Spektroskopische Methoden PDF

Spektroskopische Methoden T1ER: Methoden der Biochemie 2 (LSF: T1EQ-BN) 13:00 (c.t.) Wieland HS WS 2024/2025 Gregor Witte – Gene Center Munich (LMU) [email protected] Spektrum elek...

Spektroskopische Methoden T1ER: Methoden der Biochemie 2 (LSF: T1EQ-BN) 13:00 (c.t.) Wieland HS WS 2024/2025 Gregor Witte – Gene Center Munich (LMU) [email protected] Spektrum elektromagnetischer Wellen Aus: Skript BPC/ MH Hannover, U.Curth Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus (CD)  Dynamische Lichtstreuung (DLS)  Fluoreszenz  X-ray scattering / Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET  Differential-scanning fluorimetry Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus  Dynamische Lichtstreuung (DLS) (CD)  X-ray scattering /  Fluoreszenz Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET Licht und Übergangsdipolmoment Licht Dipolmoment  Elektromagnetische  Fähigkeit zu absorbieren/emitieren Welle  Absorption: Grundzustd. →angeregter Zustand  B- und E-Feld  Dipolmoment, vektorielle Größe, je größer desto mehr Absorption  |Diplomoment|² is proportional zur Übergangswahrscheinlichkeit  kann polarisiert werden (Filter) Absorption Energie Absorption: EM-Welle hebt z.B. Elektron auf höheres Niveau an: z.B. n→* Übergang (Zustand a nach b) S1 beide Zustände a und b können durch Wellenfunktion beschrieben werden Ψa und Ψb h S0 Übergangswahrscheinlichkeit B ab (µ ist Übergangsdipolmoment) 2 2 2 B ab 2 b µ a 2 a µ Kernabstand 3 3 Absorption (UV/Vis) Probe d Absorption, Lambert-Beer, Extinktionskoeffizient 𝐼 Transmission 𝑇= Soviel Licht kommt durch (in %) 𝐼0 𝐼 Absorption 𝐴 = − log 𝑇 = − log soviel Licht wird “absorbiert” 𝐼0 Extinktion (E) Lambert-Beer’sches Gesetz 𝑚𝑜𝑙 𝐸 𝐸 = 𝜀∙𝑐∙𝑑 𝑐[ ]= Konzentrationsbestimmung 𝑙 𝜀∙𝑑 𝐸 𝑚𝑜𝑙 =𝜀 Einheit  → [ M-1cm-1 ] 𝑐 ∙ 𝑑 𝑐𝑚 𝑙 Extinktionskoeffizient  (stoffspezifisch, wellenlängenabhängig) Lambert-Beer & Extinktionskoeffizient Messbereich: Genauigkeit???? Absorption (OD) Licht absorbiert Absorption (OD) Licht absorbiert in % in % 0 0 1.5 97 1 90 1.7 98 2 99 2.0 99 Absorption (%) 0% 25% 50% 90% 99% 100% Proteine, Farbstoffe, DNA….. Alles was absorbiert kann gemessen werden Konzentrationsbereich? Möglichst immer 0.1 – 1.2 Photometer  Spektral-Photometer – Monochromatorgerät 𝐼 𝐴 = − log 𝑇 = − log 𝐼0 Lampe: immer an, verschiedene Lampen für UV-Bereich und Vis-Bereich Vorteil: “echte” Referenzmessung weil Io mit gemessen wird, Monochromatoren → sehr genaue Wellenlänge Nachteil: relative hohes Probenvolumen, maximale Konzentration 1.2 Abs, langsames messen des Spektrums Spektral-Photometer – Diodenarray Xe-Blitz- Probe Prisma Lampe Diodenarray Vorteil: schnelle Messung (ein Blitz der Lampe=ein Spektrum) , wenig Probenbedarf,hohe Konzentrationen möglich Nachteil: im Vergleich zu einem Monochromatorgerät mit PMT nicht so genau & empfindlich, meist keine echte Messung Io “ein echtes (nano)Photometer” 𝐸 = 𝜀∙𝑐∙𝑑 0.5-2µl Probe Optische Weglänge D= 0.1 mm – 1mm Genauigkeit? Beispiel: Proteinlösung mit A(280nm)=0.3 (gemessen in 1cm Küvette) → im nano-Photometer bedeutet das: A(280nm)=0.03 – 0.003 Was absorbiert in einem Protein bei 280nm ? (Bild: Wikipedia) Absorptionsspektrum eines Proteins Peptidbindungen Aromatische Keine Absorption ! Aminosäuren Proteine mit Absorption im Vis-bereich  z.B. Eisen bindende Proteine (Fe-S cluster)  Fluorophore im Protein Was absorbiert in einem Protein bei 280nm? 280nm= nTrp * 5500 + nTyr*1490 + nCys-Cys*125 [M-1cm-1] (Pace et al., 1995) Im praktischen Leben….  Sequenz des Proteins bei ProtParam eingeben  Aufpassen wenn man mit verschiedenen Konstrukten arbeitet z.B. bei Mutationen am Protein weil man irgendetwas untersuchen will ….  Beispiel:  E.coli SSB (wildtyp) = 27960 M-1cm-1  E.coli SSB W55H (mutante) = 22640 M-1cm-1 Extinktionskeoffizienten Chromophor max [nm]  [M-1cm-1] Tryptophan 280 5600 Tyrosin 274 1400 Phenylalanin 260 200 Adenosin 260 14900 Guanosin 276 9000 Thymidin 267 9700 Uridin 261 10100 Cytidin 271 9100 NAD+ 260 17600 NADH 339 5100 258 13000 Mischungen aus Protein/DNA Absorbance spectral scans of purified dsDNA, protein or a mixture. Samples contained purified herring sperm dsDNA, BSA protein or a DNA/protein mixture at varying ratios (w/w). Measurements were taken at 1 nm intervals at wavelengths ranging from 220 to 300 nm. Data normalized to a 1 cm path length. (http://www.biotek.com/assets/tech_resources/A260A280_Spectral_Scanning_App_Note.pdf) Protein/DNA – Daumenregeln  dsDNA 1 OD (260nm) ~ 50µg/ml  ssDNA 1 OD (260nm) ~ 33µg/ml  Protein 1OD ~ 1mg/ml (ganz grob, und oft falsch!)  Verhältnis Abs(260/280nm) ist ein guter Indikator für DNA-Kontamination in Proteinaufreinigungen: %Protein % Nukleinsäure 260:280 100 0 0.57 95 5 1.06 90 10 1.32 70 30 1.73 Hyperchromizität (DNA)  Schmelzen von DNA Unterschiede e(ssDNA) und e(dsDNA), dsDNA: Resonanz d. Aromaten durch die H-Brücken limitiert  Die Absorption der Probe steigt bei dsDNA → ssDNA  DNA-Schmelzexperimente: Messen im Photometer bei konstanter langsamer Heizrate (z.B. 20K/h) Abs(260nm) vs. Temperatur DNA-Schmelzexperiment 75mM NaCl, 20mM Kpi pH7.4, Heizrate 20K/h, 38µM poly(dA-dT) , 1.26µM EcoSSB Poly(dAdT): ATATATATATATATATATATATATATAT… TATATATATATATATATATATATATATA… SSB Reaktionen verfolgen  Beispiele Beispiel: Absorption vs. Zeit Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus (CD)  Dynamische  Fluoreszenz Lichtstreuung (DLS)  X-ray scattering /  Was ist Fluoreszenz? Diffraction  Quench, Anisotropie  Neutron Scattering  FRET Circulardichroismus  Linear polarisiertes Licht: Lichtwellen, bei denen elektrische/magnetische Komponente nur in einer Ebene schwingt.  Circular polarisiertes Licht: Datei:Rising circular.gif Zirkular polarisiertes Licht erzeugen The transmission axis of the linear polarizer, represented with an orange line, is at a positive 45 ° angle. On the quarter-wave plate, also represented in orange, is the horizontal slow axis and the vertical fast axis. In this instance the unpolarized light entering the linear polarizer is displayed as a single wave whose linear polarization is suddenly changing its angle and magnitude. When one attempts to pass unpolarized light through the linear polarizer, only light that has its electric field at the positive 45° angle leaves the linear polarizer and enters the quarter-wave plate. To understand the effect the quarter-wave plate has on the linearly polarized light it is useful think of the light being divided into two components at right angles ( orthogonal ). Toward this end, the crossed orange lines are projections of the red line onto the vertical and horizontal planes respectively and represent the a mplitude of the wave on those two planes. In linearly-polarized light, the two components are in phase. Because the quarter-wave plate is made of a birefringent material, when in the wave plate, the light travels at different speeds depending on the direction of its electric field. This means that the horizontal compon ent which is along the slow axis of the wave plate will travel at a slightly slower speed than the component that is directed along the vertical fast axis. Initially the two components are in phase, but as the two components travel through the wave plate the horizontal component of the light drifts farther behind that of t he vertical. By adjusting the thickness of the wave plate one can control how much the horizontal component is delayed relative to vertical component befor e the light leaves the wave plate and they again begin to travel at the same speed. When the light leaves the quarter-wave plate the rightward horizontal component will be exactly one quarter of a wavelength behind the vertical component making the light left hand circularly polarized. (Quelle: wikipedia) CD-Theorie  Optisch aktive chromophore absorbieren rechts und links zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich, was dazu führt dass zirkular polarisiertes Licht elliptisch polarisiert wird. Dieser Effekt heißt Circulardichroismus (CD), er wird als Elliptizität dargestellt (). =2.303(AL-AR)·180/4π molare Elliptizität [] =100· /C·d=3300 · mit = L- R CD – Sekundärstrukturanalyse  Carbonylgruppe der Amidbindung hat im bei 180- 230nm zwei Absorptionsübergange (n→π*, π→ π *).  Durch assymmetrische Substitution an der CO- gruppe und H-Brücken der sekundärstrukturelemente im Protein enstehen charakteristische CD-Spektren für jede Sekundärstruktur (-helix, -Faltblatt, loops). CD-Referenzspektren CD-Signal eines Proteins  Das CD-Spektrum eines Proteins setzt sich additiv aus den einzelnen sekundärstrukturelementen zusammen: 20.0 Myoglobin 15.0 alpha Helix: 74% bonded turns: 13% 10.0 loops: 11% delta epsilon rest: 2% 5.0 0.0 190 200 210 220 230 240 250 -5.0 -10.0 Wellenlänge CD-Spektroskopie  Anteile der Sekundärstrukturen  Information: Ist das Protein gefaltet?  Titrationen möglich, wenn Änderung der Struktur  Konformationsänderungen  CD-melting, CD-kinetik  … Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus  Dynamische Lichtstreuung (DLS) (CD)  X-ray scattering /  Fluoreszenz Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET Fluoreszenz Fluoreszenz Energie Absorption: Licht ist EM-Welle - hebt z.B. Elektron auf höheres niveau an: S1 z.B. n→ Übergang (Zustand a nach b) h beide Zustände a und b können durch Wellenfunktion beschrieben werden Ψa und Ψb S0 Übergangswahrscheinlichkeit Bab (µ ist Übergangsdipolmoment) 2 2 2 Kernabstand B ab 2 b µ a 2 a µ 3 3 Spontane Emission  Wahrscheinlichkeit für stimulierte Absorption und Emission gleich groß 2 2 2 2 B ab 2 b µ a 2 a µ b B ba 3 3  Energie Franck-Condon-Prinzip: Anregung erfolgt bei konstantem Kernabstand Gleichgewichtskernabstand in höherem elektronischem Niveau größer → Anregung in höhere Schwingungs-niveaus S1 Teil der Anregungsenergie geht als Wärme verloren → Emissionsmaximum gegenüber h Absorptionsmaximum rotverschoben (Stokes Shift) h Fluoreszenz Anregung in höhere elektronische Niveaus (S2,S3...) → Emission trotzdem meistens aus S1, da Abstand der höheren Niveaus kleiner → S0 Interne Konversion Fluoreszenz ist unabhängig von der Anregungs- Wellenlänge Kernabstand Wichtige Fluorophore Gruppe Excitation (nm) Emission (nm) Phenylalanin 260 282 Tyrosin 275 303 Tryptophan 286 350 Catecholamine 285 325 Tryptamin 285 360 Riboflavin 370 455 (520) - Tocopherol 295 340 Folsäure 365 440 Adenin 265 380 (pH 1.0) ATP 272 390 (5 n H2SO4) Anilinonaphtalinsulfonsäure (ANS) 350 550 an Protein gebunden 280 460 Ethidiumbromid 480 550 Eosin 517 540 eGFP 488 516 Konkurrenzprozesse zur Fluoreszenz Interne Konversion Überlappung von Schwingungszuständen, Stoß mit Lösungsmittelmolekülen Geschwindigkeitskonstante kIC → Fluoreszenz stark temperaturabhängig Löschen/Quench Wechselwirkung mit anderen Mölekülen in der Lösung Stoßquench (Stern-Volmer-Löschung): Sauerstoff, Iodid, Acrylamid... Stoß führt zur Desaktivierung, bimolekulare Reaktion mit kQ·[Q] Reaktion meist diffusionskontrolliert (kQ=1010 M-1s-1 für O2-Quench von Tryptophan) Statisches Quenchen: Ausbildung eines nicht-fluoreszierenden Komplexes von Fluorophor und Quencher  Prinzip der Fluoreszenz Absorption S2 (angeregter Zustand) Interne Konversion Energie S1 (angeregter Zustand) Fluoreszenz Elektronen im Grundzustand Copyright© HORIBA Jobin Yvon Fluoreszenz und Phosphoreszenz Energie Singulett S1 Triplett S1 T1 h Fluores- h h Fluores- zenz h zenz h S0 Phosphoreszenz S0 Kernabstand Jablonski Diagramm Phosphoreszenz  Intersystem crossing  Quantenmechanisch verbotener Übergang Spinumkehr eines Elektrons → Triplett-Zustand (T1)  Geschwindigkeitskonstante kIS  Rückkehr nach S1 unter Aussendung eines Photons verboten → lange Lebensdauer des Triplett-Zustands (ms bis Minuten) → Phosphoreszenz  Phosphoreszenz weiter rotverschoben als Fluoreszenz, da Triplettzustand geringere Energie besitzt Fluo/Phospho-reszenz Lebensdauer S1 T1 Phosphoreszenz Fluoreszenz S0 aus: Principles of Physical Biochemistry, van Holde, 1998 Messung der Fluoreszenz Gitter Referenz-Photomultiplier Spalt Spalt Probenküvette Lampe Anregungs- Strahlteiler Monochromator Emissions- Monochromator Gitter I Spalt Ausgegebenes Signal: F I Ref Photomultiplier  Aber nicht immer linear !!!!!! Fluoreszenzintensität ist Konzentrationsabhängig 400 350 300 250 Fluoreszenz 200 150 100 50 0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Extinktion  Inner-filter Effekt 300 250 200 Fluoreszenz 150 100 50 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Extinktion Inner-filter Effekt Konzentrationszunahme Fluoreszenzintensität und Fluorophor-Konzentration sind bei höheren Extinktionen nicht mehr proportional Messung unter Bedingungen bei denen Absorption