Biochemie: Enzyme und Aminosäurenanalyse
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Questions and Answers

Welche der folgenden Enzyme sind Serinproteasen?

  • Elastase (correct)
  • LysC (correct)
  • Pepsin
  • Papain

    • Welche Eigenschaft haben die Endoproteinasen AspN und GluC gemeinsam?

  • Beide hydrolysieren Cysteinsäuren.
  • Beide sind Serinproteasen.
  • Beide spalten Peptidbindungen C-terminal. (correct)
  • Beide haben ein pH-Optimum bei 7.8. (correct)

    • Welches Enzym hat die breiteste Spezifität?

  • Thermolysin
  • Endoproteinase ArgC
  • Pronase (correct)
  • Trypsin

    • Welches Enzym spaltet bevorzugt Peptidbindungen bei einem pH-Wert von 2.0?

    <p>Pepsin</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Enzyme ist eine Metalloprotease?

    <p>Endoproteinase AspN</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage beschreibt einen Vorteil der massenspektrometrischen Detektion bei der Aminosäurenanalyse?

    <p>Erhöht den Probendurchsatz.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Nachteil der massenspektrometrischen Analyseverfahren?

    <p>Höherer apparativer Aufwand.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aminosäuren kann am besten in niedrigen Konzentrationen quantifiziert werden?

    <p>Phenylalanin</p> Signup and view all the answers

    Welche Methode erfordert die Derivatisierung für die Analyse von Aminosäuren?

    <p>GC-MS</p> Signup and view all the answers

    Welche Fehlerquelle ist am meisten mit der Hydrolyse bei der Aminosäurenanalyse verbunden?

    <p>Einfluss von Temperatur und pH.</p> Signup and view all the answers

    Welche Struktur von Proteinen beschreibt die Beziehung zwischen mehreren Polypeptidketten?

    <p>Quartärstruktur</p> Signup and view all the answers

    Welche Eigenschaft ist NICHT relevant bei der Proteinisolation?

    <p>Färbung des Proteins</p> Signup and view all the answers

    What is a key factor that influences the purification of intracellular proteins?

    <p>Zelldisruption</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden Verfahren ist eine chromatographische Methode zur Proteinisolation?

    <p>Ionenaustauschchromatographie</p> Signup and view all the answers

    Welche Eigenschaft eines Proteins könnte bei der Renaturierung problematisch sein?

    <p>Niedrige Ionenstärke</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage zur Isolierung von Proteinen ist korrekt?

    <p>Bei der Isolation müssen unlösliche Materialien abgetrennt werden.</p> Signup and view all the answers

    Was wird bei der Isolation von Extrazellulären Proteinen üblicherweise nicht berücksichtigt?

    <p>Triglycerid-Konzentration</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Stabilität von Proteinen bei der Aufreinigung?

    <p>Die Temperatur während der Renaturierung</p> Signup and view all the answers

    Welches Verfahren bietet die höchste Empfindlichkeit zur Nachweis von Proteinen?

    <p>Autoradiographie</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Vorteil des Nachweises mittels spezifischer Antikörper?

    <p>Erlaubt die Quantifizierung in Mischungen</p> Signup and view all the answers

    Was passiert während der Coomassie-Brillantblau-Färbung mit dem Gel?

    <p>Das Gel wird in einer Coomassie-Blau-Lösung eingelegt</p> Signup and view all the answers

    Was ist eine wichtige Maßnahme beim Arbeiten mit Silberfärbung?

    <p>Sauberkeit im Arbeitsbereich</p> Signup and view all the answers

    Bei welcher Nachweismethode müssen die Proteine radioaktiv markiert sein?

    <p>Autoradiographie</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die Nachweisempfindlichkeit bei der Coomassie-Brillantblau-Färbung beschrieben?

    <p>1 ng – 1 µg</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Negativfärbung während der Proteinanalytik?

    <p>Hintergrund wird opak und weiß</p> Signup and view all the answers

    Was passiert, wenn die Silberfärbung zu lange belassen wird?

    <p>Gesamtes Silber wird reduziert</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Varianten beschreibt die elektrophoretische Beweglichkeit?

    <p>Abhängig von der Größe und der Ladung der Teilchen.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein wichtiges Merkmal der Isoelektrischen Fokussierung?

    <p>Sie trennt Moleküle basierend auf ihrem pH-Wert.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Methoden ist keine elektrophoretische Technik?

    <p>Mikroskopie</p> Signup and view all the answers

    Welche Sicherheitsmaßnahme ist bei der Durchführung einer Elektrophorese besonders wichtig?

    <p>Elektrophoresekammern immer geschlossen halten.</p> Signup and view all the answers

    Welches Gerät ist nicht Teil der vertikalen Elektrophoreseapparatur?

    <p>Pipettiergerät</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage zur Verwendung von Puffern in der Elektrophorese ist korrekt?

    <p>Die Wahl des Puffers ist entscheidend für die Elektrophorese-Ergebnisse.</p> Signup and view all the answers

    In welcher Situation sollten Elektrophoresekammern feucht gehalten werden?

    <p>Es sollte immer trocken gearbeitet werden.</p> Signup and view all the answers

    Welches Verfahren kann nicht in stabilisierenden Matrices durchgeführt werden?

    <p>Ultrazentrifugation</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Vorteil von Trägerampholyten in der IEF?

    <p>Sie wirken als zwitterionische Puffer.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Nachteil der IEF?

    <p>Die Trennung dauert länger als bei Zonenelektrophorese.</p> Signup and view all the answers

    Welche Aussage über die Diskontinuierliche Elektrophorese ist korrekt?

    <p>Sie liefert scharfe Banden durch spezielle Gelporen.</p> Signup and view all the answers

    Welches der folgenden ist ein Vorteil der protein-elektrophoretischen Trennung?

    <p>Es erlaubt das direkte Ablesen des isoelektrischen Punkts.</p> Signup and view all the answers

    Was sind mögliche Nachteile der Verwendung von Trägerampholyten in der IEF?

    <p>Adduktbildung mit Proteinen ist möglich.</p> Signup and view all the answers

    Welches ist ein typisches Merkmal des Elektroblottings?

    <p>Transferierung und Immobilisierung auf einer Membran.</p> Signup and view all the answers

    Warum könnte das Fokussieren von sehr basischen Proteinen erschwert sein?

    <p>Weil sie zu stark aggregieren neigen.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein Nachteil der Reproduzierbarkeit von pH-Gradienten bei Trägerampholyten-IEF?

    <p>Schwierigkeiten bei der Erzeugung gleichbleibender Bedingungen.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Trenn- und Analysemethoden: Bioanalytische Methoden - Wintersemester 2024/25

    • Das Modul B12 behandelt im Wintersemester 2024/25 Trenn- und Analysemethoden, einschließlich bioanalytischer Methoden für Arzneistoffe.
    • Der Kurs wird von Ass. Prof. Mag. pharm. Dr. Sophia Khom-Steinkellner im Department für Pharmzeutische Wissenschaften der Universität Wien gehalten.
    • Die Sprechstunde findet nach vorheriger Vereinbarung statt.
    • Kontaktdaten: [email protected] oder [email protected], Tel: 01-4277-55035

    Inhalt der Vorlesung

    • I. Analytik von Peptiden und Proteinen:
      • Aufbau und Isolierung/Reinigung von Proteinen und Peptiden
      • Proteinbestimmungsverfahren (inkl. immunologischer Techniken)
      • Trennung von Proteingemischen
      • Aminosäurenanalytik
      • Peptidsynthese
      • Proteomanalyse
    • II. Nukleinsäuren:
      • Isolierung und Aufarbeitung von Nukleinsäuren
      • Nachweisreaktionen (in situ Hybridisierung, Polymerase-Kettenreaktion)
      • Sequenzierung von DNA und RNA

    Aufbau der Prüfung

    • Schriftliche Prüfung: 60 Minuten
    • Gesamtpunktzahl: 100 Punkte
    • Teilprüfung TAM: 50 Punkte (von Dr. Wackerlig)
    • Teilprüfung Bioanalytische Methoden: 50 Punkte
    • Multiple Choice: 10 Fragen à 5 Punkte
    • Mindestpunktzahl je Teilbereich: 25 Punkte
    • Notenschlüssel: Siehe Skript für den genauen Notenschlüssel

    Allgemeine - Grundlagen: Aminosäuren - Bausteine der Proteine

    • Aminosäuren sind die Bausteine von Proteinen.
    • Die Struktur einer Aminosäure beinhaltet einen Aminogruppe (NH2), eine Carboxylgruppe (COOH), und einen variablen Rest (R).
    • Informationen über die Seitenketten (hydrophob, polar, geladen) der Aminosäuren

    Analytik von biologischen Makromolekülen

    • Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Lipide
    • Detaillierte Informationen zu den bekannten Entdeckungen in der Bioanalyse in einem Zeitraum (1890–2004)

    pK-Wert, pH-Wert und isoelektrischer Punkt

    • pK-Wert: Der pH-Wert, bei dem die Aminosäure zu gleichen Teilen dissoziiert ist
    • pH-Wert: negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration (H+)
    • Isoelektrischer Punkt (pI): Der pH-Wert, bei dem die Netto-Ladung einer Aminosäure Null ist

    Zwitterionenform und pH-Abhängigkeit

    • Aminosäuren existieren in einer Zwitterionenform bei bestimmten pH-Werten, da sich diese Form (positiv geladener Aminogruppe , negativ geladene Carboxylgruppe) ausbildet.
    • Die ionisierte Form einer Aminosäure ist pH-abhängig.

    D- und L-Konfiguration von Aminosäuren

    • Proteinogene Aminosäuren kommen immer in der L-Form vor.
    • Die vierte Position im Tetraeder-Modell entscheidet zwischen L und D-Formen.

    Peptidbindung

    • Bildung einer Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren durch eine Kondensationsreaktion.
    • Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen Cysteinen.

    Proteine: Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur

    • Die verschiedenen Strukturen von Proteinen.

    Kapitel 1. Proteinisolation & Aufreinigung

    • Die wichtigsten Merkmale von Proteinen, die bei der Isolierung/Reinigung zu beachten sind.
      • Größe
      • Verfügbare Menge
      • Säure/Basen-Eigenschaften
      • Biologische Aktivität
      • Stabilität
      • Ziel der Aufreinigung

    Aufreinigung abhängig von Lokalisation des Proteins

    • Intrazelluläre Proteine (Isolierung und Reinigung)
    • Extrazelluläre Proteine (Zellabtrennung, Isolation) Die Methode der Aufreinigung ist abhängig von der Lokalisation des Proteins im Organismus.

    Homogenisierung und Zellaufschluss

    • Anforderungen an das Homogenisierungsmedium: Schutz der Zellen vor osmotischen Platzen, Schutz vor Proteasen, Schutz der biologischen Aktivität, Verhinderung der Aggregation, Minimierung der Zerstörung von Organellen und kein Interferenzproblem

    Möglichkeiten des Zellaufschlusses

    • Osmolyse mit/ohne enzymatische Vorbehandlung
    • Einfrieren und Auftauen
    • Zerreiben mit Mörser und Pistill
    • Kaltes organischen Lösungsmittel (z.B Aceton, -15°C, 10-fach Volumen)
    • Messerhomogenisator
    • Vibrationszellmühlen
    • Druckänderungen
    • French-Press

    Proteinfällung (Präzipitation)

    • Meistens mit unspezifischen Reagenzien (Ausnahme: Antigen-Antikörper-Präzipitation)
    • Punkte, die bei der Fällung zu beachten sind
      • Beeinträchtigung der biologischen Aktivität durch Fällungsmittel und Bedingungen.
      • Möglichkeiten zur Rückgewinnung des Fällungsmittels.
    • Möglichkeiten: Aussalzung, Fällung mit organischen Lösungsmitteln (z.B. Ethanol), Fällung mit Trichloressigsäure, Fällung von Nucleinsäuren

    Aussalzung

    • Verwendung von positiv oder negativ geladenen Ionen (Hofmeister Reihe)
    • Wirkung auf die Proteinstruktur und Löslichkeit.

    Fällung mit organischem LM & Trichloressigsäure

    • Verwendung von Ethanol oder kurzkettigen Alkoholen
    • Verwendung von 10% Trichloressigsäure
    • Vorteile und Nachteile jeder dieser Methoden

    Zentrifugation und Zentrifugationstechniken

    • verschiedene Arten von Rotordesign (Festwinkelrotor, Vertikalrotor, und Ausschwingrotor)
    • Stokessches Gesetz wird zur Berechnung der Sedimentationsgeschwindigkeit benutzt

    Zentrifugationstechniken

    • Differenzielle Zentrifugation
    • Zonenzentrifugation
    • Isopyknische Zentrifugation

    Fraktionierung der getrennten Banden

    • Diskontinuierliche Gradienten
    • Kontinuierliche Gradienten Methoden

    Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen

    • Verdünnung
    • Dialyse
    • Ultrafiltration und Diafiltration
    • Gelchromatographie
    • Reversed-Phase Chromatographie
    • Immobilisierung auf einer Membran.

    Dialyse, Ultrafiltration & Diafiltration

    • Wichtige Punkte zur Anwendung
    • Vorteile
    • Nachteile

    Gelchromatographie

    • Probenvolumen
    • Trennung von Salzen/Proteinen
    • Flussraten

    Reversed-Phase Chromatographie

    • Vorteile
    • Nachteile
    • Anwendung

    Immobilisierung auf einer Membran

    • Transfer von Proteinen auf Membran (zB. PVDF)
    • Hydrophobe Bindung an Membran
    • Elektroblot

    Konzentrierung

    • Fällung (effektiv zur Entfernung von Salzen)
    • Dialyse
    • Ultrafiltration

    Einsatz von Detergenzien und Entfernung von Detergenzien

    • Bestimmung der CMC (kritische micellare Konzentration)
    • Auswahl des richtigen Detergenzien für jedes Protein

    Häufig eingesetzte Detergentien

    • lonische Detergentien (SDS, Desoxycholat, 16-BAC)
    • Nichtionische Detergentien (Triton X-100, Triton X-114, Tween 80)
    • Zwitterionische Detergentien (Octylglucosid, CHAPS, Zwittergent 3-12)

    Ionische, Nicht-ionische und zwitterionische Detergenzien

    • Detergenz-Einsatz in der Proteineanalytik
    • Auswirkungen auf Proteinen
    • Nachteile

    Entfernung von Detergenzien

    • Unterschiedliche Entfernungsmöglichkeiten.

    Methoden

    • Die verschiedenen Verfahren zur Entfernung von Detergenzien (z.B. Verdünnung, Dialyse, Extraktion & weitere)

    Kapitel 2. Proteinbestimmung

    • Quantitative Proteinbestimmung durch Färbetests (Biuret-Assay, Lowry-Assay, BCA-Assay)
    • Spektroskopische Methoden (Messungen im UV-Bereich, Fluoreszenz)
    • Radioaktive Markierungen (zB. Iodlierung)

    Quantitative Bestimmung durch Färbetests - Allgemeine Regeln

    • Mehrfachmessungen und Mittelwertbildung
    • Probenvergleich mit Blank-Ansatz bei gleicher Wellenlänge.
    • Angabe des verwendeten Volumens

    Biuret-Assay, Lowry-Assay, Bicinchoninsäure-Assay (BCA), Bradford Assay

    • Beschreibung der Methode
    • Chemische Reaktionen
    • Nachweisgrenze und Anwendungen

    Spektroskopische Methoden (UV- und Fluoreszenzmessungen)

    • Grundlagen
    • Messbereiche
    • Anwendungen

    Radioaktive Markierung von Peptiden und Proteinen

    • Prinzip der Markierung (z.B. Iodlierung)
    • Vorteile und Nachteile

    Spektroskopische Methoden - störende Substanzen

    • Störende Substanzen bei den verschiedenen Proteinbestimmungen.

    Spektroskopische Methoden

    • Grundlagen
    • Messungen im UV-Bereich (280 nm, 205 nm)
    • Fluoreszenzmethoden
    • Empfindlichkeit für die Proteindarstellung?

    Adsorptionsmessung bei 280 nm (A280)

    • Aminosäuren-Identifizierung
    • Verstärkung von Werten
    • Ermittlung

    Adsorptionsmessung bei 205 nm (A205)

    • Peptidbindung
    • Empfindlichkeit
    • Berechnung

    Fluoreszenzmethoden

    • Messung der Eigenfluoreszenz von aromatischen Aminosäuren
    • Anregung bei 280 nm
    • Empfindlichkeit

    Zusammenfassung der gängigsten spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden

    • Tabelle mit Methoden, Nachweisgrenzen und störenden Faktoren

    Radioaktive Markierung von Peptiden und Proteinen

    • Verfahren zur Markierung von Peptiden und Proteinen mit Radioisotopen (z.B. 125I, 131I).
    • Vorteile und Nachteile.
    • Häufig verwendete Methoden

    Kapitel 3. Immunologische Techniken zur quantitativen und qualitativen Proteinbestimmung

    • Definitionen (Isotop, Fc-Rezeptor, Allotyp, Paratop und Epitop, Hapten)

    Schematischer Aufbau und Funktionen eines IgG Antikörpers

    Antigen-Antikörper-Reaktionen

    • Spezifität und Avidität der Antikörper-Antigen Bindung
    • Definitionen

    Immunagglutination

    • Prinzip und Verfahren zur Antikörperbestimmung

    Immunpräzipitation

    • Grundlagen der Immunpräzipitation
    • Anwendung

    Präparative Immunpräzipitation

    Radioimmunassays (RIA)

    • Prinzip des Verfahrens
    • Wichtige Kriterien

    Festphasen-RIA

    Immunbindung

    • Prinzip der Immunbindung
    • Amplifizierende Systeme
    • Anwendungsszenarien

    Immunhistochemie

    • Immunhistochemie Prinzip und Verfahren
    • Anwendbarkeit
    • Probenvorbereitung (z.B. Gewebefixierung, Schnittdicke)

    Kapitel 4. Chemische Modifikationen von Proteinen und Proteinkomplexen

    • Acylierung, Amidierung, Reduktive Alkylierung, Reaktionen mit Isothiocyanat und Cage-Verbindungen (modifizieren/spalten)
    • Chemische Verfahren zur Modifikation von Aminosäuren der Proteine.

    Nachweis von -SH Gruppen, Glutmat- und Aspartatreste, Argininreste, Tyrosinreste, Tryptophanreste, Histidinreste

    • Chemische Verfahren
    • Reaktionen

    Kapitel 5. Elektrophoretische Verfahren

    Allgemeine Grundlagen

    • Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit
    • 3 Verfahren: Zonenelektrophorese, Isotachophorese und Isoelektrische Fokussierung mit pH-Gradienten.

    Elektrophoreseapparaturen (Vertikal- und Horizontalsysteme)

    • Beschreibung der Apparaturen und Sicherheitsmaßnahmen bei der Elektrophorese.

    Probenvorbereitung

    • verschiedene vorbereitungsmethoden
    • Faktoren, die bei der Proteinpräparation zu beachten sind.

    Gelmedien für Elektrophorese

    • Agarose- und Polyacrylamidgele.

    Puffersysteme

    • Puffersysteme für Aminosäuren mit isoelektrischen Punkten in saueren und neutralen pH-Bereichen
    • Puffer für basische Proteine (z.B. Glycinacetat pH 3.1, Aluminiumlactat)

    Nachweis und Quantifizierung der getrennten Proteine

    • Coomassie-Brillantblau-Färbung, Silberfärbung und Fluoreszenzfärbung.
    • Vorteil und Nachteil

    Coomassie-Brillantblau-Färbung, Silberfärbung, Fluoreszenzfärbung & Densitometrie

    • Verfahren
    • Empfindlichkeit
    • Nachteile

    Färbung des Hintergrunds - Negativfärbung

    • Prinzip und Verfahren zur Negativfärbung

    Fluoreszenzfärbungen

    • Übersicht über die verschiedenen Färbemethoden
    • Quantitative Daten

    Porengradientengele - Gradientenelektrophorese

    • Verfahren zur Auftrennung von Molekülen

    Möglichkeiten einer gelelektrophoretischen Auftrennung

    • SDS-PAGE, Isoelektrische Fokussierung, Diskontinuierliche Gelelektrophorese

    SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

    • Verfahren zur Auftrennung von Proteinen nach Größe.
    • Probenvorbereitungsschritte
    • Bedeutung des SDS bei der Auftrennung von Proteinen.

    Vorteile der SDS-Elektrophorese

    • Eigenschaften der Proteine & Lösung
    • Verfahren zur Trennung von Proteinen

    Isoelektrische Fokussierung (IEF)

    • Verfahren zur Auftrennung von Proteinen nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI).
    • Proteine werden im Gradienten gelagert

    Polyacrylamid- oder Agarosegele für IEF

    • Eigenschaften der Gele
    • Vorteile und Nachteile

    Trägerampholyte für IEF

    • Eigenschaften (Pufferkapazität, Leitfähigkeit, Molmasse.)
    • Optimierte Gele

    Vorteile und Nachteile der Trägerampholyten-IEF

    Vorteile der IEF

    • hohes Auflösungsvermögen
    • unterscheidbare Genetik und Aminosäuren
    • kombinierbar

    Diskontinuierliche Elektrophorese (Disk-Elektrophorese)

    Elektroblotting – Western Blotting

    Blottingssysteme (Tankblotting & Semidry bloting)

    Transferpuffer

    • Tris-Glycin-Puffer
    • Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) - Membranen

    Detektion des Proteins in Western Blot

    • Coomassie-Färbung
    • Spezifische Antikörper als Nachweisverfahren

    Keine oder Schwache Bande

    • Fehleranalyse für das Verfahren Western Blotting

    Kapitel 6. Spaltung von Proteinen

    Edman-Chemie und Massenspektrometrie

    • Verfahren zur vollständigen/teilweisen Spaltung von Proteinen und Analytik
    • Faktoren, die zu beachten sind, und die Grenzen der Anwendung.

    Spaltung von Disulfidbrücken und Alkylierung

    Enzymatische Fragmentierung

    Proteasen (Endo- und Exoproteasen)

    • Übersicht über die verschiedenen Proteasen

    Kapitel 9. Peptidsynthese

    • Prinzip der Peptidsynthese
    • Schutzgruppen und deren Bedeutung

    Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield

    Kapitel 10. Analytik posttranslationaler Modifikationen von Proteinen

    • Phosphorylierung und Acetylierung von Proteinen

    Mehr phosphorylierter GR in alkoholabhängigen Ratten

    • GR Antagonist Mifepristone reduziert Alkoholkonsum in ratten
    • Phosphorylierung quantitativ

    Funktionelle Bedeutung von Phosphorylierungen / Acetylierungen

    • Bedeutung der Modifikation für die Proteinfunktion
    • Funktionelle Auswirkungen der Modifikationen.

    Posttranslationale Modifikation von Proteinen durch Enzyme

    • Enzyme, die verschiedene Modifikationen durchführen

    Trennung und Anreicherung von phosphorylierten Proteinen und Peptiden

    • Verfahren zur Trennung

    Detektion und Lokalisation phosphorylierter und acetylierter Proteine

    • Analysemethoden

    Posttranslationale Modifizierung von Proteinen

    Kapitel 11. Proteomics

    • Definition und Bedeutung des Proteoms
    • Einflüsse auf das Proteom
    • Verfahren zur quantitativen Darstellung des Proteoms

    Mögliche posttranslationale Modifikationen

    • Übersicht verschiedener Modifikationen

    Proteomanalyse: subtraktiver Ansatz

    Proteomanalyse:

    • Gift unterschiedlicher Bambusotterspezies (Trimeresurus sp.)
    • Analyse unterschiedlicher Gifte

    Quantitative Analyse des Proteoms mittels top-down-Strategie

    Zweidimensionale Gelelektrophorese

    • Prinzip des Verfahrens und Durchführung
    • Vorteile und Nachteile des Verfahrens

    Bottom-up-Proteomstrategie

    • Vorgehensweise

    Kapitel 12. Nucleinsäureanalytik

    • Aufbau und Grundlagen von Nucleinsäuren
    • Definitionen der Begriffe Nucleinbase, Nucleotid, und Nucleotid

    DNA-RNA

    • Unterschiede zwischen DNA und RNA
    • Darstellung der verschiedenen Basen

    Phenolextraktion wäßriger DNA-Lösungen

    Reinigung von DNA mittels Sephadex

    • Verfahren
    • Vorteile

    Ethanolpräzipitation der Nucleinsäuren

    Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren

    • Absorptionsmaximum
    • Grundlagen der quantitativen Bestimmung von Nucleinsäuren

    Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nucleinsäuren am NanoDrop

    Isolierung genomischer DNA

    • Hinweise zu den verschiedenen Methoden des Aufschlusses von verschiedenen biologischen Organismen.

    Isolierung von cytoplasmatischer RNA

    Restriktionsanalyse – Grundlagen

    • Restriktionsenzyme und ihre Funktion

    Restriktionsenzyme

    • Typen von Restriktionsenzymen
    • Eigenschaften

    Restriktionsansatz

    • Durchführung des Restriktionsansatzes
    • Faktoren, die zu beachten sind

    Vollständige Restriktion / Unvollständige Restriktion / Mehrfachrestriktion

    Restriktionsanalyse genomischer DNA

    Detektion von Mutationen und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP)

    Genetischer Fingerabdruck (fingerprinting)

    Elektrophorestische Auftrennung von Nucleinsäuren

    • Verfahren zur Auftrennung und Unterschiede zu Proteinauftrennung

    Gelelektrophorese von DNA

    • Verfahren
    • Auftrennung von linearer und zirkulärer DNA

    Gelelektrophorese von RNA

    • Prinzipunterschiede
    • Formaldehyd-, Glyoxal-, und Formaldehydgelelektrophorese
    • RNA-Längenstandards

    Qualitätkontrolle der RNA-Präparation

    • Bestimmung des RIN-Scores
    • Verfahren zur Bestimmung

    Zwei-dimensionale Gelelektrophorese

    Bottom-up-Proteomstrategie

    Klassische Proteinanalytik vs. Proteomics

    Kapitel 13. Hybridisierung und Nachweistechniken von Nucleinsäuren

    Grundlagen von Hybridisierungsreaktionen

    • Komplementarität

    Prinzip und Durchführung der Hybridisierung

    In situ-Hybridisierung

    Kapitel 14. Polymerasekettenreaktion (PCR)

    • Grundlagen
    • Anwendungen
    • Anforderungen an Primer

    Zyklischer Ablauf der PCR

    • Denaturierung, Primer-Annealing, Primer-Extension

    PCR-Geräte

    • Thermocycler

    Amplifikation von RNA mittels RT-PCR

    • Herstellung von cDNA
    • Typen von Enzymen zur Reverser Transkription
    • Vorbereitung

    Optimierung der PCR-Reaktion

    • Primereigenschaften
    • Faktoren in der Reaktion

    Kapitel 15. DNA-Sequenzierung

    • Klassische Gewinnung von RNA/DNA-Sequenzen
    • Verfahren (Sequenzierung nach Sanger – Didesoxyverfahren)

    Sequenzierung nach Sanger

    • Prinzip des Verfahrens
    • Bestandteile der Reaktion

    Kapitel 16. Next Generation Sequencing

    • Beispiel: Analyse des Transkriptoms

    Transkriptom

    Warum erstellt man ein Transkriptom

    Transcriptomics

    Vor- und Nachteile des RNAseq

    General workflow von RNAseq

    Sequencing by synthesis

    RNAseq Datenanalyse

    Differentielle Genaktivität (DGE Analyse)

    Ausblick: Welche weiteren -omics gibt es..

    (Tabelle mit einem Überblick über die verschiedenen -omics)

    Kapitel 17. Proteinelektrophorese und Blotsysteme

    Kapitel 18. Proteinanalytische Verfahren

    • Zweidimensionale Gelelektrophorese
    • Bottom-up- / Top-down- Proteomstrategie

    Kapitel 19. Isolierung, und Charakterisierung von Nucleinsäuren

    Kapitel 20. Restriktion von DNA

    Elektroblotting - Western Blotting

    • Verfahren zur Abtrennung von Proteinen aus gelelektrophoretischen Gels.

    Blotting-Systeme

    • Verfahren zu Anwendung.

    Transferpuffer

    • Meist Tris-Glycin
    • Membranen (Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid)

    Detektion von Proteinen nach Elektroblotting

    • Coomassie-Brillantblau-Färbung, Silberfärbung und Fluoreszenzfärbung

    Kapitel 6. Spaltung von Proteinen mit verschiedenen Methoden und Reagenzien

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