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Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico UNIDAD 4: TÉCNICAS DE ESTUDIO DE HIPERSENSIBILIDAD Ciclo: Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico. Módulo: Técnicas de Inmunodiagnóstico. Docente: Laura María Ros Alcobas Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico d...

Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico UNIDAD 4: TÉCNICAS DE ESTUDIO DE HIPERSENSIBILIDAD Ciclo: Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico. Módulo: Técnicas de Inmunodiagnóstico. Docente: Laura María Ros Alcobas Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 1. HIPERSENSIBILIDAD: La hipersensibilidad es otro grupo de enfermedades o trastornos en los que interviene directamente el sistema inmunitario, por lo que, su estudio es otro de los ámbitos de aplicación de las técnicas de inmunodiagnóstico. Se denomina reacción de hipersensibilidad a una respuesta inmune exagerada o inapropiada que causa lesiones hísticas. Cuando en el organismo se desencadena una respuesta inmunológica, algunos tejidos del mismo organismo pueden resultar dañados, aunque dicha respuesta inmunológica haya sido encaminada exclusivamente para acabar con el organismo invasor que ha provocado el inicio de dicha respuesta inmunológica. 1.1 CLASIFICACIÓN DE LAS REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD: Dependiendo de los componentes del sistema inmunitario responsable de la respuesta de hipersensibilidad, se distingue entre: • Reacciones mediadas por anticuerpos → estas reacciones están mediadas por inmunoglobulinas. • Reacciones mediadas por células → se ponen en marcha por la acción de linfocitos T. Si se tiene en cuenta el tiempo que tarda en producirse la respuesta, las reacciones se pueden agrupar en: • Reacciones de hipersensibilidad inmediata → se desarrollan en menos de una hora desde el contacto con el alérgeno. Estas reacciones están mediadas por IgE y se conocen como alergias. • Reacciones de hipersensibilidad retardada → se desarrollan varias horas después del contacto con el alérgeno, generalmente más de 12 horas. Las desencadenan los linfocitos T activados. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Teniendo en cuenta estos criterios, se establece una clasificación de cuatro tipos de reacciones de hipersensibilidad: ➢ HIPERSENSIBILIDAD TIPO I: La reacción de hipersensibilidad tipo I, inmediata o anafiláctica está mediada por IgE que va a presentarse unida a la superficie de los basófilos y de los mastocitos. Esta reacción de hipersensibilidad se produce en dos etapas: la sensibilización y el desencadenamiento: 1. La sensibilización: En el primer contacto con un alérgeno la persona no experimenta ninguna manifestación clínica, pero en su organismo se producen cambios que van a desencadenar una síntesis exagerada de IgE. Entre el contacto con un alérgeno y la síntesis de anticuerpos transcurre un periodo de varios días o incluso semanas. Para se produzca la síntesis es necesaria la colaboración entre los linfocitos T y los B. Gracias a los linfocitos Th2 se producen citoquinas, predominantemente IL-4 e IL-5 que dirigen el cambio de clase a IgE. Mientras ocurren estos procesos, el antígeno (alérgeno) que los ha inducido puede haber desaparecido. A pesar de ello, las moléculas de IgE no desaparecen, sino que se unen por su fragmento Fc a los receptores específicos de alta afinidad para IgE que hay sobre los mastocitos y basófilos. De esta forma, ambos quedan sensibilizados frente al alérgeno. Una vez que ha comenzado, la síntesis de IgE persiste durante meses o incluso años, por lo que los mastocitos y basófilos se mantienen preparados (sensibilizados) para reaccionar rápidamente cuando se produzca el próximo contacto con ese alergeno. 2. El desencadenamiento: En los contactos posteriores, el alérgeno se unirá a la IgE ligada sobre los mastocitos, formando puentes que unen y entrecruzan a dos o más moléculas de IgE. Esto lleva a la agregación de los receptores, a la activación y a la degranulación celular, con la liberación de distintos mediadores. Los mediadores de la respuesta alérgica son los responsables de los síntomas alérgicos. Los liberan mastocitos y basófilos, pero también neutrófilos, eosinófilos y plaquetas. Los principales mediadores son la histamina, la triptasa, factores que atraen otras células, los leucotrienos, el factor activador de plaquetas y las prostaglandinas. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Los mediadores pueden ser: • Preformados: están almacenados en los gránulos. Se trata, fundamentalmente de histamina. • De nueva síntesis: Se sintetizan cuando se produce la unión Ag-Ac y la activación de la célula. Destacan el factor de agregación plaquetaria, las prostaglandinas y los leucotrienos. La liberación brusca y masiva de todos estos mediadores provoca el proceso inflamatorio responsable de las alteraciones clínicas que se observan en la reacción alérgica. Dependiendo del alergeno, de la via de entrada, etc. las manifestaciones serán unas u otras; erupción cutánea, rinitis, asma, etc. Imagen 1. Reacción de hipersensibilidad tipo I (alergia). Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Tabla 1. Procesos alérgicos mediados por IgE. ➢ HIPERSENSIBILIDAD TIPO II: La hipersensibilidad tipo II o citotóxica está mediada por IgG e IgM que se unen a antígenos, propios o externos, fijados sobre células propias. Esta unión hace que el sistema inmunitario “ataque” a las células que presentan esos antígenos causando la lisis y la muerte celular. Este tipo de reacciones pueden ser responsables de diversas enfermedades autoinmunes, y también de reacciones de hipersensibilidad frente a medicamentos y otras sustancias capaces de fijarse a las membranas de las células propias. En este caso, el daño puede ocurrir mediante: o La citotoxicidad celular dependiente de Ac, como ocurre en la lisis de las células tumorales de los parásitos. o La unión y activación del Complemento, como se da en la hemólisis inmune. o La interferencia con funciones celulares por parte de los Anticuerpos, como es el caso ya descrito en la unidad anterior, de los autoanticuerpos frente a la acetilcolina que se da en la Miastenia gravis. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico ➢ HIPERSENSIBILIDAD TIPO III: La hipersensibilidad de tipo III está mediada por inmunocomplejos. Se forman agregados de IgG e IgM con los antígenos. Estos agregados o inmunocomplejos, debido a su gran tamaño, no pueden ser eliminados y se depositan en los tejidos, donde disparan una respuesta inmunitaria fundamentada en la vía clásica de activación del complemento. Esta activación del complemento es la responsable del daño tisular. Algunos ejemplis de este tipo de reacciones son la enfermedad del suero o la reacción de Arthus. ➢ HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV: La hipersensibilidad de tipo IV o retardada está mediada por células. Como ya se ha explicado, la respuesta en este caso no es inmediata, sino que tarda más de 12 horas en producirse (generalmente entre 2-3 días). La hipersensibilidad se pone en marcha por la acción de los linfocitos T específicamente sensibilizados, y puede llevar a la destrucción de las células afectadas por linfocitos citotóxicos o a su aislamiento por acción de linfocitos colaboradores, que inducen la formación de granulomas. Entre las manifestaciones destacan: • Dermatitis por contacto: se induce por un compuesto químico reactivo (hapteno) que, tras acoplarse a proteínas epidérmicas, actúa como un inmunógeno efectivo. • Reacciones granulomatosas: los granulomas son lesiones resultantes de agregados de fagocitos mononucleares activados (principalmente macrófagos), muchos de los cuales han fagocitado al agente responsable. Este tipo de hipersensibilidad también se presenta en algunas reacciones adversas a medicamentos y en el rechazo a transplantes. Depende de la funcionalidad de las Células T CD4+ o de las Células T CD8+. Se trata de la base de la reacción inmunológica que se da frente a bacterias, virus, hongos, microbios intracelulares como las mycobacterias, parásitos y protozoos. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 2. TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ALERGIAS: Las alergias, reacciones de hipersensibilidad de tipo I o anafilácticas están mediadas por IgE. Por tanto, el diagnóstico se basa en la determinación de este tipo de inmunoglobulina. La IgE es el isotipo de inmunoglobulina que se encuentra en menor concentración en el suero, por lo que es necesario utilizar métodos muy sensibles para su cuantificación. 2.1 Pruebas in vitro: De manera general, las técnicas detección de IgE específica in vitro utilizan alergenos unidos a soportes sólidos (tubos, esferas, discos, placas, etc.) A los que se unen los anticuerpos específicos. Posteriormente, se añade un anticuerpo dirigido contra la cadena épsilon de la IgE conjugado con un marcador apropiado (radioisótopos, enzimas o fluorocromos). Las primeras pruebas in vitro, para la detección se utilizaron IgE conjugados con radiomarcadores. Posteriormente, los radioinmunoensayos fueron desplazados por otras técnicas que usan reactivos de detección conjugados con enzimas y/o fluorocromos. El método más utilizado es el CAP IgE. Actualmente, se suele llevar a cabo mediante la técnica comercial FEIA (fluoro-enzimo-inmunoensayo). ➢ DETERMINACIÓN DE IgE TOTAL: Los niveles de IgE total se encuentran elevados en las alergias, pero también en las enfermedades producidas por parásitos. Así, niveles elevados de IgE en ausencia de parasitosis sugieren una elevada probabilidad de alergia. Para su determinación existen diversos métodos. Todos se basan en la utilización de un anticuerpo especifico de la cadena épsilon de la IgE. ➢ Radioinmunoensayos: Los primeros métodos desarrollados para la determinación de IgE utilizaban isótopos radioactivos para el revelado de la reacción. Es el caso, por ejemplo, del RIST (Radio Immuno Sorben Test). ➢ Enzimoinmunoensayos: Posteriormente, la introducción de estas técnicas desplazó a los radioinmunoensayos. En estos casos, se suministran unos tubos de plástico recubiertos covalentemente con un anticuerpo monoclonal anticadena épsilon humada, que captura la IgE presente en la muestra problema. Para detectar la IgE se utiliza otro Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico anticuerpo monoclonal de especificidad diferente al anterior y conjugado con fosfatasa alcalina. ➢ InmunoCAP: Actualmente es la técnica de elección para la determinación de IgE, diseñado como un inmunoanálisis en sándwich. Tiene una sensibilidad extremadamente alta, que consigue gracias a la utilización de un derivado de celulosa dentro de una capsula Consiste en un polímero hidrófilo altamente ramificado que proporciona un microambiente ideal para las proteínas, uniéndolas de manera reversible y manteniendo su estructura original. Tiene la ventaja de que necesita una cantidad muy pequeña de muestra: solo 40 ul de suero o plasma. Una vez terminada la técnica se mide la fluorescencia que será directamente proporcional a la concentración de IgE en la muestra de suero. Videos recomendados: https://www.youtube.com/watch?v=jCBJGlpZVqo https://www.youtube.com/watch?v=rmzSKiDV3Ys Inconvenientes: Se trata de una técnica que es de poca utilidad cuando es empleada en niños y en pacientes de más edad, siendo de una especificidad muy limitada a la hora de llegar a un diagnóstico certero. Además, si se obtiene un valor normal de IgE en suero, no se puede deducir que no exista una alergia. Se ha venido usando hasta ahora porque puede suponer una llamada de atención al/a especialista, que puede alertar sobre la posibilidad real de la existencia de dicha patología. ➢ DETERMINACIÓN DE IgE ESPECÍFICA: La determinación de IgE específica de un alérgeno particular es necesaria para el diagnostico de la alergia y para el establecimiento del tratamiento y la recomendación al paciente de las medidas profilácticas más adecuadas. Los valores de IgE específica se distribuyen en clases, pero es recomendable disponer del valor absoluto, ya que las clases agrupan valores muy dispersos. Para la determinación de la IgE específicas existen baterías o paneles de alergenos disponibles para la realización de pruebas tanto in vitro como in vivo. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Tabla 2. Distribución de los valores de IgE específica en clases. Estas pruebas comenzaron a desarrollarse en el año 1967 y se trataban de unas pruebas de RAST (análisis para la detección de IgE en sangre). Para desarrollarlas, se acoplaba de forma covalente, el alérgeno con una celulosa activada mediante bromuro de cianógeno y se conseguía obtener una prueba que era semicuantitativa. Posteriormente se mejoraron las primeras pruebas RAST y aparecieron las pruebas denominadas “pruebas de segunda generación”, que han adquirido una mayor calidad en los alérgenos empleados y en las matrices usadas, dando lugar a unas pruebas que son ya cuantitativas. Actualmente, dichas pruebas han vuelto a mejorase y están automatizadas completamente, denominándose pruebas de tercera generación. Se comercializan mayormente las pruebas Phadia , UniCAP y Siemens Immulite System. • Producción de alérgenos para las pruebas in vitro: Las técnicas in vitro para la determinación de las enfermedades alérgicas dependerán directamente de la capacidad que tengamos a la hora de demostrar la posible presencia de anticuerpos IgE específicos dirigidos frente a un alérgeno concreto. Para ello, vamos a necesitar alérgenos en su forma nativa. En este tipo de técnicas, la calidad de los antígenos empleados es determinante a la hora de determinar la especificidad de los anticuerpos IgE. Inicialmente se empleaban sustratos crudos o que se habían purificado, obtenidos directamente de las fuentes de los alérgenos. Actualmente, gracias a los avances en este campo que han permitido mejorar la calidad de material alergénico usado, se puede llegar a determinar cuál es Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico el alérgeno concreto que produce la reacción alérgica en el paciente, que desencadenan la enfermedad. Esto se ha definido como diagnóstico de componentes resueltos (DCR). Para ello, deberemos llevar a cabo la purificación y la caracterización de un alérgeno específico mediante la combinación de métodos analíticos, con procedimientos inmunoquímicos y biológicos. Los extractos acuosos van a ser sometidos a diferentes procedimientos cromatográficos con la idea de poder obtener una cantidad suficiente de material que haya sido separado de una forma minuciosa. Cuando ya se tiene identificado el alérgeno, lo siguiente será clonar el gen, secuenciarlo posteriormente y poder producir alérgenos recombinantes en cantidades ilimitadas. La identificación de alérgenos específicos, además del desarrollo de las técnicas de ADN recombinante, han permitido obtener grandes cantidades de alérgenos específicos para su uso en las pruebas in vitro. La producción de alérgenos recombinantes nos obliga a tener unas condiciones de cultivo, unos sistemas de expresión y unos procesos de purificación adecuados y muy desarrollados. Además, deberemos conocer características muy específicas tales como la posibilidad de la existencia de enlaces disulfuro, saber cuál es el estado de la glucosilación o la estabilidad global de la proteína. Como hospedador para aquellas proteínas no glucosiladas, podremos usar a la Escherichia coli. En el caso de que estemos buscando reproducir proteínas glucosiladas, podremos usar varios sistemas de expresión eucariotas, como es el caso de la levadura Pichia pastoris. 2.2 Pruebas in vivo: Son las pruebas de provocación in vivo y se pueden considerar como el segundo nivel de confirmación de una determinada enfermedad alérgica. Si se trata de una prueba cutánea se va a requerir la aplicación de un determinado extracto del alérgeno en la piel, para lo que se puede llevar a cabo una punción o se puede llevar a cabo una inyección intradérmica. Su utilidad dependerá de la naturaleza del alérgeno. Así, para aquellos alérgenos que se introducen en el organismo a través de la inhalación, las pruebas cutáneas van a ser muy precisas. Ocurre todo lo contrario con aquellos alérgenos que provocan alergias alimentarias, o en aquellos casos en los que se quiere determinar la sensibilidad a determinados fármacos, o en el caso de querer determinar la alergia al látex. Vamos a detallar como se llevan a cabo los métodos de punción y el método intradérmico. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Método de punción Es la prueba alérgica mas usada con diferencia, conocida también como Prick-test o test por punción. Es una prueba rápida, sencilla, de elevada especificidad y sensibilidad, de alta fiabilidad y bajo coste, que resulta muy útil para confirmar una sospecha diagnóstica de alergia. Se basa en exponer a la persona a extractos alergénicos ricos en proteínas y observar si se produce una reacción cutánea. Para desarrollar el método de punción, tendremos que desarrollar los siguientes pasos: 1. Colocaremos una gota de una disolución que contiene el alérgeno en la parte anterior del antebrazo del paciente que se está estudiando. 2. Para introducir el alérgeno en la epidermis de dicho paciente, realizamos una punción a través de la gota, empleando una aguja de 8 mm con el bisel hacia arriba. 3. Después de dicha punción, vamos a eliminar el exceso del líquido con una gasa o papel. 4. Esperamos entre 15 y 20 minutos para observar si existe una reacción tipo roncha o eritema, que sería el momento en el que se alcanza el diámetro máximo. En el desarrollo de estas pruebas, haremos tanto controles positivos con histamina, como controles negativos mediante el empleo de suero fisiológico; dichos controles irán en paralelo a las pruebas con los alérgenos. Método intradérmico Con este término se incluyen una serie enfermedades que tienen en este caso: 1. Suministramos el alérgeno de forma intracutánea mediante el empleo de una aguja de 8 mm, con la que vamos a inyectar la disolución que contiene dicho alérgeno. 2. La inyección suele ser de unos 0,02 ml y suele presentar una reacción de entre 2 y 3 mm de diámetro. 3. La prueba se suele leer a los 15 o 20 minutos. 2.3 Diagnóstico por micromatrices: Esta técnica nos permite llevar a cabo la medida simultánea de anticuerpos IgE que presentan una gran cantidad de especificidades con la misma muestra de suero, ya que las pruebas de IgE específicas se han diseñado como análisis de un solo alérgeno. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Para ello: 1. Depositamos uniformemente, mediante el empleo de un robot, pequeñas cantidades (entorno a los 10 nl) de mezclas purificadas o crudas de proteínas alergénicas en chips de silicio activados. 2. La matriz nos va a permitir unir miles de alérgenos por lo que sólo vamos a necesitar cantidades muy pequeñas de suero para poder determinar las IgE de muchas especificidades alergénicas. 3. Después, vamos a emplear IgE antihumana marcada con biotina y estreptavidina conjugada con Cy3, para detectar los anticuerpos IgE humanos unidos al chip y escaneamos. 2.4 Test de activación de basófilos (TAB) por citometría de flujo: Es una técnica diagnóstica de laboratorio para detectar sensibilización. Se basa en la medición del porcentaje de basófilos que se activan en contacto con el alérgeno. Los basófilos en condiciones normales no se encuentran en los tejidos, solo migran a estos cuando se produce una reacción inflamatoria. Existe una proteína, CD63, que se expresa en la superficie de los basófilos cuando se activa. Por tanto, el TAB mide esta proteína mediante citometría de flujo, tras la activación in vitro de los basófilos con el alérgeno. La expresión de la CD63 está correlacionada con la degranulación. Se realiza con muestras de sangre periférica completa o tras el aislamiento previo de los leucocitos. Procedimiento: 1. Estimulación y degranulación: los basófilos se incuban con diferentes concentraciones de alergenos a testar durante un periodo de 15-20 min a 37ºc. 2. Marcaja con anticuerpos fluorescentes: Se pueden utilizar anticuerpos marcados con fluoresceína para detectar los basófilos sensibilizados y ancuerpos anti-CD63 marcados con ficoeritrina para detectar los basófilos activados. 3. Lisis y fijación celulara: Eliminación de los glóbulos rojos y fijación del resto de células sanguíneas. 4. Adquisición en el citómetro de flujo. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Indicaciones: • Alergia a inhalantes (polén, casa de animales, ácaros de polvo o mohos). • Alergias alimentarias. • Alergias al látex. • Alergias himenópteros (insectos). • Alergias a medicamentos. 3. EVALUACIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA: La hipersensibilidad retardada es aquella que está ligada a la funcionalidad de las Células T CD4+ o de las Células T CD8+. Además, la base de la reacción inmunológica que se va a presentar frente a: • Virus. • Bacterias. • Hongos. • Mycobacterias. • Parásitos. • Protozoos. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Para ello, vamos a recordar que las células T van a presentar diferentes subtipos que, además, presentan diferentes funciones. Así, los principales tipos de Linfocitos T pueden ser: • Células CD4+: también llamadas Células Colaboradoras y que son células directamente involucradas en el inicio de las reacciones inmunológicas, intervienen en la secreción de las citocinas y producen un aumento de la respuesta inmunológica de las células B. • Células CD8+: son los Linfocitos T que están directamente asociados a algunas funciones citolíticas y asesinas. Este tipo de pruebas es muy empleado para poder llevar a cabo la medida de la función de las células T y nos van a permitir medir la capacidad de: • Reconocer y poder presentar el antígeno. • La capacidad de movilización de las células T. • La capacidad de poder generar una respuesta inflamatoria específica. Las pruebas pueden ser: pruebas epicutáneas e intradermorreacciones: ➢ EPICUTÁNEAS: Aplican el extracto alergénico sobre la piel para establecer el agente causante de las dermatitis de contacto. Los alérgenos responsables de este tipo de hipersensibilidad suelen ser metales (níquel, cromo, cobalto), perfumes y otros cosméticos. Los alergenos de contacto inducen reacciones de hipersensibilidad retardada mediada por linfocitos. Cuando el paciente vuelve a tener contacto con esas sustancias, se liberan los mediadores proinflamatorios causantes de los síntomas característicos de la dermatitis de contacto. • Test del parche: Se basa en exponer al paciente a diversos antígenos para detectar si se produce una respuesta cutánea. Pero existen dos diferencias importantes: - En este caso no se realiza punción, sino que se pone en contacto el alérgeno con la piel mediante la aplicación de un parche impregnado con el extracto alergénico. - La lectura es retardada, no se realiza a los 20 min sino transcurridos 48-72h. Esta prueba se aplica en el diagnostico del eczema de contacto. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico ➢ INTRADERMORREACCIONES: Aplican el alérgeno por vía intradérmica. Se utilizan para determinar si un individuo ha estado en contacto con un determinado agente infeccioso y para el seguimiento de algunas inmunodeficiencias. El alérgeno se administra por vía intradérmica, lo que se inyecta es una pequeña cantidad de un extracto del microorganismo. A las 48-72h se observa si se ha producido una reacción local de induración en la piel. 3.1 DIAGNOTICO DE TUBERCULOSIS: En la actualidad, el diagnóstico de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) mediante estudios de sensibilidad se han desarrollado como consecuencia del resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU y otros países desarrollados, además, también están presentándose cepas multirresistentes. Para ello, se recomienda que los aislamientos iniciales de todos los pacientes sean valorados y que el estudio se repita si la muestra de esputo continúa presentando un cultivo positivo tras tres meses de terapia. Para la Tuberculosis, se recomienda el estudio de los antituberculosos primarios, como son: • La isoniacida. • La rifampicina. • El etambutol. • La pirazmamida. Tras realizar estos estudios, si aún se sospecha la resistencia a algunos de estos fármacos claves para acabar con esta mycobacteria, se deben hacer una serie de pruebas adicionales de sensibilidad frente a otros antimicrobianos incluyendo: • La estreptomicina. • La etionamida. • La canamicina. • La capreomicina. • La rifabutina. • La ofloxacina. Técnicas de Inmunodiagnóstico • G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico La cicloserina. Para el diagnóstico de la tuberculosis podremos usar Pruebas cutáneas. Para ello, podríamos describir un método general de diagnóstico de la tuberculosis, aunque existen variantes: • El antígeno es obtenido de cultivo de Mycobacterium tuberculosis. • Se inocula por vía subcutánea en el antebrazo. • Si hay una respuesta positiva, se reflejará en el paciente a partir de las 8 horas. • Después de 12-24 horas de la inoculación se vuelve eritematosa y existe infiltrado. • Tras 48 horas alcanza su máximo, luego involuciona lentamente. Tenemos en cuenta que el diámetro del infiltrado es directamente proporcional cantidad de antígeno inoculado y a la hipersensibilidad del paciente. La prueba se considera positiva cuando los infiltrados de la piel superan los 10 mm de diámetro. Las pruebas cutáneas de la tuberculosis son de utilidad para identificar a pacientes infectados, pero no diferencian enfermedad activa de infección. Las personas infectadas van a desarrollar una reacción de hipersensibilidad a las proteínas de los bacilos, que es en lo que se basan los test cutáneos antes descritos, empleando un derivado proteico purificado (PPD). Dentro de los test cutáneos más extendidos, está el test de Mantoux., para el cuál: • Se inyecta intracutáneamente 5 unidades de tuberculina. • Vamos a ver los resultados de las pruebas tras 48-72 horas, midiendo el diámetro de induración en milímetros. • Para los resultados tenemos que distinguir entre pacientes con unas características inmunológicas determinadas que pueden venir de un detrimento del sistema inmunológico por otras patologías, de otros pacientes sin patologías complementarias. • Así, con pacientes con VIH, aquellas personas que han tenido un reciente contacto íntimo con personas con tuberculosis contagiosa y en aquellas con hallazgos radiológicos de lesiones residuales tuberculosas, se considera que una induración de 5 mm o mayor, la prueba resulta positiva. • Para pacientes que no cuentan con esta característica, un resultado de 10 mm o mayor es positivo. No obstante, existen otros muchos métodos para llegar a un diagnóstico certero de la infección de la tuberculosis. Entre ellos tenemos el Método de cultivo a partir de muestras clínicas, para Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico lo que se recomienda la inoculación de estas a un medio líquido y otro sólido. En general, los medios líquidos son más sensibles que los sólidos y nos aportan una mayor rapidez a la hora de dar los resultados. Se recomienda comprobar los resultados en un período de 14 días. Dentro de los medio sólidos existe una gran variedad y tenemos la posibilidad de obtenerlos en tubos de tapón de rosca y botellas de prescripción, sin olvidar que el medio de base de agar también está disponible en las placas de Petri. Todos estos cultivos deberán ser incubados a 37 º, con una atmósfera de entre el 5%-10% de CO2. No obstante, actualmente el método de diagnóstico de tuberculosis pulmonar más rápido es el uso de amplificación de ácidos nucleicos para la detección directa de M. tuberculosis en muestras clínicas. Hay que tener en cuenta que un resultado positivo a la prueba de la tuberculina no implica tuberculosis activa, sino que demuestra una exposición previa al antígeno.