

    Was sollte bei der Verwendung verschiedener Protein-Konstrukte beachtet werden?

    <p>Mutationen können die Absorption ändern</p> Signup and view all the answers

    Welche Lampe wird typischerweise im UV-Bereich verwendet?

    <p>Quecksilberdampflampe</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein typischer Nachteil des nano-Photometers?

    <p>Geringe Genauigkeit</p> Signup and view all the answers

    Wie beeinflusst die Dicke der Wellenplatte die Polarisation des Lichts?

    <p>Sie verzögert die horizontale Komponente relativ zur vertikalen Komponente.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt der Effekt des Circulardichroismus (CD)?

    <p>Die unterschiedliche Absorption von links- und rechtzirkular polarisiertem Licht durch optisch aktive Chromophore.</p> Signup and view all the answers

    Welche Absorptionsübergänge zeigen Carbonylgruppen der Amidbindung im UV-Bereich?

    <p>π→π* und n→π* Übergänge.</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die molare Elliptizität [θ] berechnet?

    <p>[θ] = 100 · θ / C · d</p> Signup and view all the answers

    Was ermöglicht die CD-Spektroskopie in der Analyse von Proteinen?

    <p>Die Analyse der Sekundärstruktur und ob das Protein gefaltet ist.</p> Signup and view all the answers

    Welches strukturelle Element hat den größten Anteil im CD-Spektrum von Myoglobin?

    <p>Alpha Helix mit 74%</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage über die Differentialelemente im CD-Spektrum ist korrekt?

    <p>Die Beiträge der sekundären Strukturelemente addieren sich.</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die elliptische Polarisation mathematisch dargestellt?

    <p>Durch den Ausdruck θ = 2.303(AL - AR) · 180/4π.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Resonante Spektroskopie am besten?

    <p>Eine Technik zum Nachweis von Molekülen durch Absorption von Licht.</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage ist korrekt bezüglich zirkular polarisiertem Licht?

    <p>Es kann durch die Verwendung einer Viertelwellenplatte erzeugt werden.</p> Signup and view all the answers

    Was ist das Hauptprinzip der Lambert-Beer-Gleichung?

    <p>Der Zusammenhang zwischen Lichtabsorption und Konzentration einer Lösung.</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Verfahren gehört nicht zur nicht-resonanten Spektroskopie?

    <p>Fluoreszenz</p> Signup and view all the answers

    Wie beeinflusst eine Viertelwellenplatte linear polarisiertes Licht?

    <p>Sie verändert die Phasenlage der horizontalen und vertikalen Komponenten.</p> Signup and view all the answers

    Welches Prinzip beschreibt die grundlegende Funktionsweise von Fluoreszenz?

    <p>Emission von Licht beim Übergang zwischen energetischen Zuständen.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die statische Lichtstreuung am besten?

    <p>Die Streuung von Licht durch inhomogene Produkte.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Komponenten hat einen Einfluss auf die Geschwindigkeit des Lichts in einer Viertelwellenplatte?

    <p>Die elektrische Feldrichtung des Lichts.</p> Signup and view all the answers

    Welche Beschreibung trifft auf das Franck-Condon-Prinzip zu?

    <p>Es beschreibt die Anregung bei konstantem Kernabstand.</p> Signup and view all the answers

    Was wird bei der Stokes-Verschiebung beobachtet?

    <p>Ein Teil der Anregungsenergie geht als Wärme verloren.</p> Signup and view all the answers

    Welches Fluorophor hat die höchste Emissionstemperatur?

    <p>Ethidiumbromid</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage zur internen Konversion ist korrekt?

    <p>Sie ist das Ergebnis von Überlappungen von Schwingungszuständen.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Methoden gehört nicht zur resonanten Spektroskopie?

    <p>Statische Lichtstreuung</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt das Phänomen der Fluoreszenz am besten?

    <p>Die Anregung und gleichzeitig erzeugte Erwärmung bei Lichtbestrahlung.</p> Signup and view all the answers

    Welcher Faktor beeinflusst die Geschwindigkeit der Fluoreszenzlöschung nicht?

    <p>Molekülmasse des Lösungsmittels</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen hinsichtlich der Absorption von Licht durch Moleküle ist korrekt?

    <p>Die Absorption hängt vom Transitiondipolmoment ab.</p> Signup and view all the answers

    Welches Molekül hat die höchste Wellenlänge bei der Anregung?

    <p>Tryptophan</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die dynamische Lichtstreuung (DLS)?

    <p>Sie analysiert die Bewegung von gelösten Molekülen aufgrund thermischer Energie.</p> Signup and view all the answers

    Was geschieht, wenn ein Quencher mit einem Fluorophor interagiert?

    <p>Es erfolgt die Ausbildung eines nicht-fluoreszierenden Komplexes.</p> Signup and view all the answers

    In welchem Zustand befinden sich die Elektronen nach der Intersystem crossing?

    <p>Im Triplett-Zustand T1.</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage über die Lebensdauer der Phosphoreszenz ist korrekt?

    <p>Sie kann von Millisekunden bis Minuten variieren.</p> Signup and view all the answers

    Was ist der Hauptunterschied zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenz?

    <p>Phosphoreszenz beinhaltet einen verbotenen Übergang.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt das Jablonski-Diagramm in Bezug auf die Fluoreszenz und Phosphoreszenz?

    <p>Es zeigt die Übergänge zwischen verschiedenen energetischen Zuständen.</p> Signup and view all the answers

    Was ist eine atomare Eigenschaft von Quenchern zur Kontrolle der Fluoreszenz?

    <p>Sie können als bimolekulare Reaktionen wirken.</p> Signup and view all the answers

    Welche Funktion hat der Anregungsmonochromator in einem Fluoreszenzmessgerät?

    <p>Er selektiert das Licht zur Anregung der Probe.</p> Signup and view all the answers

    Was ist eine Eigenschaft von Quantenübergängen zwischen den Elektronenzuständen?

    <p>Einige Übergänge sind quantenmechanisch verboten.</p> Signup and view all the answers

    Was fördert die Energieübertragung von einem Fluorophor zu einem Quencher?

    <p>Diffusionskontrolle der Reaktion.</p> Signup and view all the answers

    Was zeigt die Geschwindigkeitskonstante kQ an?

    <p>Die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen Fluorophor und Quencher.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Spektroskopische Methoden (UV/Vis)

    • Resonante Spektroskopie:

      • Absorption (Abs): Proteine, DNA, Liganden; Lambert-Beer'sches Gesetz
      • Circulardichroismus (CD)
      • Fluoreszenz: Was ist Fluoreszenz?, Quench, Anisotropie, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

    • Nicht-resonante Spektroskopie:

      • Streuung: Statische Lichtstreuung (RALS, SECMALLS), Dynamische Lichtstreuung (DLS), Röntgenstreuung/Diffraktion, Neutronenstreuung

    Spektrum elektromagnetischer Wellen

    • Das Spektrum zeigt die verschiedenen elektromagnetischen Wellen mit unterschiedlichen Wellenlängen und Energien.
    • Wellenlängen reichen von Radiowellen bis hin zu Röntgenstrahlung.
    • Sichtbares Licht liegt zwischen Infrarot und UV.

    Licht und Übergangsdipolmoment

    • Licht ist eine elektromagnetische Welle mit elektrischem (E) und magnetischem (B) Feldkomponenten.
    • Licht kann polarisiert werden (z.B. durch Filter).
    • Fähigkeit zu absorbieren/emitieren hängt vom Dipolmoment ab.
    • Je größer das Dipolmoment, desto größer die Absorption.
    • Dipolmoment ist proportional zur Übergangswahrscheinlichkeit.

    Absorption

    • EM-Welle hebt z.B. Elektron auf höheres Niveau an.
    • Zustände (z.B. n→π*) lassen sich durch Wellenfunktionen beschreiben.
    • Übergangswahrscheinlichkeit (Bab) ist proportional zum Quadrat des Übergangsdipolmoments (µ).

    Absorption (UV/Vis)

    • Probe: Lichtintensität (Io) wird durch Probe gemessen (I).
    • Lambert-Beer'sches Gesetz: Extinktion (E) ist gleich Extinktionskoeffizient (ɛ) mal Konzentration (c) mal Schichtdicke (d).

    Lambert-Beer & Extinktionskoeffizient

    • Transmission (T): Anteil des durchgehenden Lichts in %.
    • Absorption (A): Anteil des absorbierten Lichts. A = -log T
    • Extinktion (E): Maß für die Absorption, E = ɛ ⋅ c ⋅ d.
      • ɛ (Extinktionskoeffizient) ist stoff- und wellenlängenabhängig.
      • c (Konzentration)
      • d (Schichtdicke)

    Photometer

    • Gerät zur Messung der Lichttransmission / Absorption.

    Spektral-Photometer – Monochromatorgerät

    • Monochromator: wählt bestimmte Wellenlängen aus.
    • Referenzmessung: Messung des Referenzlichts.
    • Vorteil: hohe Genauigkeit der Wellenlängenmessung.

    Spektral-Photometer – Diodenarray

    • Schnelle Messung: ein Blitz = ein Spektrum.
    • Weniger Probenbedarf.
    • Nachteil: im Vergleich zu Monochromator mit PMT nicht so genau & empfindlich.

    "ein echtes (nano) Photometer"

    • Sehr genaue Messung, minimale Probenmenge.
    • Optische Weglänge (d): 0.1 mm

    Was absorbiert in einem Protein bei 280nm?

    • Bestimmte Aminosäuren (Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin) sind für Absorption im UV-Bereich verantwortlich.
    • Die Absorption ist abhängig von der Wellenlänge und der Umgebung der Aminosäuren im Protein.

    Proteine mit Absorption im Vis-bereich

    • Eisen bindende Proteine (Fe-S-Cluster) zeigen Absorption im sichtbaren Lichtbereich.
    • Diese Absorption hängt vom gebundenen Eisen ab.

    Mischungen aus Protein/DNA

    • Spektroskopische Messungen von Mischungen aus Protein und DNA lassen Rückschlüsse auf deren Mengenverhältnisse zu.

    Protein/DNA – Daumenregeln

    • OD 1 (bei 260 nm) entspricht verschiedenen Mengen an DNA.
    • Verhältnis Abs (260/280 nm) hilft bei DNA-Kontamination in Proteinaufreinigungen.

    Hyperchromizität (DNA)

    • Schmelzen von dsDNA zu ssDNA führt zu einer Erhöhung der UV-Absorption.
    • H-Brücken spielen eine Rolle, ebenso die Resonanz der Aromaten.

    CD – Sekundärstrukturanalyse

    • Unterschiedliche Sekundärstrukturen (α-Helices, β-Faltblätter, Loops) zeigen charakteristische CD-Spektren.
    • Carbonylgruppe der Amidbindung spielt eine wichtige Rolle.

    CD-Referenzspektren

    • Graphen zeigen typische CD-Spektren für α-Helices, β-Faltblätter und restliche Strukturen.

    CD-Signal eines Proteins

    • CD-Spektrum eines Proteins entsteht durch die additive Wirkung der einzelnen Sekundärstrukturelemente (α-Helices, β-Faltblätter, Loops).
    • Der Anteil verschiedener Sekundärstrukturen lässt sich abschätzen.

    CD-Spektroskopie

    • Analyse der Sekundärstrukturanteile des Proteins.
    • Information ob Protein gefaltet ist.
    • Konformationsänderungen lassen sich bestimmen.

    Fluoreszenz

    • Ein Fluorophor kann Licht absorbieren und danach emittieren.
    • Ein Molekül kann in einen angeregten Zustand und zurück in den Grundzustand springen.
    • Emission-maximum gegenüber absorptions-maximum rotverschoben (Stokes-Shift).
    • Anregung in höherer elektronischer niveau, aber emission ist meist aus S1

    Spontane Emission

    • Die Wahrscheinlichkeit für stimulierte Absorption und Emission ist gleich groß.

    Fluoreszenz und Phoreszenz

    • Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Arten von Emission, die durch Absorption von Licht ausgelöst werden.
    • Fluoreszenz findet in weniger Zeit statt als Phosphoreszenz

    Phosphoreszenz

    • Quantitativ schwer einzuschätzen.
    • Übergang von Singulett zu Triplett-Zustand führt zu einer längeren Lebensdauer

    Fluo/Phospho-reszenz Lebensdauer

    • Fluoreszenz: Emission im 10−8 Sekunden, 10−15 Sekunden Absorption.
    • Phosphoreszenz: Emission im Millisekundenbereich.

    Messung der Fluoreszenz

    • Referenz-Photomultipliers wird bei der Messung benötigt.
    • Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf Referenz-Licht gemessen.
    • Für die Messung wird Monochromator mit Anregungs- und Emissions- monochromator benötigt

    Fluoreszenzintensität

    • Ist (im idealen Fall) proportional zur Konzentration.
    • Bei hoher Konzentration kann es durch den Inner-Filter-Effekt zu einer Nicht-Linearität kommen.

    Inner-filter Effekt

    • Nicht-linearer Zusammenhang: Fluoreszenzintensität und Konzentration sind bei hohen Extinktionen nicht mehr streng proportional, sondern nimmt ab.

    Spektren

    • Excitation und Emission Spektren werden gemessen.

    Tryptophan

    • Umgebung beeinflusst das Fluoreszenz- Spektrum.

    Beispiel: Fluoreszenzmessung (Quench)

    • Einzelstrang-DNA bindende Proteine (SSB) binden DNA.

    Fluoreszenztitrationen

    • Fluoreszenz ist Konzentrationsabhängig.

    Anisotropie (Polarisation)

    • Anisotropie bezieht sich auf die Richtungsabhängigkeit von Eigenschaften.

    Anisotropie: Messung

    • Messung der Anisotropie durch Messung des polarisierten Lichts.

    Fluorezenz: Anisotropie

    • Photoselektierte Fluorophore emittieren polarisiertes Licht.
    • Rotation der Fluorophore beeinflusst die Anisotropieabweichung.

    Anisotropie

    • Maß für die Beweglichkeit der Fluorophore.
    • Kleine Beweglichkeit -> größere Anisotropie.
    • Beispiel: Bindeproteine an DNA.

    Anisotropie: Titration

    • Fluoreszenztitration zum Studium der Protein-Ligand-Interaktionen, oft mit Hilfe von Anisotropie.

    FRET

    • Transfer von Energie zwischen zwei Fluorophoren über Dipol-Dipol-Wechselwirkung.
    • Effizienz ist abhängig vom Abstand (r-6) und der Orientierung der Fluorophore.

    GFP, CFP, YFP

    • Fluoreszenz-Proteine mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen.

    Beispiel: CFP und YFP

    • Graphen zeigen die Absorption und Emission von CFP und YFP.

    FRET: Dipol-Dipol-Wechselwirkung

    • Der FRET-Effekt ist von der Orientierung der Fluorophore und dem Abstand abhängig (r⁻⁶).
    • Je näher die Fluorophore beieinander sind, desto effizienter der Energietransfer.

    Beispiel: FRET basierter Ca²⁺-sensor

    • FRET-basierter Sensor zur Messung von Ca²⁺-Konzentrationen.
    • Sensor-design nutzt FRET-Effekt.

    Typische FRET Kurven bei Titration

    • Graphen zeigen FRET-Kurven bei Titrationen mit verschiedenen Konzentrationen.

    Fluoreszenzmikroskopie

    • Mikroskopietechnik zur Untersuchung von Fluoreszenz.

    Differential Scanning Fluorimetry (DSF)

    • Die DSF-Methode wird verwendet um thermische Stabilität von Proteinen (und Komplexen) zu analysieren.
    • Die Methode verwendet einen Fluorophor, der in den nicht-polaren Bereichen des Proteins liegt.
    • Die Fluoreszenzintensität wird bei kontinuierlicher Erhöhung der Temperatur gemessen.
    • Der Anstieg der Fluoreszenzintensität bei bestimmten Temperaturen korreliert mit der Denaturierung des Proteins.

    Thermal Shift Assay (I)

    • Die Methode misst die Denaturierung von Proteinen bei verschiedenen Temperaturen.
    • Die Temperatur, bei der 50% des Proteins denaturiert ist, Tm, wird gemessen.

    Thermal Shift Assay (II)

    • Optische Detektion ist genau, erlaubt parallele Experimente (z.B. mit qPCR/RealTime-PCR- Geräten).

    Thermal Shift Assay (Buffers & pH)

    • Puffer und pH-Wert spielen eine Rolle in der Protein-Denaturierung und werden durch die Thermal Shift Assay Methode untersucht.

    Thermal Shift Assay (Ligands)

    • Ligandenbindungstests untersuchen die Wirkung von Liganden auf die Protein-Stabilität.

    DSC mit intrinsischer Fluoreszenz

    • intrinsisch bedeutet: ohne Zugabe eines Farbstoffes.
    • Fluoreszenz von Tryptophan bei Temperaturerhöhung gemessen.

    Interpretation of nanoDSF labelfree data

    • Bestimmung der Proteinkonformation durch Messung von intrinsischer Fluoreszenz.

    Literatur

    • Liste wichtiger Lehrbücher und Fachartikel über biophysikalische Methoden und Fluoreszenz.

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    Testen Sie Ihr Wissen über die Grundlagen der Spektroskopie, einschließlich Übergangsdipolmoment, resonante und nicht-resonante Spektroskopie. Erfahren Sie mehr über wichtige Konzepte wie die Lambert-Beer-Gleichung und die Absorption von Licht in Proteinen. Dieses Quiz hilft Ihnen, Ihr Verständnis zu vertiefen.

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