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UNIDAD 1. TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENOANTICUERPO SECUNDARIAS Tania López Martínez Técnicas de Inmunodiagnóstico C. F. G. S. Laboratorio Clínico y Biomédico TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Índice -1. Introducción - 2. Características del sistema...

UNIDAD 1. TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENOANTICUERPO SECUNDARIAS Tania López Martínez Técnicas de Inmunodiagnóstico C. F. G. S. Laboratorio Clínico y Biomédico TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Índice -1. Introducción - 2. Características del sistema inmune. -3. Características de las técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias. -4. Técnicas de aglutinación:  Directas  Indirectas  Técnicas de la inhibición de la aglutinación. - 5. Técnicas de precipitación:   En medio líquido: - inmunoturbidimetría - inmunonefelometría. - Inmuno-electroforesis, - Inmunofijación. - Técnicas de inmunodifusión En gel: - 6. Técnicas de fijación del complemento. - 7. Reacciones de neutralización 1 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico 1. INTRODUCCIÓN El sistema inmunológico es un sistema muy complejo formado por órganos, tejidos, células y moléculas que interaccionan, en un complejo entramado de reacciones originando la respuesta inmune cuando el organismo es atacado desde el exterior. La inmunidad es un estado defensivo del organismo provocado por la acción del sistema inmunitario que neutraliza o evita el desarrollo de una enfermedad. Su acción errónea puede provocar enfermedades autoinmunes. En esta unidad vamos a estudiar el sistema inmune y las técnicas basadas en reacciones antígeno anticuerpo secundarias. Estas técnicas, tan importantes en el diagnóstico de enfermedades, han sido desarrolladas gracias al conocimiento del sistema inmune y su funcionamiento. La unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interacción reversible en la que están involucrados enlaces no covalentes. En la interacción in vitro de un antígeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se distinguen dos etapas, la interacción primaria no visualizable y la interacción secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la aglutinación o la precipitación. Por otro lado, no siempre que se produce la interacción primaria AgAc, se produce la interacción secundaria, ya que, para conseguir fenómenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y características de los Ags y Acs. 2. CARACTERÍSTICAS DEL SISTEMA INMUNE El sistema inmune está formando por órganos, tejidos, células y moléculas. Llevará a cabo la respuesta inmunitaria. Órganos del sistema inmune Los órganos linfoides se clasifican en primarios y secundarios: Los órganos linfoides primarios son aquellos que proporcionan microambientes apropiados para el 2 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico desarrollo y maduración de los linfocitos. Son la médula ósea y el timo. En el timo vamos a encontrar sobre todo Linfocitos T, mientras que en los Linfocitos B se localizarán sobre todo en la médula ósea. La MÉDULA ÓSEA es el lugar en el que se producen todas las células sanguíneas mediante el proceso de hematopoyésis gracias a las CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS (CMH). Estas células tienen la capacidad de autorenovarse y de diferenciarse, en primer lugar en dos grandes células progenitoras que marcan dos grandes familias de células: 1. Línea mieloide: de la que provienen los granulocitos, las plaquetas, los eritrocitos y los monocitos y macrófagos. 2. Línea linfoide: de la que provienen los linfocitos T y B y las células NK (Natural Killer o células asesinas). Los linfocitos inmaduros que se generan en la hematopoyésis maduran y adquieren una especificidad antigénica particular dentro de los órganos linfoides primarios. Sólo después de que los linfocitos maduren dentro de un órgano linfoide primario, son inmunitariamente competentes (capaces de desencadenar una reacción inmunitaria). Las células T lo hacen en el timo y las células B, en la médula ósea. 3 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Los órganos linfoides secundarios son el bazo, los ganglios linfáticos y el tejido linfático asociado a mucosas. Son aquellos en los que se atrapan los antígenos e interactúan con los linfocitos. Es decir, en ellos se da el encuentro entre los linfocitos y los antígenos que es el inicio de la respuesta inmune. En los órganos linfoides secundarios vamos a encontrar poblaciones celulares tanto de linfocitos T como de linfocitos B. 4 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Células del sistema inmune Las células del sistema inmune se forman a partir de células madre pluripotenteciales presentes en la médula ósea a través de un proceso llamado hematopoyesis. Fig. Hematopoyesis Células mieloides Las células derivadas del linaje mieloide son las plaquetas, eritrocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, mastocitos, monocitos, macrófagos y células dendríticas. En la médula ósea, las células hematopoyéticas y sus descendientes crecen, se diferencian y maduran dirigidos por factores de crecimiento y diferenciación (citocinas). Esta diferenciación ocurre mediante una serie de poblaciones precursoras intermedias que a su vez se van diferenciado cada vez más hasta la última célula de la descendencia. Las células de este linaje participan en la Respuesta Inmunitaria Innata. 5 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Las plaquetas participan principalmente en los procesos de coagulación sanguínea cuando existe un daño. La coagulación evita la pérdida de sangre pero también bloquea el paso de antígenos a tejidos más profundos. Las plaquetas también liberan citocinas (moléculas de comunicación celular) durante elproceso inflamatorio. Los eritrocitos tienen un papel central en el sistema circulatorio hasta los tejidos. También tienen receptores en su superficie que les permiten capturar complejos antígeno-anticuerpo que estén en la sangre y transportarlos al bazo para eliminarlos mediante fagocitosis por los macrófagos. Los neutrófilos pertenecen a una categoría llamada granulocito debido a que vistos en el microscopio parece tener unos gránulos en su citoplasma. Estos gránulos son vesículas cargadas con componentes necesarios para combatir a los antígenos, como por ejemplo enzimas digestivas. Los neutrófilos representan una línea de defensa muy importante frente a infecciones bacterianas y de hongos. Los basófilos también son células del sistema inmune del tipo granulocito. Son los responsables dedesencadenar los procesos de alergia, participa en la inflamación. 6 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Los eosinófilos son granulocito que participan en la defensa contra parásitos. Los mastocitos son las principales células que coordinan la inflamación. Son del tipo granulocito, se encuentran en los tejidos cerca de vasos capilares y producen histamina (principal molécula moduladorade la inflamación). Los monocitos son células que se encuentran en el torrente sanguíneo y que migran a los tejidos cuando se detectan antígenos. Una vez fuera de los capilares se diferencian a macrófagos para eliminar a los agentes extraños. Los macrófagos son células relativamente grandes, destruyen a los antígenos mediante fagocitosis. Representan una línea de defensa importante frente a infecciones causadas por bacterias, virus, hongos y parásitos. También participan en la regulación del proceso inflamatorio y son capaces de atacar y destruir a células cancerígenas. 7 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Las células dendríticas también destruyen antígenos mediante fagocitosis, se localizan en los tejidos realizando un "patrullaje" buscando antígenos que deban ser eliminados. Una vez que localizan antígenos, los fagocitan para destruirlos y una parte la procesan para "presentársela" a los Linfocitos T ubicados en los ganglios linfáticos para que pueda activarse una respuesta inmune adaptativa. Células linfoides Las células derivadas del linaje linfoide son los linfocitos B, linfocitos T y células NK (del inglés Natural Killer). Los linfocitos B y T pertenecen al Sistema Inmunitario Adaptativo mientras que las células NK pertenecen al S.I. Innato. Al MO son indistinguibles pero en superficie tienen distintos marcadores y receptores. Linfocitos B: Participan en la respuesta inmunitaria adquirida o específica de tipo humoral. Se crean en la médula ósea, además maduran en dicha médula con un proceso de diferenciación que no depende del antígeno. Cuando son maduros se identifican porque en su membrana se encuentra la IgM, un tipo de inmunoglobulina, que forma parte del BCR (receptor de membrana de células B capaz de reconocer al Ag directamente). Las inmunoglobulinas son proteínas con capacidad de reconocer de forma específica otras moléculasextrañas del organismo. Las inmunoglobulinas intervienen en el sistema inmunitario de dos formas. 8 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico “Como parte del BCR,” está presente en la membrana del linfocito B y reconoce antígenos. Como moléculas circulantes, denominándose entonces anticuerpos, Ac o Ab (en inglés). Los anticuerpos son secretados por las células plasmáticas en respuesta al contacto con un antígeno, reaccionan específicamente contra él. La estructura de las inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas son glucoproteínas. Estáncompuestas por subunidades o monómeros, algunas de las inmunoglobulinas están compuestas por una sola unidad, aunque otras, como el caso de la IgA, estarán formadas por dos monómeros o unidades estructurales básicas. Cada monómero está compuesto por cuatro cadenas polipéptidicas. Estas cadenas pueden ser de dos tipos: • Cadenas pesadas o cadenas H: Son polipéptidos de alto peso molecular. La secuencia de aminoácidos será la que determine la existencia de clases y subclases de inmunoglobulinas (M, G, D, E yA). 9 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO • C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Cadenas ligeras o cadenas L: son cadenas de bajo peso molecular.En este caso, las cadenas ligeras son iguales en todos los tipos de inmunoglobulinas. Dominios estructurales de las inmunoglobulinas Si analizamos con detalle a las cadenas pesadas, veremos que existe una zona con pocos aminoácidos llamada zona Bisagra que presenta una gran flexibilidad y permite el movimiento de la inmunoglobulina,facilitándose la unión con el antígeno. Las funciones de las inmunoglobulinas consisten básicamente en el reconocimiento específico del antígeno, tras el cual, se van a iniciar una serie de procesos del sistema inmunológico que p e rsiguen acabar con dicho antígeno. Además, también llevan a cabo la interacción con otros elementos del sistema inmunológico como puede ser el sistema del complemento (moléculas plasmáticas implicadas en la respuesta inflamatoria, lisis o en la fagocitosis), los fagocitos, mastocitos y/o basófilos. 10 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Linfocitos T: Participan en la respuesta inmunitaria adquirida o específica de tipo celular. Se van originar en la médula ósea, pasando al sistema circulatorio y alcanzando, así, el timo.En el timo dónde van a sufrir una diferenciación es dónde adquieren unos marcadores de superficie, denominados CD, que se van a ir modificando en función del antígeno que tengan en frente. Cuando este receptor se vuelve específico para el antígeno se denomina TCR y hace que ese Linfocito Tse vuelva específico para ese antígeno. Una vez estimulado dicho linfocito T, éste activará a otro tipo de linfocitos para desencadenar la respuesta inmunológica. Los Linfocitos T se clasifican en:  Linfocitos T colaboradores o TH (helper)  Linfocitos T citotóxicos o Linfocitos TC TIPOS DE RESPUESTA INMUNITARIA En el Sistema Inmunológico podemos diferenciar: - Respuesta inmunitaria innata o inespecífica. Está mediada por barreras, factores químicos y células de carácter inespecífico. Entre las barreras físicas se encuentra: • PIEL, que además de ser una barrera física tiene un ph ácido que impide el desarrollo de algunos 11 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico microorganismos. • MUCOSAS: es la primera capa de tejido epitelial y conjuntivo que recubre los conductos y tubos de nuestro organismo. Sus células fabrican moco que atrapan a los organismos invasores. • BARRERAS FISIOLÓGICAS, como el aumento de temperatura. Las sustancias químicas inespecíficas que confieren protección como la lisozima que actúa sobre bacterias. Los fagocitos (macrófagos, monocitos, neutrófilos) y otros leucocitos como los basófilos y eosinófilos son las células de defensa de la respuesta innata que se encargan de la endocitosis de los antígenos y de su futura digestión. Por último, la respuesta inflamatoria también es un mecanismo de defensa inespecífico. Se basa en proteínas séricas y en la migración de los fagocitos al área afectada. Respuesta inmunitaria adquirida o específica. Intervienen linfocitos T y B, hay reconocimiento específico de antígenos. Existen microorganismos que escapan al control de los fagocitos. Para poder enfrentarse con estos "invasores", la evolución ha desarrollado en los vertebrados, y principalmente en los mamíferos, una barrera defensiva adicional, los linfocitos. En la inmunidad específica se dan dos tipos de respuesta: A. Inmunidad específica humoral (mediada por anticuerpos) La unión entre el antígeno (Ag) y el anticuerpo específico (Ac) provoca: Opsonización (recubrimiento) de los fagocitos con complejos Ag-Ac, lo cual facilita la fagocitosis; Neutralización directa de ciertas toxinas y virus por la simple unión Ag-Ac. 12 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Estos efectos son formas que tiene el sistema específico de "aprovechar" elementos del sistema de inmunidad innata, mediante los cuales determinados elementos de este sistema inespecífico son "encarrilados" mediante los anticuerpos (que son específicos) hacia el foco de la infección de un determinado microorganismo, para su eliminación. Los Ac están producidos por las células plasmáticas, diferenciadas a partir de los linfocitos B. Los Ag son las moléculas del microorganismo o partícula extaña que reaccionan con los Ac. Son los Ag los que seleccionan el Ac específico que les hará frente. Sin embargo, cada tipo de Ac está preformado antes de entrar en contacto por primera vez con el Ag. Cada linfocito B que se diferencia en la médula ósea está programado genéticamente para sintetizar un solo tipo de Ac, a la espera de contactar con el Ag específico. Tras su primer contacto con el Ag específico, cada linfocito B se multiplica y diferencia hasta dar un clon de células plasmáticas, que fabrican y excretan grandes cantidades del Ac específico para el que estaba programado el linfocito original. En cada individuo existen cientos de miles, o millones de tipos de linfocitos B, cada uno preparado para originar un clon productor del correspondiente Ac. La respuesta de formación de Ac provocada tras el primer contacto de cada Ag con el linfocito B se llama respuesta primaria. Este primer contacto confiere al individuo una memoria 13 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico inmunológica, de forma que el cuerpo se encuentra preparado para afrontar la eventualidad de una segunda infección por el mismo agente. En la respuesta secundaria la formación de Ac es más rápida y más intensa. Ello se debe a que a partir del linfocito primario que tuvo el primer contacto, aparte del clon de células plasmáticas (responsable de la respuesta primaria), se generó en paralelo otro clon de células B de memoria: cuando el Ag entre por segunda vez, hay en el cuerpo más células preparadas que las que encontró en la primera ocasión. Además, estos linfocitos cebados de memoria necesitan menos divisiones celulares antes de poder diferenciarse a su vez en células plasmáticas productoras de Ac. La memoria inmunológica es específica para cada antígeno. Su base es que cada anticuerpo reconoce un solo antígeno (aún más: como veremos, reconocen porciones concretas de cada antígeno, denominadas epitopos). Cómo puede el organismo reconocer tan específicamente moléculas "extrañas", a las que ataca, y discriminarlas respecto de sus propias moléculas, a las que respeta. El cuerpo desarrolla ontogenéticamente un sistema para distinguir lo propio y evitar reaccionar contra él. Cuando el sistema linfoide se está desarrollando van llegando a él componentes 14 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico circulantes de las moléculas de las distintas partes del cuerpo; así, el sistema inmune "aprende" a reconocer a estos componentes, y se provoca una incapacidad permanente para reaccionar contra ellos (se "suprimen" o inactivan los clones de linfocitos que reconocen "lo propio"). B. Inmunidad específica celular (mediada por células). Aunque ambas están relacionadas. La inmunidad celular es la otra rama de la inmunidad específica, puesto que, la inmunidad humoral, por sí misma, sería de poca utilidad frente a patógenos intracelulares, bien sea los estrictos (virus) o facultativos (como los Mycobacterium o muchos protozoos, como las Leishmania). Para ello ha evolucionado un sistema de inmunidad celular, que está mediado por linfocitos T, parecidos citológicamente a los B, pero que se diferencian en el timo. Los linfocitos T reconocen al Ag extraño siempre que esté situado sobre la superficie de células del propio organismo hospedador. Pero no pueden reconocer al Ag por sí solo, sino que éste ha de estar en combinación con una molécula marcadora de la superficie celular, que le "dice" al linfocito que está en contacto con una célula "enferma". El receptor de los linfocitos T (TCR) es diferente a los de linfocitos B, aunque ambos comparten algunos rasgos estructurales. Las moléculas marcadoras de superficie pertenecen al llamado sistema principal de histocompatibilidad (MHC, de "Major Histocompatibility Complex"). Los linfocitos T, al igual que los B, se seleccionan y se activan combinándose con el antígeno (aunque necesitan junto a él moléculas MHC), lo que provoca su expansión clonal. Funcionalmente, existen dos tipos de linfocitos T: linfocitos T citototóxicos (TC); linfocitos T colaboradores ("helper") (TH); Los linfocitos T citotóxicos son los principales efectores de la inmunidad específica celular: destruyen células del propio organismo infectadas por virus. En el cuerpo existe multitud de 15 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico clones distintos de TC, cada uno de los cuales posee en su superficie receptores distintos de los Ac, aunque con porciones parecidas a las de los Ac. Los linfocitos T colaboradores no tienen actividad citotóxica, sino que ocupan un papel central en el sistema inmune, activando a otras células: macrófagos, linfocitos TC y B. 3. CARACTERÍSTICAS DE LAS TÉCNICAS BASADAS EN LA INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO SECUNDARIAS. Las reacciones secundarias de los anticuerpos-antígenos, es decir, en las reacciones en las que la interacción entre el anticuerpo y el antígeno dan lugar a una manifestación visible, nos ofrecen una gran ventaja, los resultados son apreciables visualmente, si a esta situación le sumamos que se trata, de pruebas que son relativamente sencillas de realizar, favorece su amplio uso en los laboratorios clínicos. Este tipo de pruebas incluyen la precipitación y la aglutinación, en todas sus variantes. Las técnicas secundarias no valoran directamente los complejos inmunes sino que lo hacen de forma indirecta, atendiendo a los cambios físicos visibles que se producen en el medio. Reacciones de aglutinación. Se producen entre partículas que están en suspensión, elemento no soluble, generalmente es el antígeno el que está presente en la superficie de la partícula, sobre una membrana celular y se enfrenta a un anticuerpo específico. Visualizaremos un agregado por unión de las células mediante los anticuerpos. Reacciones de precipitación. Tienen lugar entre anticuerpos y partículas solubles como virus, algunas uniones antígeno-anticuerpo son complejos demasiado grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio. Visualizaremos el precipitado en el medio líquido. Fijación del complemento que utilizan los hematíes como sistema revelador. En este caso lo que se observa en el medio es la lisis de los hematíes. 16 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Seroconversión, que consiste en obtener dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, comparando el título de los anticuerpos en ambas muestras. Se dice que existe seroconversión cuando aumenta el título del anticuerpo en 4 veces en un período de entre tres o 4 semanas. En el ejemplo anterior, pasadas cuatro semanas, el título del anticuerpo pasa de 32 a 128, lo que significa que el límite en el que existe aglutinación es en una dilución de 1/128, que a efectos prácticos, quiere decir que en aumenta la cantidad de anticuerpo presente en el suero del paciente, pudiendo producir una respuesta de aglutinación con una menor concentración de suero. 4. TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles. La lectura es inmediata, a simple vista se aprecia la formación de esos agregados insolubles. La forma de visualizarlos depende del soporte sobre el que se realice la reacción. Utilizamos superficies inertes de carbón vegetal, látex, arcilla, gelatina, etcétera. - Soporte plano (portaobjetos, tarjeta), la reacción positiva implica la formación de «grumos», que son las células unidas entre sí por los anticuerpos específicos formando agregados macroscópicos. - Placa de microtitulación, el positivo se evidencia por la formación de un velo en la superficie delpocillo correspondiente. Si no hay aglutinación, los antígenos particulados sedimentan en el fondo de los pocillos, en forma de botón. La aglutinación se caracteriza porque el aglutinógeno, es decir, las moléculas que actúan como antígenos están en la superficie de membranas celulares de células o bacterias, al ser elementos de gran tamaño son insolubles. Por el contrario, las aglutininas, que serán los anticuerpos, son moléculas pequeñas y por tanto solubles. Las IgM, al ser multivalentes, tienen varios epítopos, aglutinan mejor que las IgG. Si las partículas utilizadas en la aglutinación son hematíes a la reacción la denominamos hemoaglutinación. 17 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas, es decir, indican ausencia o presencia del antígeno o semicuantitativas si se efectúan diluciones del suero y se determina el título (medida relativa de la actividad de los anticuerpos). Fig. 1 Resultado de hamaglutinación en microplaca de titulación. Fig. 2 Reacción de aglutinación en tarjeta de látex. 18 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Las células que contienen las moléculas antigénicas han de estar presente en la reacción de una forma apreciable y tiene que estar situado superficialmente, además debe poseer múltiples epítopos, es decir, varios sitios de unión al anticuerpo. Cada anticuerpo puede unirse a varios antígenos de la misma partícula, y cada uno de estos a varios anticuerpos; como consecuencia, se forma una red de antígenos y anticuerpos que provoca una aglutinación en el medio. Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente es preciso que la concentración de antígeno no sea excesiva con respecto a la del anticuerpos y viceversa, en caso contrario se verificará el llamado efecto de zona y se obtendrá un resultado falsamente negativo. Cuando existe un exceso de anticuerpos, respecto a la concentración de antígeno, no habrá aglutinación y por tanto no podremos observar el positivo, obtendremos un falso negativo Para evitar este error, conviene diluir los sueros convenientemente para alcanzar una concentración de partículas y anticuerpos equivalentes y apreciar una reacción positiva correcta. Pues bien, podremos decir que el título de ese anticuerpo es la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. Concepto de título del anticuerpo. Dependiendo de que el antígeno sea particulado (insoluble) o haya necesidad de insolubilizarlo mediante fijación sobre un soporte, existen dos tipos de reacciones de aglutinación: directa e indirecta. Ya se mencionó que las reacciones de aglutinación directa son útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentración de Ac sino que, en el mejor de los casos, será posible calcular un título de Ac. Para ello, se realiza la incubación de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag y se elige arbitrariamente como título la inversa de la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. En determinadas muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a altas concentraciones de suero) no se observe aglutinación. Este fenómeno se denomina efecto “prozona” y se debe a que en exceso de Ac se 19 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles (como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitación). En este caso, el título de Ac sigue siendo la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. Si ocurre la aglutinación, las concentraciones de Ag y Ac son proporcionales y se dice que están en la zona de “equilibrio”. Si por el contrario, hay mucho antígeno en relación con los anticuerpos tampoco tiene lugar la aglutinación, este efecto es post-zona y al igual que ocurre en la prozona, es un falso negativo pero por diferente causa. ¿Por qué ocurre esto? Si hay exceso de antígeno se bloquean los dos fragmentos Fab de la molécula de anticuerpo (paratopos) y se impide que las partículas antigénicas queden unidas entre sí. Si hay exceso de anticuerpos se bloquean todos los puntos de unión del antígeno (epítopos), de igual modo, se impide la agregación de las partículas antigénicas. Ag particulado: cantidades constante Suero: Diluciones crecientes 1/2 AGLUTINACION - Prozona 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 + + + + - TITULO: 32 Fig. 3 Cálculo del título del anticuerpo. Técnicas de aglutinación directa Las reacciones de aglutinación directa son útiles para la detección y titulación de anticuerpos en distintos fluidos biológicos. Las pruebas de aglutinación directa o activas son aquellas en las que los anticuerpos reaccionan con un antígeno presente de una forma natural en la superficie de un tipo de 20 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico células. Un ejemplo es poner en contacto hematíes del grupo B con suero anti-B. Para el análisis, se van a realizar una serie de incubaciones de diluciones seriadas de suero del paciente con unas cantidades constantes de antígeno y se define el título del anticuerpo. Las técnicas directas, tanto de aglutinación como de precipitación, se empezaron a utilizar para identificar bacterias o tipificar eritrocitos, pero debido a su simplicidad y sensibilidad se comenzaron a aplicar para la identificación de anticuerpos, para el diagnóstico de procesos infecciosos. Por su importancia y simpleza, haremos mención a la hemaglutinación directa: el antígeno a detectar está sobre la superficie de los eritrocitos. Esta técnica se aplica a la determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh. Técnicas de aglutinación indirecta A diferencia de la aglutinación directa, en esta se emplean antígenos inicialmente solubles, que hay que insolubilizar mediante fijación a un soporte sólido inerte (bolas de látex, partículas de bentonita, carbón activo o gelatina), o a una célula (eritrocitos). De este modo se conforma un antígeno particulado (partícula sensibilizada con el antígeno). Fig. 4 En la directa la célula se sensibiliza con el Ag y en la indirecta con anticuerpos. Las técnicas más habituales son: Aglutinación de látex en placa: una de las técnicas de aglutinación indirecta que más se usan. Las partículas de látex son pequeñas sobre las que se pueden unir a Ag o Ac solubles mediante interacciones hidrofóbicas entre sitios de la proteína y la superficie de las partículas. Así quedan 21 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico «sensibilizadas» y se pueden utilizar para la detección de Ac o Ag, según el caso. La técnica es cualitativa con resultado positivo o negativo, pero puede convertirse en semicuantitativa si se lleva a cabo con diluciones seriadas de un suero. Hemaglutinación indirecta (HAI): Como soporte de los antígenos se usan los hematíes inertes convenientemente tratados (Ej. Toxoplasma). Hay que destacar que no se trata de antígenos de los propios hematíes, como ocurre con la hemaglutinación directa para determinación de grupos sanguíneos, sino de los hematíes como soporte para unirles antígenos de distinta procedencia, frente a los que se buscan anticuerpos específicos. Inhibición de la hemaglutinación (IHA): Es una variante de la técnica de hemaglutinación indirecta. La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse a receptores de membrana de hematíes de mamíferos y aves, provocando su aglutinación. Fig. 5Inhibición de la hemaglutinación Esto se puede aprovechar para detectar en un suero problema anticuerpos específicos frente a esos virus o bacterias. En ausencia de anticuerpos específicos, los antígenos del patógeno provocarían la aglutinación de los eritrocitos. Por el contrario, si se incuban esos patógenos con el suero de un paciente que contenga anticuerpos específicos (frente al virus de la rubéola), los anticuerpos neutralizarían los antígenos bacterianos o víricos, inhibiendo así su capacidad para aglutinar hematíes. 22 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico La lectura es lo contrario de la de las pruebas de hemaglutinación. NEGATIVO: Velo en los pocillos. POSITIVO: Botón en el fondo del pocillo. Pruebas de Coombs (o de antiglobulina): Basadas también en reacciones de hemaglutinación. Estas pruebas usan el reactivo de Coombs, que es un antisuero animal contra globulinas humanas y que contiene, por tanto, anticuerpos frente a las inmunoglobulinas humanas. Cuando se incuba con eritrocitos lavados del paciente, el reactivo de Coombs provoca su aglutinación. Existen dos variantes de la prueba de Coombs: La prueba de Coombs directa permite la detección de anticuerpos unidos a los eritrocitos. Entresus aplicaciones está el diagnóstico de anemias autoinmunes o de anemia hemolítica en un recién nacido Rh+ hijo de una madre Rh–. La prueba de Coombs indirecta Permite la detección de inmunoglobulina anti-Rh en el suero materno para por ejemplo la detección de inmunoglobulina anti-Rh en el suero materno. 5. TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN Reacción de dos componentes, Ag multivalente y Ac específico, que por separado son solubles, precipitan cuando se unen para formar un inmunocomplejo que precipita. Al igual que sucede con las reacciones de aglutinación, es necesario trabajar con concentraciones equimoleculares de antígeno y anticuerpo en el punto de equivalencia. Esto es fácil de comprobar, mezclando concentraciones crecientes de antígeno en solución con un suero que contenga anticuerpos específicos. Técnicas de precipitación en medio líquido Las reacciones de precipitación en medio líquido se basan en medir la turbidez que produce la precipitación de inmunocomplejos en un medio líquido. La medición de la turbidez se puede realizar 23 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico mediante dos técnicas analíticas, la turbidimetría y la nefelometría, que se basan en la transmitancia o dispersión de un haz de luz respectivamente. Hablaríamos de Inmunoturbidimetría y de Inmunonefelometría. Se pueden utilizar para determinar anticuerpos, factores del complemento, proteínas de fase aguda y otras proteínas séricas. A penas se utilizan en la actualidad en el inmunodiagnóstico, ya que han sido desplazadas por las reacciones de precipitación en gel. Técnicas de precipitación en gel En la actualidad es más frecuente la utilización de un soporte semisólido que de un medio líquido. El soporte es un gel de agar o agarosa. Los componentes de la reacción se depositan en los pocillos, difunden a través del gel y en la zona donde alcanzan el punto de equivalencia, es decir, donde existen concentraciones equiparables de antígeno y anticuerpo, forman los inmunocomplejos y aparecen líneas, arcos o bandas de precipitación, que se ven a simple vista. La velocidad de difusión de un antígeno o anticuerpo en el gel depende de varios factores: - La concentración: a más elevada mayor será la difusión. - La temperatura: cuando es elevada se favorece la difusión. - El tamaño de las moléculas: la velocidad de difusión es inversamente proporcional al peso molecular.La viscosidad del medio: una viscosidad elevada hace disminuir la velocidad de difusión. Como la velocidad de difusión depende de estos factores, si se trabaja con una mezcla de diferentes anticuerpos o con una solución con diferentes proteínas antigénicas, se van a formar varias bandas de precipitación. El número de bandas de precipitación formadas representa el número de complejos antígeno-anticuerpo formados. Existen diferentes modalidades de precipitación en gel, en función de que:  Difundan por el gel uno o los dos componentes de la reacción.  La difusión sea espontánea o forzada por aplicación de un campo eléctrico. 24 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO  C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Se trate de una técnica cualitativa o cuantitativa. Las principales, que estudiaremos a continuación, son las siguientes: Inmunodifusión radial o técnica de Mancini: Se basa en la difusión libre de uno de los componentes de la reacción (antígenos o anticuerpos) por un gel que lleva incorporado el otro componente (anticuerposo antígenos). En este caso, la formación de los complejos da lugar a la formación de un anillo de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración del componente que difunde por el gel. Si en los pocillos excavados en un gel con anticuerpo incorporado se dispensa una serie de diluciones de un antígeno, se puede establecer una recta patrón, representando gráficamente el diámetro de los anillos de precipitación frente a la concentración de antígeno en cada pocillo. Este procedimiento permite conseguir una determinación cuantitativa de un antígeno en una muestra problema, dibujando la curva patrón a partir de unos controles que se ponen a difundir en el gel, paralelamente a las muestras problema, e interpolando en la curva el valor de los diámetros medidosde las muestras problema. Muestra Biológica de concentracion desconocida (Cx) Muestra patrón de concentración conocida (C) Rx Halo de C2 C1 R1 C3 R2 R3 R2 Rx2 Curva de calibración C1 C2 Cx C3 Concentración de la muestra Doble difusión o reacción de Ouchterlony: Los dos componentes de la reacción (antígeno y 25 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico anticuerpo) difunden libremente por el gel. La reacción más sencilla consiste en disponer solución de agarosa en caliente sobre un portaobjetos, extenderla y dejar que se enfríe. A continuación se excavan dos pocillos con un sacabocados, uno en cada extremo del portaobjetos, se dispensa la solución antigénica en uno de ellos y el suero en el que buscamos anticuerpos específicos en el otro. A medida que los dos componentes de la reacción van difundiendo libremente por el agar, se irá formando un gradiente de concentraciones. En el espacio entre los dos pocillos habrá una determinadazona en la que los reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, y es ahí donde se formará unprecipitado que sobre el gel se detectará como una banda blanca visible a simple vista. Aunque se trata de una técnica cualitativa, la distancia a la que se forman las bandas de precipitación nos permite deducir la estructura o la concentración relativa de los componentes de la reacción, ya quela banda se formará más próxima al pocillo que contenga el componente menos concentrado y/o de mayor tamaño molecular. Por esta razón, si enfrentamos un antígeno a diferentes diluciones de un suero que contiene anticuerpos específicos, la distancia a la que se forman las bandas de precipitación va variando en función de la concentración de anticuerpos. Es fácil efectuar la demostración experimental, con una pequeña placa de Petri cubierta con el gel de agarosa. Se excava un pocillo central, donde se coloca la solución antigénica y varios pocillos en círculo,alrededor del central, con seis diluciones crecientes del suero. El hexágono que tienden a formar las bandas resultantes de la precipitación aparece desplazado, respecto del pocillo central, hacia los pocillos que contienen la menor concentración de anticuerpos, esdecir hacia las diluciones más altas. Cuanto menor sea la concentración de la proteína (anticuerpo) que difunde por el gel, menor será la distancia que tiene que recorrer hasta encontrar la concentración equivalente (punto de equivalencia) del antígeno. Entre las aplicaciones de la doble difusión en gel están los estudios de identidad entre antígenos. Se 26 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico puede determinar la existencia o no de determinantes comunes entre antígenos estudiando las bandasde precipitación formadas: La reacción de identidad total (I), corresponde a los antígenos que comparten todos los determinantes antigénicos las bandas de precipitación se fusionan. En la reacción de no identidad (II), ningún determinante es compartido y por lo tanto son antígenos distintos. En la reacción de identidad parcial (III), hay algunos determinantes comunes y otros diferentes, siendo estos últimos los responsables de que se forme un espolón dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. 27 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico Fig. 6 Resultados de la práctica de Outcherlony Inmunoelectroforesis: Combina la separación proteica por electroforesis y la inmunodifusión. Los componentes de la mezcla se separan primero aplicando una corriente eléctrica; a continuación se lleva a cabo una difusión libre en gel de las fracciones obtenidas. Es una técnica cualitativa, cuya principal ventaja es la especificidad, puesto que la separación previa permite la obtención de arcos o bandas de precipitación exclusivamente frente a una determinada fracción antigénica. Está en desuso. 28 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico 6. TÉCNICAS DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO Estas técnicas proporcionan una medida indirecta de anticuerpos que no dan reacciones visibles. Se basan en que la formación de inmunocomplejos activa el sistema del complemento y produce complejosque lesionan las membranas de eritrocitos y otras células. EL SISTEMA DE COMPLEMENTO Está constituido por un conjunto de proteínas plasmáticas que, ante ciertos estímulos, se activan en forma de cascada. Es parte de la inmunidad innata, aunque uno de sus mecanismos de activación (la víaclásica) requiere la participación de anticuerpos y, por tanto, supone que se ha puesto en marcha la respuesta específica. REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO La lisis de membranas celulares por el complemento es una de las consecuencias de su activación. La víaclásica comienza con la unión de antígenos de membrana a anticuerpos específicos, a los que se 29 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico une el complemento y termina con la formación de numerosos poros en esa membrana y la consecuente lisis de esa célula. Esta reacción se puede utilizar para medir niveles de anticuerpos en el suero. El fundamento es la utilización como «sistema revelador» de eritrocitos y anticuerpos frente a esos eritrocitos (hemolisinas). La fijación de complemento es una técnica que se aplica a la detección de anticuerpos en un suero, utilizando el correspondiente antígeno, como reactivo «conocido» de la reacción. El procedimiento básico es el siguiente: Se inactiva el complemento del suero problema calentándolo a 56 ºC durante 30 min. Se añade una cantidad conocida del suero a una cantidad de antígeno conocida. Si hay anticuerpos, se formarán los correspondientes inmunocomplejos. Se añade complemento. En caso de que haya inmunocomplejos, estos fijarán el complemento y lo agotarán. Hay que utilizar la cantidad exacta de complemento necesaria para lisar los eritrocitos, cuandono se hayan «gastado» en la incubación anterior; por eso es importante descomplementar el suero problema. Añadir un sistema indicador que serán eritrocitos con anticuerpos (hemolisinas) en su superficie, que forman complejos antígeno-anticuerpo. Interpretación de los resultados: Se observa la lisis de los eritrocitos: negativo. Significa que hay complemento libre que no se fijó en la primera reacción y, por tanto, que no hay anticuerpos en el suero. No se observa la lisis de los eritrocitos: positivo. Significa que el complemento se ha agotado en la reacción anterior debido a la presencia de anticuerpos específicos en el suero problema. 30 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO C.F.G.S. Laboratorio Clínico y Biomédico 7. Reacciones de neutralización Las pruebas de neutralización y en particular las de neutralización vírica, son uno de los estándares habituales para medir los niveles de inmunidad protectiva frente a un patógeno. Normalmente la prueba se realiza en dos pasos, uno primero de incubación del patógeno con el suero del animal a analizar y un segundo consistente en la inoculación del patógeno en un cultivo celular o en un animal. Si el suero contenía anticuerpos neutralizantes, se bloquea la capacidad infectiva del patógeno y; por lo tanto, no produce la infección del animal o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. A pesar de su utilidad, este método ha caído en desuso fuera de la investigación debido al tiempo que requiere y a la dificultad de trabajar con animales experimentales o cultivos celulares. FIN 31