Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden PDF

Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Trenn-und Analysenmethoden: Bioanalytische Methoden Wintersemester 2024/25...

Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Trenn-und Analysenmethoden: Bioanalytische Methoden Wintersemester 2024/25 Ass. Prof. Mag. pharm. Dr. Sophia Khom-Steinkellner Department für Pharmzeutische Wissenschaften Sprechstunde nach vorheriger Vereinbarung [email protected] oder [email protected] Tel: 01-4277-55035  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Inhalt der Vorlesung I. Analytik von Peptiden und Proteinen: Aufbau von Protein und Peptiden, Isolierung und Reinigung von Proteinen, Proteinbestimmungsverfahren inkl. immunologischer Techniken, Auftrennung von Proteingemischen, Aminosäurenanalytik, Peptidsynthese, Analyse des Proteoms II. Nukleinsäuren: Isolierung und Aufarbeitung von Nucleinsäuren, Nachweisreaktionen von Nucleinsäuren (in situ Hybridisierung oder Polymerase- Kettenreaktion), Sequenzierung (DNA und RNA)..  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Aufbau der Prüfung Schriftliche Prüfung (60 Minuten) 100 Punkte aus den Teilprüfungen TAM & BM Teilprüfung TAM (Dr. Wackerlig) 50 Punkte Teilprüfung Bioanalytische Methoden: 50 Punkte 10 Multiple Choice Fragen á 5 Punkte ≥ 25 Punkte in jedem Teilbereich Notenschlüssel: Sehr gut (1): 100 – 90 Punkte Gut (2): 89 – 80 Punkte Befriedigend (3): 79 – 70 Punkte Genügend (4): 69 – 60 Punkte Nicht Genügend (5): 59 – 0 Punkte  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Analytik von biologischen Makromolekülen = Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Lipide..  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Allgemeine – Grundlagen: Aminosäuren – Bausteine der Proteine Identification of novel binding sites/pockets for drugs? Yin et al., 2019 Crystal structure of the human NK1-receptor PNAS  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden pK-Wert, pH-Wert und isoelektrischer Punkt pK-Wert = pH-Wert der Aminosäure, wenn genau die Säure genau zur Hälfte dissoziiert ist Isoelektrischer Punkt (pI, IEP oder PI) = pH-Wert, bei dem Nettoladung = 0  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Zwitterionenform und pH-Abhängigkeit Ladungszustand einer Aminosäure in Abhängigkeit des pH-Werts Unterschiedliche Ionisierungsformen von Aminosäuren in Abhängigkeit des pH-Werts werden für chromatographische und elektrophoretische Trennung von Proteinen und-oder Aminosäuren ausgenutzt!  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden D- und L- Konfiguration von Aminosäuren Konfiguration des D-und L-Isomeren einer Aminosäure Proteinogene Aminosäuren immer in der L-Form! Tetraedische Anordnung der Gruppen (NH3+, COO-, H+-Gruppe und der R-Seitenkette um das a-C-Atom → D- und L-Isomer → OPTISCHE AKTIVITÄT  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Peptidbindung Tripeptid Ausbildung von Disulfidbrücken  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Proteine: Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur „Researchers unveil ‘phenomenal' new AI for predicting protein structures. One structure, generated in hours, "saved us a year of work“..“  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 1. Proteinisolation & Aufreinigung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Welche Eigenschaften von Proteinen sind dabei zu beachten… Größe von Proteinen Verfügbare Mengen Säure/Basen-Eigenschaften Biologische Aktivität Stabilität Zielsetzung einer Aufreinigung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Aufreinigung: abhängig von Lokalisation des Proteins.. Intrazelluläre Proteine Inclusion bodies Extrazelluläre Proteine Zelldisruption Zelldisruption Zellabtrennung Abtrennung von Abtrennung von Abtrennung von unlöslichem Material unlöslichem Material unlöslichem Material Isolierung und Renaturierung Lipide, Proteasen Renaturierungsprobleme Verdünnt Große Proteinmengen Niedrige Ionenstärke Geringe Proteinmengen Chromatographische Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Homogenisierung und Zellaufschluss Grundanforderungen an Homogenisierungsmedium: Schutz der Zellen vor osmotischen Platzen Schutz vor Proteasen Schutz der biologischen Aktivitität Verhinderung der Aggregation Möglichst wenig Zerstörung von Organellen Keine Interferenz mit biologischen Analysen und funktionellen Tests  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Möglichkeiten Zellaufschluss? Osmolyse mit/ohne enzymatische Vorbehandlung Einfrieren und Auftauen Zerreiben mit Mörser und Pistill Kaltes, wassermischbares organisches LM (Aceton, -15˚C, 10faches Volumen Messerhomogenisator Vibrationszellmühlen Druckänderungen French-Presse  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Proteinfällung (Präzipitation) Meist mit unspezifischen Reagenzien (Ausnahme: Antigen-Antikörper- Präzipitation) Immer zu beachten: Wird die biologische Aktivität durch das Fällungsmittel und die Fällungsbedingungen beeinträchtigt? Unter welchen Bedingungen kann das Fällungsmittel wieder entfernt werden? Möglichkeiten: Aussalzung Fällung mit organischen LM Fällung mit Trichloressigsäure Fällung von Nucleinsäuren  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Aussalzung Hofmeister-Reihe Antichaotrope oder kosmotrope Salze: Chaotrope Salze: bes. gute und schonende Fällungsmittel Vermindern hydrophobe Effekte in der Lösung Vergrößern hydrophobe Effekte in der Lösung Halten Proteine in Lösung fördern Proteinaggreagation über hydrophobe WW  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fällung mit organischem LM: Vorwiegend kalter Acteon oder kurzkettige Alkohol (v.a. EtOH) Fällung mit Trichloressigsäure: Häufig eingesetzt → Ausfällen von Proteinen aus Lösung 10% Trichloressigsäure → Endkonzentration von 3-4% Nachteil: Proteine denaturiert Einsatz: v.a. für Konzentrierung für Gelelektrophorese oder enzymatische Spaltung Fällung von Nucleinsäuren:  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Zentrifugation und Zentrifugationstechniken Tischzentrifuge  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Stokessche Gleichung 2 𝑑 ⋅ 𝜌𝑝 − 𝜌𝑚 ⋅ 𝑔 𝜈= 18𝜂 Sedimentationskoeffizient (s): wird in Svedberg-Einheiten (S) angegeben Entspricht der Sedimentationsgeschwindigkeit unter geometrisch vorgegebenen Bedingungen des Zentrifugalfeldes 𝑣 −13 𝑠= 1S = 10 𝑠 𝑟𝜔 2  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Korrektes Beladen der Zentrifuge  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Zentrifugationstechniken Differenzielle Zentrifugation: nützt die unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten verschiedener Teilchen aus Zonenzentrifugation: Trennung nach Viskosität und Dichte Isopyknische Zentrifugation: v.a. für Teilchen ähnlicher Größe aber unterschiedlicher Dichte Dichtegradienten: kontinuierlich oder diskontinuierlich (in Stufen) CsCl-Lösungen Sucrose Hochmolekulare Polysaccharide wie Glykogen, Dextran oder Ficoll  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fraktionierung der getrennten Banden Zentrifugation → getrennte Banden müssen aus Zentrifugationsgefäß isoliert werden Diskontinuierliche Gradienten: Fraktionen an den Dichtegrenzen sichtbar und können vorsichtig mit Pasteurpipette abgesaugt werden Kontinuerliche Gradienten: Fraktionen oft nicht deutlich zu sehen → zB: fraktionieren, indem in Boden des Zentrifugenröhrchens ein Loch gestochen wird → Gradient wird tropfenweise gesammelt  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen Verdünnen Dialyse Ultrafiltration und Diafiltration Gelchromatographie Reversed-phase Chromatographie Immobiliserung auf einer Membran  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Dialyse Dialysemembran Cut-off-Wert beachten! Konzentrationsgradient Vorteile: sehr einfach Nachteile: relativ langsam Adsorptionsverluste  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Ultrafiltration: Besonders gut geeignet für schnelle Konzentration von Proteinlösungen Asymmetrische Membranen Ultrafiltration durch Flussrate des LM durch Ultrafiltrationsmembran → Salze (oder andere Moleküle mit MG deutlich unter Ausschlussgrenze) gemeinsam mit Wasser durch Membran gepresst Meist in Einweggefäßen durchgeführt Diafiltration: Probe wird ähnlich wie bei Dialyse entsalzt Volumen wird während Diafiltration konstant gehalten, indem kontiniuerlich frischer Dialysepuffer zugegeben wird  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Gelchromatographie Probenvolumen darf 5% des Säulenvolumens nicht übersteigen → keine ausreichende Trennung zw. Salzen und Proteinen Säulen mit großen Proteinmengen schnell überladen → keine ausreichende Trennung Spin columns Trennung besser bei geringer Flussrate → relativ lange Analysenzeit Volumen der Ausgangsprobe zumindest verdreifacht → nächster Schritt im Reinigungsgang muss Konzentrierung oder konzentrierendes Trennverfahren sein  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Reversed-Phase Chromatographie Vorteile: gut geeignet für späte Reinigungsschritte zur Entsalzung von relativ hydrophilen Proteinen größere Volumina salzhaltiger Proben Nachteile: Mögliche Denatuierung des Proteins Generell schlechte Wiederfindungsrate von hydrophoben Proteinen Teures Säulenmaterial  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Immobilisierung auf einer Membran Transfer des Proteins auf chemisch inerte Membran zB. PVDF-Membran Hydrophobe Bindung von Proteinen an Membrane Proteine auch durch Elektroblotten immobilisieren und entsalzen Nur geeignet für reine Proteine (Rückgewinnung von membranimmobiliisierten Proteinen äußerst schwierig)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Konzentrierung Fällung: effektiv, um Protein aus Lösung zu konzentrieren und gleichzeitig weitgehend von Salzen zu befreien Dialyse und Ultrafiltration Eignen sich für Entsalzung und Konzentrierung Bes. gut geeignet für Konzentrierung kleiner Volumina und kleiner Proteinmengen Bindung an chromatographisches Material Bindung an reversed-phase Materialien → auch geeignet um Peptide und Proteine auch aus großen Volumina anzureichern und konzentrieren Voraussetzung: geringe Ionenstärke des Probenpuffers (< 10mM)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Einsatz von Detergentien und Entfernung von Detergentien  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Detergenzien und ihre Entfernung Amphiphil (Synonyme: ambiphil oder amphipathisch) Bildung von Micellen (Kritische micellare Konzentration, CMC) CMC ionischer Detergentien nimmt mit höherer Ionenstärke ab, dafür relativ temperaturunabhängig CMC von nichtionischen Detergentien relativ unabhängig von Salzkonzentration, dafür abhängig von Temperatur Welches Detergens für spezifisches Protein optimal ist, muss für jeden Einzelfall empirisch ermittelt werden! Allgemein: Detergenskonzentration 0.01-3% Solublisierung von Proteinen bei Detergenskonzentration ~ CMC.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Häufig eingesetzte Detergentien Ionische Detergentien: Natriumdodecylsulfat (SDS) Desoxycholat Benzyldimethyl-n-hexadecylammoniumchlorid (16-BAC) Nichtionische Detergentien: Triton-X 100 (Poly-(ethylenglycol)n-octylphenylether) Triton-X 114 Tween 80 (Poly(oxyethylen)n-sorbitanmonooleat) Zwitterionische Detergentien: Octylglucosid (N-Octyl-1-thio-b-D-glucopyranosid) CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfat Zwittergent 3-12 (n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Ionische, Nicht-ionische und zwitterionische Detergenzien Ionische Detergenzien: Proteine effizient in momomere Form & Solubilisierung von Membranproteinen Nachteil: Denaturation → Verlust der biologischen Aktivität Nicht-ionische Detergenzien: gut geeignet für Isolierung von funktionell intakten Proteinkomplexen Nachteil: Aggregation von integralen Membranproteinen & Niedrige CMC → schwer durch Dialyse abzutrennen Sonderstellung: Triton-X Zwitterionische Detergenzien: v.a. für Ionenaustauscherchromatographie oder isoelektrische Fokussierung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Entfernen von Detergenzien Detergenzien liegen in hoher Konzentration vor → stören fast immer die nachfolgende Analytik & müssen davor entfernt werden Schwierigkeit: solubilisierte hydrophobe Proteine brauchen meist die Detergenzien für ihre Löslichkeit und Aktivität → Aktivitätsverluste oder Adsorptionsverluste an Oberflächen → Entfernung der Detergenzien immer letzter Schritt vor der eigentlichen Analytik  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Methoden: Verdünnen unterhalb der CMC Extraktion: Aceton/Triethylamin/Essigsäure/Wasser oder Heptan/Tributylamin/Essigsäure/Butanol/Wasser Ionische Retardierung: chromatographische Materialien aus polymerisierter Acrylsäure mit starkem Ionenaustauscherharz (quarternäre Ammoniumgruppen an einer Polystyrol-Divinylbenzol- Matrix) im Inneren Gelfiltration in Gegenwart organischer LM Abtrennung mittels reversed-phase HPLC Blotten auf chemisch inerte Membranen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 2. Proteinbestimmung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Quantitative Bestimmung durch Färbetests Biuret-Assay Lowry-Assay Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay) Spektroskopische Methoden Messungen im UV-Bereich Fluoreszenzmethode Radioaktive Markierung von Peptiden und Proteinen Iodierung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Quantitative Bestimmung durch Färbetests- Allgemeine Regeln Immer Mehrfachbestimmungen (idealerweise Dreifachbestimmungen) → Mittelwert bilden Proben werden grundsätzlich bei gleicher Wellenlänge gegen den sog. blank-Ansatz vermessen, der aus den gleichen Bestandteilen und Volumina des jeweilgen Farbassays, bei dem jedoch die Proteinlösung durch destilliertes Wasser ersetzt wurde! Die Angabe, worauf sich das Volumen (ml) bezieht, da je nach Methode mehrere Lösungen mit unterschiedlichen Volumina mit der Proteinprobe vereint werden müssen → das angebene Volumen sollte stets das nach der Durchführung des Assays vorliegende Endvolumen des Ansatzes sein und nicht das der eingesetzten Proteinlösung.  Modul B12 (WS 2024/25 Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe ink bioanalytischer Methode Biuret- Assay Biuret Gelöstes Biuret (Carbamoylharnstoff) und Kupfersulfat reagieren in alkalischem, wäßrigen Milieu (Biuretreaktion). Voraussetzung: Peptidbindungen Nachweisgrenze: 1-10 µg Protein/ml Messung bei λ = 550 nm Caveat: Tyrosinreste stören → Komplexierung von Kupferionen Weitere Störfaktoren: Ammonium, schwach reduzierende und stark oxidierende Substanzen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Lowry-Assay Biuret in Anwesenheit des sog. Folin-Ciocalteu-Phenol-Regens → Lowry-Assay. Färbung: tiefblau Cu2+ → Reduktion zu Cu+ Messung bei λ = 750, 650 oder 540 nm Wolframatophosphorsäure Hohe Sensitivität Nachweisgrenze: 0.1-1µg Protein/ml Zahlreiche Modifikationen bekannt Störfaktoren: EDTA, Ammoniumsulfat, Triton-X Molybdatophosphorsäure  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Bicinchoninsäure-Assay (BCA) Alternative zum Lowry-Assay Einsatz von Bicinchoinsäure (BCA) als Detektionssystem Cu2+ → Reduktion zu Cu+ Durchführung 1 Teil Probe plus 20 Teile frisch angesetzte Bicinchoinsäure/Kupfersulfat gegeben und für 30min bei 37˚Grad inkubiert. Messung bei λ = 562 nm Nachweisgrenze: 0.1-1µg Protein/ml Vorteile: einfachere Durchführung, Sensititvität und gute zeitliche Stabilität Nachteile: Preis  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Bradford Assay Blaue Säurefarbstoffe (am häufigsten Coomassie-Brilliant blue G250) Saures Milieu und Anwesenheit von Proteinen → Verschiebung des Absorptionsmaximum von 465 zu 595 nm v.a. für Anfärbung von Proteinen in Elektrophoresegels 2x sensitiver als der Lowry- oder BCA-Assay → Sensitivster quantitativer Färbeassay Einfachster Assay und keine Interferenz mit Reduktionsmitteln Nachweisgrenze: 0.05-0.5µg Protein/ml Proteinbestimmungs- Störende Substanzen methode Biuret-Assay Ammoniumsulfat, Glucose, Sulfhydrylverbindungen, Natriumphosphat… Lowry-Assay EDTA, Guanidin-HCl, Triton X-100, SDS, Brij 35, > 0.1M TRIS, Ammoniumsulfat, 1M Natriumacetat, 1M Natriumphosphat.. Bicinchoninsäure-Assay EDTA, > 10M Glucose, 1M Glycin, > 5% Ammoniumsulfat, 2M Natriumacetat, 1M Natriumphosphat.. Bradford-Assay > 0.5% Triton X-100, > 0.1% SDS, Natriumdesoxycholat.. UV-Methoden Pigmente, Phenolische Verbindungen, Organische Co- Faktoren..  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Spektroskopische Methoden Unempfindlicher als kolorimetrische Methoden Benötigen höhere Proteinkonzentrationen Sollten eher bei reineren oder hoch reinen Proteinlösungen eingesetzt werden Ideal: Eichung mit dem reinen Protein, dessen Konzentration in der Probelösung Messungen im UV-Bereich Adsorptionsmessung bei 280 nm Adsorptionsmessung bei 205 nm Fluoreszenzmethoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Adsorptionsmessung bei 280 nm (A280) λ = 280 nm Aromatische Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin (Phenylalanin ebensfalls in geringem Ausmaß) CAVEAT: in Proteinlösungen immer auch Nucleinsäuren und Nucleotide → absorbieren ebenfalls bei A280 → Werte mit folgender Formel korrigiert: Proteinkonzentration (in mg/ml) = (1.55 ∙ A280) – (0.76 ∙ A260) Geringe Empfindlichkeit Einfachste Durchführung Nachweisgrenze: 20-3000 µg Protein/ml Nicht-Proteine stören kaum  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Adsorptionsmessung bei 205 nm (A205) Basiert auf Absorptionseigenschaften von Peptidbindungen Viele Störfaktoren Gute Empfindlichkeit, Nachweisgrenze: 0.5-50 µg Protein/ml Berechung Proteinkonzentration: 31⋅𝐴205 Proteinkonzentration (mg/ml) = Genauigkeit ±10% 𝑋 𝐴280 Proteinkonzentration (mg/ml) = 27.0 + 120 ⋅ Genauigkeit ±2% 𝐴205  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fluoreszenzmethoden Messung der Eigenfluoreszenz (Primärfluoreszenz) von aromatischen Aminosäuren (v.a Tryptophan) nach entsprechender Anregung Eichgerade für quantitative Bestimmung notwendig Auch geeignet für qualitativen Nachweis Anregung bei λ = 280 nm Nachweisegrenze: 0.5-50 µg Protein/ml Stark abhängig von Polarität und pH-Wert des LM Zusammenfassung der gängigsten spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden Methode Proteinbestandteil, Nachweis- Abhängigkeit Störanfällig- auf dem der grenzen (in von keiten Nachweis mg Protein Proteinzusam- maßgeblich beruht pro ml) mensetzung Photometrisch A280 Tryptophan, Tyrosin 20-3000 stark Gering A205 Peptidbindungen 1-100 Wenig Hoch Fluorimetrisch Anregung280 Tryptophan (Tyrosin) 5-50 Stark Gering Emission320-350  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Radioaktive Markierung von Peptiden und Proteinen Proteine oder Peptide radioaktiv markiert → quantitative Bestimmung mittels Szintillationszähler Vorteil: bes. große Selektivität und Sensitivität Konzentrationen von 10-15 Mol/L von 125I markierten Peptids noch nachweisbar einfachste und häufigste Methode ist die Radiomarkierung mit 125I (HWZ = 125 Tage) oder 131I (HWZ = 8 Tage) Iodierung direkt (elektrophile Addition, Na125I ) oder indirekt (Bolton- Hunter-Reagens) Bolton-Hunter-Reagens  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Häufig verwendete Methoden zur radioaktiven Markierung von Peptiden oder Proteinen Aminosäurerest Eingeführter Marker Methode Histidin, Tyrosin 125I, 131I Chloramin T, iodobeads Tyrosin 125I, 131I Lactoperoxidase Lysin (N-Terminus) 125I, 131I Bolton-Hunter-Reagens Lysin (N-Terminus) 14C, 3H a) Anhydrid b) Aldehyd, Borhydrid Cystein 14C, 3H Iodessigsäure Tyrosin 3H Reduktion von 127I Jeder Rest 14C, 3H Peptidsynthese Zuckerrest 14C, 3H Periodat, Borhydrit  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 3. Immunologische Techniken zur quantitativen und qualitativen Proteinbestimmung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Definitionen… Isotop: homologe, näher verwandte Proteine, die in duplizierten Strukturgenen (an verschiedenen Genorten!) kodiert sind und alle in einem Individuum exprimiert werden. Beispiel: Immunglobuline A, D, E, G, und M, IgG Subklassen 1-4, Immunglobulin-Leichtketten λ oder κ Fc-Rezeptor: Bindungsrezeptor auf Zelloberflächen von zB. Monoyzten oder Lymphozyten, die an den Fc-Teil des Antikörpers binden Allotyp: eine oder mehrere Aminosäurenaustausche, codiert in einem der allelen Strukturgene (an einem Genort!) Paratop: Haftstelle, der antigenbindene Teil des Antikörpers Epitop: der vor Paratop gebundene Antigenabschnitt (Antikörper)Titer: höchste Verdünnungsstufe, bei der eine Antikörperfunktion noch meßbar ist. Titer ist abhängig von Antikörperkonzentration, Avidität und Affinität Hapten: zu klein, um immunogen zu wirken  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Schematischer Aufbau und Funktionen eines IgG Antikörpers  Modul B12 (WS 2024/25) Antigene Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Antigene können sequenziell, konformationsbedingt, verborgen und nach enzymatischer Spaltung neu auftreten (Neoantigen). Antigene meist multivalent Epitop meist 6 sub-sites: immundominant vs. immunsilent  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorraussetzung für die Immunogenität von Proteinen Große chemische Differenz des Immunogens zum immunisierten Individuum Größe des Proteins zwischen 5-10 kDa gewisse Komplexität Art der Seitenketten der frei an der Oberfläche Mäßige und geordnete Denaturierung und Aggregation Immunogen muss (limitiert) APC abbaubar hoher Antigenindex  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Antigen-Antikörper-Reaktion Spezifität des AK abhängig von der Avidität (Bindungsstärke) zum Antigen Avidität abhängig von: Affinität, welche über die monovalente Bindungsstärke zw. Epitop und Paratop definiert wird (über Bestimmung der Gleichgewichtskonstante gemessen) Multivalenz von AK Immunagglutination Immunpräzipitation Immunbindung Komplementfixation  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Immunagglutination Antigentragende Partikel oder Antigenbeladene Latexpartikel werden mit entsprechendem Immunserum vermischt → Zusammenballung → Suspension instabil → sichtbare Sedimentation Direkte Agglutination (Agglutination über Primär-AK) Indirekte Agglutination (Agglutination über Sekundär-AK) CAVE: starker AK-Überschuss → Agglutinationshemmung Ursache: jedes Epitop bindet – statistisch gesehen – einen einzigen AK monovalent → keine Kreuzvernetzung → sog. Prozoneneffekt (tritt häufig bei Immunassays auf) Abhilfe: Immunreaktion mit unbekanntem AK wird IMMER mittels entsprechender Verdünnungsreihe optimiert  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Anwendung der Immunagglutination (Beispiele) Identifikation von Antigenen an Zelloberflächen (zB. Blutgruppenbestimmung – Hämagglutination) Hämagglutination: äußerst sensitiv für Antikörpertiterbestimmungen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Immunpräzipitation Trübung der Lösung und Sedimentation Voraussetzung: beide Komponenten löslich CAVEAT: ausgeprägter Prozoneneffekt möglich Grundlage: Antikörper + Antigenen → Immunkomplex Antikörperüberschuss: alle Bindungsstellen der Antigene gesättigt → ebenfalls kleine lösliche Immunkomplexe. Antigenüberschuss: alle Bindungsstellen der Antikörper besetzt → kleine lösliche Immunkomplexe → äquivalenter Mengen Antikörper und Antigen → großer Immunkomplex (schwach löslich) → Immunpräzipitation  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Präparative Immunpräzipitation Protein aus komplexen Proteinmischung Voraussetzung: spezifischer Antikörper Proteingemisch sollte nicht zu konzentriert sein schrittweise Antikörperlösung zufügen Präzipitat Proteinbestimmung: Immunchemisch oder Aminosäurenalytik Membranproteine oder hydrophobe Proteine: gebunden → vor Präzipitation mittels nichtionischen Detergentien vom Lipid abgetrennt und monomerisiert werden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Radioimmunassays (RIA) Sensitivste Methode zur Messung von Antigenen in komplexen Proteingemischen Nachweisgrenze: 0.5 pg/ml Funktionsprinzip: Antigen/Antikörper-Reaktion in Lösung nach Mischung von radioaktiv markiertem (125I, 3H) löslichen (“heißen“) Antigens mit steigenden Mengen von nicht-markiertem (“kaltem“) Antigen → das heiße – über Radioaktivität messbare – Antigen wird durch kaltes Antigen ersetzt → anhand der Standardkurve kann Antigenmenge gemessen werden (Kalibrierung mittels bekannter Antigenmenge!)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Festphasen-RIA: Sonderform des RIA, ein Partner ist immobilisiert Vorteile RIA: Grosse Sensitivität und Versatilität Hohe Messgenauigkeit Nachteile: Radioaktivität inkl. fehlende Lagerfähigkeit (Halbwertszeit der Radionuklide), schwieriger Transport, Auflagen für Personalschutz, kostspielige Geräte etc.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Immunbindung Sichtbarmachung der Antigen-Antikörper-Reaktion: häufig Einsatz von amplifizierenden Systemen Fluoreszenz, Lumineszenz, Radioaktivität, Reduktion von Silbersalzen, enzymatische Farbreaktionen oder elektronendichte Korpuskel Vorteil: Immundetektion bei Bindungstests bereits bei einer einzigen Paratop-Epitop-Bindung, monoklonale Antikörper Blocken Methoden: Immunhistochemie, Immuncytochemie Affinitätschromatographie Enzymassays (EIA, ELISA)  Modul B12 (WS 2024/25) Blocken Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Unspezifische Adsorption durch Blocken der verbliebenen noch bindenden Stellen mithilfe von Gelatine, Rinderserumalbumin, Casein, Magermilchpulver, Eiklar…. Endogene Immunglobuline führen zB. zu verstärktem Hintergrund IHC images geblockt bzw nicht geblockt von intestinalem Gewebe  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden mmunhistochemie, Immuncytochemie Nachweis von Proteinen in situ → Lokalisation im Gewebe oder in der Zelle mittels mikroskopischer Methoden Immunhistochemie: Immundetektion im Gewebe Immuncytochemie: Immundetektion an Einzelzellen Probenvorbereitung bes. wichtig Untersuchung von nativem oder fixiertem Gewebe (zB. Paraffin, PFA) Fixieren des Gewebes/Fixation: meist Paraformaldehyd-Lösung (0.5-4%), wenn tierisches Gewebe häufig davor Perfusion mit PBS Antigenic retrieval: Immundetektion meist am bereits geschnittenen Gewebe (meist zw. 20-100 µm) Staining-Techniken: Free floating vs. Slide-mounted staining  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Optimierung: Antigenic retrieval Netrin-1 labelling Maus Cortex A reguläres IHC Protokoll → Signal Netrin nicht unterscheidbar vom Hintergrundnoise B Hitzebehandlung für antigen retrieval: schwaches Signal für Netrin C Kombination Hitze mit SDS: besseres Signal Netrin-1 signal. D SDS Behandlung ohne Hitze reduziert Hintergrundnoise und liefert scharfes Signal OPTIMIERUNG Netrin-1 IF was viewed under green fluorescence at ×40 magnification. Scale bar: 20 μm. Netrin: Protein wichtig für die Axonführung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Gewebsschnitte am Cryostat (alternativ kann auch Mikrotom oder Vibratom verwendet werden)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden https://www.youtube.com/watch?v=d43LFVV3h6w https://www.youtube.com/watch?v=_s0F_WfTbHI  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Einsatz von Antikörpern bei Immunohistochemie Kombination primärer und sekundärer Antikörpern Sek. Antikörper an Farbstoffe gekoppelt zB. Alexa Fluor oder horseradish peroxidase (HRP)-Konjugate Auswahl der Antikörper Host and target species Targeted reactivity Purification Cross-adsorption Antibody class and subclass Whole antibodies vs. fragments Conjugates https://www.thermofisher.com/antibody/primary/query/solute%20carrier%20famil y%206%20(neurotransmitter%20transporter%2C%20dopamine)%2C%20member%2 03  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Affinitätschromatographie Immobilisierung eines Reaktionspartners mittels Immunreaktion → gelöster Partner kann selektiv durch zB. Waschen isoliert werden Gebundener und freigewaschene Partner meistens im Sauren eluieren Trägermaterialien: Dextran, Agarose, Silikat.. Vorteile: sehr hohe Effizienz (100-1000fache Anreicherung möglich)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Enzymimmunassays (EIA, ELISA) Enzymimmunassay (EIA), Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzym katalysierte Substrat mit folgender Chromogenumwandlung oder Entstehung von Chemilumineszenz oder Fluroreszenz Alle Reaktionen mit immobilisiertem Partner → Trennung von gebundenen und nicht- gebundenen Teilen erleichtert Vorteile: relativ leichte Durchführung des Tests Möglichkeit des Automatisierung Messung der Farbtiefe des Chromogens mittels speziellen Photometers (Mikro-ELISA-Reader) Automatische Auswertung nach Erstellung von Standardkurven  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Komplementfixation Komplementkomponenten binden stöchiometrisch an Antigen-Antikörper-Komplexe → Quantifizierung von Antigen, Antikörper, oder Komplement Voraussetzung: 2 Partner sind quantitativ definiert Direkte Komplementlyse: Antikörper → natürlich vorkommende Antigene an der Erythrozytenmembran Indirekte Komplementlyse: Antikörper → gegen künstlich an die Erythrozytenmembran gebundene Antigene Bestimmt wird Konzentration von Hämoglobin Nachteile: sehr störungsanfällig: Komplement auch über alternativen Weg aktivierbar → Bakterien, Hefen Polyanionen etc. stören  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fluorescent activated cell sorter (FACS)- Durchflußzytometrie  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 4. Chemische Modifikationen von Proteinen und Proteinkomplexen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Chemische Modifikationen funktioneller Gruppen von Proteinen - LYSINRESTE Bevorzugtes Ziel: N-terminale α-Aminogruppen oder ε-Aminogruppen Lysinreste ubiquitär in Proteinen Befinden sich meist an Oberfläche pH-Wert > 9 Modifikation v.a. von ε-Aminogruppen Modifikationen: Acylierung Amidinierung Reduktive Alkylierung Reaktionen mit Isothiocyanat Cage-Verbindungen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Acylierung Durchgeführt mit Anhydriden (zB. Acetanhydrid) oder aktiven Estern (p-Nitrophenol- oder N-Hydroxysuccinimidester) Durch Acylierung positive Ladung der Aminogruppe entfernt → Änderung der chromatographischen Eigenschaften Reaktion mit Ethylthiotrifluoracetat → Einführung von Trifluoracetylgruppe → Untersuchung mit 19F-NMR-Spektroskopie ABBILDUNG FEHLT KAPTITEL 7 LOTTSPEICH  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Amidinierung Bewahrt positive Ladung der Lysinreste Imidoester wasserlöslich Reagieren bei pH 7 – 10 ausschließlich mit α-Aminogruppen oder ε- Aminogruppen ABBILDUNG FEHLT KAPTITEL 7 LOTTSPEICH  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Reduktive Alkylierung Reduktion der Aldimine mit NaBH4 oder NaCNBH3 → stabile fluoreszierende Produkte Vorteile der reduktiven Alkylierung: positive Ladung der modifizierten Aminogruppe bleibt erhalten Meist bleibt auch biologische Aktivität erhalten (außer Lysin essentiell für Aktivität) NaCNB3H3 oder NaB3H4 → radioaktive Proteinderivate  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Chemische Modifikationen funktioneller Gruppen von Proteinen - CYSTEINRESTE  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachweis von –SH Gruppen Chlormercuribenzoat Iodacetat oder Iodacetamid Maleinimide (zB. N-Ethylmaleinimid)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Glutamat- und Aspartatreste 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid Modifikation mit Carbodiimiden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Argininreste Guanidingruppen von Arginin Verwendet werden zB. Glyoxal, Phenylglyoxal, 2,3-Butadion..  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Tyrosinreste v.a. radioaktive Markierung von Proteinen durch Iodierung von Tyrosinresten durch Chloramin T  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Tryptophanreste v.a. für Spaltung von Peptiden oder Proteinen o-Iodosobenzoesäure oder BNPS-Skatol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Histidinreste Hohe Selektivität für Histidin: Diethylpyrocarbonat (Diethyldicarbonat)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fluoreszenzmarkierung Markierung mit Fluoroscein-isothiocyanat Markierung mit Dansylchlorid  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachweis von Dansylamiden Sehr stabil Werden auch häufig zur Bestimmung N-terminaler Aminosäuren von Peptiden und Proteinen bzw. bei der sog. Dansylvariante des Edman- Abbaus eingesetzt Optische Eigenschaften der Dansylgruppe abhängig von Umgebung: hydrophobe Umgebung → Verschiebung des Emissionsmaximum zu kürzeren Wellenlängen und Zunahme der Fluoreszenz  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Weitere Methoden zur Fluoreszenzmarkierung Reaktion mit Fluorescamin Reaktion mit o-Phthaldialdehyd (OPA) Nachweis sogar im Picomol-Bereich möglich!  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Photoaffinitätsmarkierung Derivat enthält photo-aktivierbare Gruppe (Arylazide, Diazirin) Anwendungen zB. Markierung von best. Proteinen in einem Proteingemisch Mapping von Bindungsstellen an einem Protein durch Identifizierung von Aminosäureresten, die mit dem Photoaffinity-label markiert sind  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 5. Elektrophoretische Verfahren  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Allgemeine Grundlagen Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit 3 Verfahren: Zonenelektrophorese Isotachophorese Isoelektrische Fokussierung mit pH-Gradienten Elektrophorese: In Lösung: Offene Kapillaren oder dünne Pufferschichten In stabilisierenden Matrices Membranen oder Gele  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vertikale Elektrophoreseapparaturen Stromversorgung Kühlthermostat Elektrophoresekammer  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Horizontale Systeme  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung einer Elektrophorese Elektrophoresen immer in geschlossenen Kammern durchführen. Kabel und Stecker müssen für Gleichstrom mit hohen Spannungen richtig dimensioniert und isoliert sein! Stromversorger sollten sich bei Kurzschlüssen sofort selbstständig ausschalten. Elektrophoresekammern immer an einem trockenen Platz. Stromanschlüsse der Trennkammern müssen so platziert werden, dass bei versehentlichem Öffnen der Kammern Stromkreis automatisch durchbrochen wird. Elektrophoresekammern sollten so aufgestellt werden, dass eventuell auslaufender Puffer nicht in den Stromversorger gelangen kann.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Probenvorbereitung Keine festen Partikel oder Fetttröpfchen Manche Proteine und Enzyme sehr empfindlich gegenüber best. pH- Werten oder Puffersubstanzen Elektrophoresen auch sehr empfindlich gegenüber Salzen und hohen Pufferkonzentrationen Salzkonzentration unter 50 mmol/l Löslichkeit durch nicht-ionische Chaotrope wie Harnstoff erhöhen Löslichkeit hydrophober Proteine durch nicht-ionische Detergentien zB. Triton X-100) oder zwitterionische Deteregentien wie zB. CHAPS erhöhen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Gelmedien für Elektrophorese Agarosegel Relativ großporig Agarose Polysaccharid aus Rotalgen Aufkochen in Wasser → geliert beim Abkühlen Polyacrylamidgele Chemisch inert und besonders stabil Chemische Kopolymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer (meist N,N-Methylenbisacrylamid) → klares, durchsichtiges Gel  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Puffersysteme Für Proteine mit isoelektrischen Punkten im saueren und neutralen pH-Bereich → homogene Puffer wie Tris-HCl oder Tris-Glycin pH 9.1, Tris-Barbiturat und Tris-Tricin pH 7.6 Für basische Proteine → sauere Puffer wie Glycinacetat pH 3.1 oder Aluminiumlactat pH 3.1 und lässt Trennung in Richtung Kathode laufen Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tromethamin, Trometamol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachweis und Quantifizierung der getrennten Proteine Coomassie-Brillantblau-Färbung: Silberfärbung Fluoreszenzfärbung Densitometrie messen Lichtabsorption einer elektrophoretischen Bande oder Proteinspots in einem Gel Nachweis mittels spezifischer Antikörper: wenn vorhanden spezifischer Nachweis und Quantifizierung (Vorteil: Nachweis auch in Proteingemisch möglich) Autoradiographie Voraussetzung: Proteine radioaktiv markiert Nach Elektrophorese → radioaktive Emission der Protenbanden über Schwärzung von Röntgenfilmen sichtbar gemacht Höchste Empfindlichkeit (mehrere Größenordnungen empfindicher als andere Methoden)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Coomassie-Brillantblau-Färbung Gel wird in 0.2% Coomassie-Blau Lösung in 10% Essigsäure bei 50°C eingelegt → Proteine durch Essigsäure auch fixiert Überschüßiger Farbstoff dann bei Raumtemperatur mit Essigsäure entfärbt Nachweisempfindlichkeit 100 ng – 1 µg  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Silberfärbung Proteine werden mit Ethanol und Essigsäure im Gel fixiert, mehrfach mit Wasser gewaschen und in Silbernitratlösung gelegt Reaktion rechtezeitg stoppen (starke pH-Wert Änderung mit verdünnter Essigsäure) – sonst gesamtes Silber im Gel zu metallischem Silber reduziert. Beim Arbeiten auf peinlichste Sauberkeit achten → jede Verunreinigung führt zu hohem Hintergrund oder Artefakten  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Färbung des Hintergrunds - Negativfärbung Interessant, wenn die Proteine im Anschluß zB. mit MS oder Western Blotting weiteruntersucht werden sollen Negativfärbung Bildung eines Salzkomplexes aus SDS, Imidazol und Zinksulfat → Hintergrund weiß, opak Salzkomplex im Bereich der Proteinzone bleibt löslich → keine Anfärbung Nachweisempfindlichkeit zw. Coomassie – und Silberfärbung Quantifizierung problematisch, da ja Hintergrund und nicht Protein angefärbt!!  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Fluoreszenzfärbungen Mit Metallchelaten (zB. SYPRO Ruby) oder Fluorophoren (zB. Lava Purple) Quantitative Ergebnisse über weiten Bereich Hohe Nachweisempfindlichkeit (zw. Silber- und Coomassie- Färbung) Alternative: Proteine bereits vor Auftrennung mit Fluoreszenzfarbstoff markieren (zB. an Lysin oder Cysteinreste) Detektion mittels Fluoreszenzscanner oder –kamerasysteme.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Porengradientengele - Gradientenelektrophorese → ermöglicht die Bestimmung von Molekülgrößen Gele mit linearem oder exponentiellem Gradienten  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Möglichkeiten einer gelelektrophoretischen Auftrennung SDS-PAGE: Trennung nach Größe Isoelektrische Fokussierung: Trennung nach Ladung Diskontinuierliche Gelelektrophorese: Trennung nach Größe und Ladung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) SDS = Sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat: anionische Detergens, überdeckt effektiv Eigenladungen von Proteinen → Micellen mit konst. negativer Ladung entstehen (1.4 g SDS pro g Protein) Probenvorbereitung: Proben mit Überschuß von SDS auf 95°C erhitzen → Auflösung von Sekundär- und Tertiärstrukturen durch Aufspaltung von Wasserstoffbrücken Schwefelbrücken zw. Cysteinen durch Zugabe einer reduzierenden Thiolverbindung aufgespalten Proteine sind gestreckt → diskontinuerliches SDS-hältiges Tris-HCl/Tris-Glycin-Puffersystem standardmäßig für Proteintrennung eingesetzt  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorteile der SDS-Elektrophorese Auch sehr hydrophobe und denatuierte Proteine gehen in Lösung Proteinaggreagation wird verhindert, weil die Oberflächen negativ geladen sind Schnelle Trennung, weil die SDS-Protein-Micellen hohe Ladungen tragen Alle Proteine wandern in eine Richtung Trennung erfolgt nach EINEM Parameter, der molaren Masse Nachteile der SDS-Elektrophorese SDS denaturiert die Proteine (zT sogar irreversibel) Nicht geeignet für taxonomische Bestimmungen, da Aminosäurenaustausche nicht erkannt werden können SDS nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergentien, die zB. zur Solubilisierung hyrophober Membranproteine eingesetzt werden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Isoelektrische Fokussierung IEF Isoelektrischer Punkt pI  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Trennmedien für die IEF Polyacrylamid- oder Agarosegele Vorteile Agarose: Schnellere Trennung Proteine über 800kDa können aufgetrennt werden Ungiftig und keine störenden Katalysatoren Vorteile Polyacrylamid: Weniger Hintergrundfärbung Geringe Elektroendosmose Gele auch mit hohen Harnstoffkonzentrationen möglich Gele sollten möglichst stabil sein bei gleichmäßiger und konstanter Leitfähigkeit pH-Gradienten aus freien Trägerampholyten oder immobilisierte pH- Gradienten, bei welchen die puffernden Gruppen Bestandteil des Gels sind  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Trägerampholyte Heterogene Substanzgemische aus unterschiedlichen, niedermolekularen aliphatischen Oligoamino-Oligocarbonsäuren mit unterschiedlichen isoleketrischen Punkten Ideale Trägerampholyte: Hohe Pufferkapazität imd Löslichkeit am pI Gute und gleichmäßige Leitfähigkeit am pI Keine biologische Aktivität Niedrige Molmasse die unterschiedlichen amphoteren Homologe müssen gleich konzentriert sein d.h. es darf keine Lücken im pH-Spektrum geben. Gele mit 2% Trägerampholyte  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorteile Trägerampholyten-IEF Agarose und Polyacrylamid kann verwendet werden Gele sind einfach herzustellen Trägerampholyte wirken als zwitterionische Puffer Proteine bleiben in Lösung Nachteile Trägerampholyten-IEF Zusammensetzung der verschiedenen Chargen und damit der Verlauf der pH-Gradienten wegen komplexer Herstellung nicht vollständig reproduzierbar Bildung von Addukten mit Proteinen möglich  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorteile der IEF Sehr hohes Auflösungsvermögen Genetische Unterschiede können sehr sensibel detektiert werden Proteine, die sich nur durch 1 Aminosäure unterscheiden, können getrennt werden Isoelektrischer Punkt des Proteins kann direkt abgelesen werden Lässt sich mit anderen Techniken zB. SDS-Gelelektrophorese koppeln Nachteile der IEF Manche Proteine (Membranproteine!) neigen zum Aggregieren und wandern nicht in das Gel ein Sehr basische Proteine kaum zu fokussieren mit Trägerampholyt-IEF Trennung dauert länger als bei einer Zonenelektrophorese  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Diskontinuierliche Elektrophorese (Disk-Elektrophorese) verhindert Aggregieren von Proteinen beim Eintritt ins Gel & liefert scharfe Banden engporiges Trenngel & weitporiges Sammelgel Kombination verschiedener Puffer Sehr häufig Tris-Chlorid/Tris-Glycin- System Isotachophorese  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Elektroblotting – Western Blotting elektrophoretisch aufgetrennte Proteine werden aus einer Polyacrylamidgelmatrix auf eine Membran aus Nitrocellulose unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes transferiert und immobilisiert → Western blotting Vorteil: elektrophoretisch aufgetrennte Proteine (zB. Antigene, Glykoproteine oder Enzyme) können über Antikörper, Lektine oder Enzymsubstrate direkt auf der Membran nachgewiesen werden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Blotsysteme Semidry-Blotting Tankblotting  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Transferpuffer Meist Tris-Glycin Blotmembranen Meistens Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) Sehr hydrophob Niedermolekulare Proteine und Peptide besser von Nitrocellulose gebunden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Detektion des Proteins  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Stress (repeated forced swim test= erhöht die Expression des 5-HT Transporters (SERT) an der Membranoberfläche von Neuronen im ventralen Striatum. Schindler et al. J Neurosci, 2012  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 6. Spaltung von Proteinen  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Edman-Chemie und Massenspektrometrie nur bedingt einsetzbar Proteine > 7 kDa nicht mehr vollständig analysierbar → Proteine fragmentieren Fragmente definierter Größe Isolierung der Fragmente Charakterisierung der Fragmente Bestimmung der Anordnung der einzelnen Fragmente im Protein Bestimmung der Anordnung der Einzelfragmente durch überlappende Fragmente, die aus enzymatischer Spaltung mit einem oder mehreren Enzymen erhalten wurden.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Spaltung von Disulfidbrücken und Alkylierung Spaltung entweder durch Oxidation oder Reduktion  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Reduktion irreversibel → freie SH Gruppen werden alkyliert  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Enzymatische Fragmentierung Bekannte Aminosäuresequenz bekannt → geeignetes Enzym oder Reagens führt zu Fragmenten der gewünschten Länge Spaltverhalten eines Proteins unter konstanten Bedingungen ist für jedes Protein charakteristisch und sehr reproduzierbar Auftrennung der erhaltenen Fragmente durch SDS-PAGE, Kappillarelektrophorese oder mit chromatographischen Methoden (HPLC) → charakteristische Peptidmuster (fingerprints oder peptide maps)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Proteasen Meist Serin-, Cystein-, Aspartat-, und Metalloproteasen Endoproteasen vs. Exoproteasen Endoproteasen Beispiele Chymotrypsin, Elastase , Endoproteinase ArgC, Endoproteinase AspN, Endoproteinase GluC, Endoproteinase LysC, Papain, Pepsin, Pronase, Subtilisin,Thermolysin, Trypsin, Proteinase K…. Chymotrypsin Serinprotease, hydrolisiert Peptidbindungen C-terminal von Tyr, Phe, und Trp. Leu, Met, Ala, Asp, und Glu geringere Hydrolyserate Elastase Serinprotease, hydrolisiert Peptidbindungen C-terminal von Aminosäuren mit ungeladenen, aromatischen Seitenketten (Ala, Val, Ile, Leu, Gly und Ser) Endoproteinase ArgC Serinprotease mit sehr hoher Spezifität, spaltet Peptidbindungen C- terminal von Arg-Resten, Primärstrukturanalyse von Proteinen Endoproteinase AspN Metalloprotease, spaltet Peptidbindung N-terminal von Asp und Cysteinsäuren Endoproteinase GluC Auch Protease V8 genannt, Serinprotease, in Ammoniumbicarbonat (pH=7.8) oder Ammoniumacetat (pH = 4) Peptidbindungen C- terminal von Glutamat, in Phosphatpuffer (pH = 7.8) auch Spaltung von Glu und Asp Endoproteinase LysC Serinprotease, sehr spezifische Spaltung von Amid-, Ester- und Peptidbindung C-terminal von Lys Papain Cysteinprotease, spaltet Peptidbindungen nach Arg, Lys, Glu, His, Gly und Tyr. v.a. für Totalhydrolyse verwendet, besitzt auch Esterase- und Transamidaseaktivität Pepsin Aspartatprotease, relativ breite Spezifität, spaltet bevorzugt Bindungen von Phe, Met, Leu oder Trp, pH-Optimum bei 2.0 (meisten Proteasen nicht aktiv im saueren Bereich) Pronase Nicht-spezifischen Enzymgemisch aus Streptomyces griseus. v.a für Totalhydrolyse eingesetzt Subtilisin Serinprotease, geringe Spezifität, v.a. Totalhydrolyse Vorteilhaft: auch im alkalischen Bereich bis pH = 11 aktiv Thermolysin Zinkprotease, geringe Spezifität, hydrolysiert v.a. Aminosäuren mit hydrophoben, großen Seitenketten (Ile, Leu, Met, Phe, Trp und Val), vorteilhaft: hohe Thermostabilität (4-80°C) Trypsin Serinprotease, am häufigsten verwendet. Spaltet Peptidbindungen C- terminal von Arg und Lys und deren Amide und Ester; verwendet zur Erstellung von peptide maps Proteinase K Häufig in Molekularbiologie eingesetzt, geringe Spezifität, degradiert und inaktiviert Proteine während Isolierung von RNA und DNA; spaltet C-terminal von hydrophoben, aliphatischen und aromatischen Aminosäuren  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Exoproteasen Bauen Proteine von C- oder N-terminalen Ende ab Acetylgruppen (Acylamino acid releasing enzyme) und Pyroglutamatreste (Pyroglutamat-Aminopeptidase) Carboxypeptidasen enzymatischer Abbau von Aminosäuren vom C-terminalen Ende Verwendet wird meist Gemisch aus Carboxypeptidase A, B, und Y – besitzen alle unterschiedliche Spezifität zu den einzelnen Aminosäuren frei Glykosidasen Wichtig: Glykosidasen sind keine Proteasen, sondern spalten Zuckerketten. N-Glykosidasen: spalten Zuckerkette von Asn O-Glykosidasen: spaltet Zuckerketten von Thr Phosphatasen durch Abspaltung der Phosphatgruppe kommt es zu Ladungsänderungen und Änderung des Molekulargewichts  Proteolysebedingungen Puffer 0.1 M Ammoniumbicarbonat Für viele Enzyme im Bereich von pH 8 N-Methylmorpholin geeignet Detergenzien SDS 0.1% Für die meisten Enzyme geeignet CHAPS, Octylglucosid, NP40 (bis zu 2%) Organische LM Acetonitril (20%) Endoprotease GluC, Pepsin, Trypsin, Endoprotease LysC Isopropanol (20%) Endoprotease AspN, Subtilisin, Thermolysin, Papain, Elastase Reduzierende Mercaptoethanol 0.5% Endoprotease LysC und GluC Agenzien Mercaptoethanol 1% Endoprotease AspN Spaltzeiten 4-16h bei 37°C für vollständige Proteolyse meist ausreichend Enyzm/Substrat- Spaltung in Lösung 1:20 bis 1:100 Achtung bei sehr hohen Verhältnis Spaltung im Gel oder Membran 1:1 bis Enyzmkonzentrationen kann 1:10 Autoproteolyse auftreten!  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Chemische Fragmentierung alternativ, wenn keine Enzyme für best. Bindungen erhältlich Vorteil: Meisten Reagentien unempfindlich gegenüber Salzen oder Detergentien Aber viele Spaltmethoden beschrieben, wenige in der Praxis eingesetzt weil: niedrige Spaltausbeuten, geringe Spezifität, unerwünschte Nebenreaktionen und hohe Variabilität in der Sensitivität der zu spaltenden Bindung Spaltung am Methionin mit Bromcyan Partielle saure Hydrolyse Spaltung am Tryptophan mit BNPS-Skatol, Iodosobenzoesäure, N- Bromsuccinimid oder N-Chlorsuccinimid Spaltung von Asn-Gly-Bindungen mit Hydroxylamin  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Spaltung am Methionin mit Bromcyan Vorteile: spaltet nahezu quantitativ Hoch spezfisch für Met-Xaa Jedoch schlechte Ausbeute bei Met-Thr oder Met-Ser Met selten in Proteinen → Bildung großer Fragmente Reagens flüchtig → ideal für weitere Aufarbeitung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Partielle saure Hydrolyse Selektive Spaltung von Asn-Pro Bindungen mit 70%iger Ameisensäure oder Trifluoressigsäure Spaltung aber nur unvollständig → heterogene Fragmentierungsmuster → kaum in der Proteinchemie verwendet  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Spaltung am Tryptophan Verschiedene Reagentien möglich: N-Bromsuccinimid (NBS) N-Chlorsuccinimid (NCS) 2-(2-Nitrophenylsulfenyl)3-methyl- 3-bromindolenin (BNPS-Skatol) O-Iodosobenzoesäure  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 7. Aminosäureanalyse  Modul B12 (WS 2024/25 Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe ink bioanalytischer Methode Probenvorbereitung Saure Hydrolyse: Standardmethode mit 6N HCl unter Ausschluss von Sauerstoff Alkalische Hydrolyse: sehr selten angewendet, verwendet wird 4M Barium-, Natrium- oder Lithiumhydroxid (18-70h bei 110Grad) Enzymatische Hydrolyse: ebenfalls sehr selten  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Bestimmung freier Aminosäuren bzw. Neurotransmitter nach akuter und chronischer Nikotingabe im ventralen tegementalen Areal (VTA) Buczynski MW et al. 2016 PNAS  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Flüssigchromatographie mit optischer Detektion Möglichkeiten: Vorsäulenderivatisierung oder Nachsäulenderivatisierung Ideales Derivatisierungsreagens: Reagiert mit primären und sekundären Aminen Führt zu quantitativer, reproduzierbarer Reaktion Jede Aminosäure bildet nur ein einziges, stabiles Derivat Derivate sollten hohe UV-Absorption oder hohe Fluoreszenzausbeute haben Reagens oder Reaktionsnebenprodukte sollten selbst nicht absorbieren oder die Chromatographie stören Reaktion sollte unter milden Bedingungen ablaufen.  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachsäulenderivatisierung Freie Aminosäuren werden über Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt und Derivatisierungsreagens mit Pumpe nach Säule zugemischt Zum Nachweis bzw. Quantifizierung wird Detektor verwendet. Derivatisierungsreagentien: Ninhydrin: reagiert quantitativ mit prim. und sek. Aminen Ortho-Phthaldialdehyd (OPA) Fluorescamin  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin Ninhydrin Absorption prim. Amine: 570 nm Absorption sek. Amine: 440 nm Nachweisgrenze ~ 50 pmol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachsäulenderivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) Geeignet v.a. für Detektion: prim. Amine UV-Absorption Fluoreszenzemission (Anregung bei 330nm, Emission bei 460nm) Sek. Amine: zuerst Oxidation mittels NaOCl oder Chloramin T zu prim. Aminen → dann Derivatisierung mit OPA möglich  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Nachsäulenderivatisierung mit Fluorescamin Nachteile: Fluoreszenzoptimum ist bei pH=9 Nicht stabil in wäßriger Lösung → Untergeordnete Rolle in der Aminosäureanalytik  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung Reversed-phase Chromatographie (RP) Voraussetzung Vorteile: Sehr rasche Trennung Hohe Empfindlichkeit durch Einführen von Chromophoren oder Fluorophoren Nachweisgrenze: (theoretisch) bis 50 fmol Ortho-Phthalaldehyd (OPA) Phenylisothiocyanat (PITC) Fluorenylmethoxycarbonyl- (FMOC)-chlorid Dabsylchlorid (DABS-Cl) Dansylchlorid 6-Aminoquinoyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamat (ACQ)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) 2-Mercaptoethanol, Ethanthiol, 3-Mercaptopropionsäure → vermitteln unterschiedliche Hydrophobizität oder Stabilität der einzelnen Derivate Detektion: UV (Nachweisgrenze: 10 pmol) oder Fluoreszenzdetektion (Nachweisgrenze: 200 fmol)  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung mit Phenylisothiocyanat (PITC) Reagiert mit primären und sekundären Aminen Vorteile: Keine störenden Nebenprodukte für RP-Chromatographie Absorptionsmaximum: 245 nm Nachweisgrenze: ~1 pmol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung mit Fluorenylmethoxycarbonyl- (FMOC)-chlorid Reagiert mit primären und sekundären Aminen Nachteil: FMOC hydrolysiert sehr sehr schnell → Abtrennung von Reaktionsansatz → Verlust von Aminosäuren Detektion: Absorption bei 260 nm, Fluoreseszenz bei 305 nm (Anregungswellenlänge 266 nm) Detektionsgrenze: 50 fmol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung mit Dabsylchlorid (DABS-Cl) Reagiert mit primären und sekundären Aminen Absorption im sichtbaren Bereich bei 436 nm Vorteile: über Wochen anhaltende Stabilität und das Absorptionsverhalten. Nachteil: nicht automatisierbar Detektionslimit: ~ 1 pmol  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Vorsäulenderivatisierung mit Dansylchlorid Reagiert mit primären und sekundären Aminen → stark fluoreszierende Derivate Nachteile: niedrige Reaktionsgeschwindigkeit, unvollständige Reaktion und viele Nebenprodukte → kaum Anwendung in der Aminosäurenanalytik  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Datenauswertung und Beurteilung der Analyse Kalibrierung des Systems mit unterschiedlichen Aminosäurekonzentrationen Subtraktion einer Nullwertanalyse Nur wenige Aminosäuren (Alanin, Phenylalanin, Leucin) auch in niedrigen Konzentrationen gut quantifizierbar Mehrere Messungen → Werte extrapolieren Aminosäureanalysen mit Fehler kleiner ± 10% in einem Bereich über 10 pmol pro Aminosäure durchführbar, auch wenn Nachweisgrenze der einzlnen Methoden darunter liegt Meisten Fehler bei der Hydrolyse  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Aminosäurenanalyse mit massenspektrometrischer Detektion Vorteile: Kaum Probenvorbereitung deutlich kürzere Trennzeiten Erhöhter Probendurchsatz Nachteil: höherer apparativer Aufwand Ionenpaar-LC-MS-MS: sehr kurze Analysezeiten, über 70 verschiedene physiologische AS möglich HILIC-MS (Hydrophilic-interaction Chromatographie) CE-MS Keine Vorderivatisierung, relativ hohe Nachweisgrenze GC-MS Derivatisierung meistens Sylierung mittels N,O- Bis-(trimethyl-silyl)trifliuoracetamid (BSFTA) oder N- Methyl(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSFTA) aTRAQ-LC-MS Direktinfusions-MS-MS: zB beim Neugeborenenscreening für Blut oder Urinproben.  Methode Vorteil Nachteil LC-Methoden Etablierte Methoden, hoch reproduzierbar, Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, mit optischer preiswerte Geräte, gute Linearität Derivatisierung erforderlich, keine Analytenspezifität, Detektion koeluierende Analyten nicht unterscheidbar LC-MS Schnelle Trennung, hohe Auflösung Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, deckt nur begrenzte Anzahl an Aminosäuren ab IP-LC-MS-MS Keine Derivatisierung, große Anzahl von Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, Analyten, hohe Auflösung für polare Ionensuppression, Systemkontamination mit IP- Aminosäuren Reagens HILIC-MS Keine Derivatisierung, geringer Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, Materialverbrauch schlechte Reproduzierbarkeit, Ionensuppression CE-MS Keine Derivatisierung, geringer Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, Materialverbrauch nur geringes Injektionsvolumen GC-MS Robust, hohe Reproduzierbarkeit, hohe Derivatisierung notwendig, nicht geeignet für Auflösung, schnelle Trennung thermolabile Analyten aTRAQ-LC- Schnelle Trennung, interner Standard für Proteinabtrennung notwendig bei freien Aminosäuren, MS-MS alle Analyten schlechte Ausbeute für schwefelhaltige Aminosäuren, schlecht automatisierbar Direktinfusions- Keine Trennung notwendig, extrem hoher Extraktion und Derivatisierung der Aminosäuren MS-MS Durchsatz notwendig, isobare Aminosäuren nicht unterscheidbar  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kapitel 8. Proteinsequenzanalyse- N-terminale oder C-terminale Sequenzanalyse  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden N-terminale Sequenzanalyse: Edman-Abbau 1950 von Pehr Edman entwickelt zyklischer Prozess → Abspaltung der N-terminalen Aminosäure Aminosäure-Sequenzen von wenigen pmol eines Proteins möglich N-terminale Sequenzierung von nur etwa 30-40 Aminosäuren möglich Kupplung, Spaltung, und Konvertierung Grundstruktur eines Peptids  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Kupplungsreaktion Phenylisothiocyanat (PITC) kuppelt an die freie Aminosäure eines Peptids → Phenylthiocarbamoylpeptid (PTC-Peptid) entsteht  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Spaltungsreaktion des Edman-Abbaus Anilinothiazolin (ATZ)- Aminosäure  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Konvertierung  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Analyse der PTH-Aminosäuren – Identifizierung der Aminosäuren  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden Die repetitive Ausbeute ist der limitierende Faktor des Edman-Abbau…  Modul B12 (WS 2024/25) Trenn- und Analysemethoden org. Arzneistoffe inkl. bioanalytischer Methoden C-terminale Sequenzanalyse Schlack-Kumpf-Abbau Aktivierung des C-Terminus Kupplung mit Thiocyanatreagens (am besten Thiocyanatsäure HSCN) → Bildung eines Peptidylthiohydantions Abspaltung der C-terminalen Aminosäure als Aminosäurethiohydantoin Identifizierung mittels HPLC Abbau v