UNIDAD 3 ENFERMEDADES AUTOINMUNES PDF

Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. UNIDAD 3: DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES Módulo profesional: Técnicas de análisis inmunodiagnóstico 1 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Ín...

Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. UNIDAD 3: DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES Módulo profesional: Técnicas de análisis inmunodiagnóstico 1 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Índice 1. Introducción 2. Detección de autoanticuerpos: Enfermedades autoinmunes y anticuerpos asociados 2.1. Enfermedades autoinmunes generalizadas 2.2. Enfermedades reumáticas 2.3. Vasculitis 2.4. as enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano 2.5. Intestinales. 3. Anticuerpos órgano específicos. 4. Los enzimoinmunoanálisis aplicados en las enfermedades autoinmunitarias 4.1. Antinucleares. 4.2. ANCA 4.3. Factor reumatoide. 4.4. Anticuerpos contra la glutamato descarboxilasa (GAD) 4.5. Antifosfolípidos. 5. Determinación de autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta: patrones de fluorescencia. 5.1. Anticuerpos antinucleares (ANA) 5.2. Anticuerpos contra el citoplasma de los neutrófilos (ANCA) 2 Técnicas de inmunodiagnóstico 1. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. INTRODUCCIÓN En las enfermedades autoinmunes, el sistema inmunitario propio ataca a las células sanas por error. En ellas participan los autoanticuerpos (anticuerpo desarrollado por el propio sistema inmunitario que va a actuar directamente en contra de uno o más antígenos del propio individuo). Su prevalencia en la población ha ido creciendo de una forma considerable en los últimos años. En esta unidad vamos a estudiar las técnicas que determinan la presencia de dichos autoanticuerpos en las diferentes enfermedades autoinmunitarias. 2. ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y ANTICUERPOS ASOCIADOS Las enfermedades autoinmunes son un grupo de enfermedades heterogéneo que se caracterizan por presentar autoanticuerpos. Pueden ser enfermedades generalizadas para todo el organismo o enfermedades específicas de un solo órgano. 2.1. Enfermedades autoinmunes generalizadas: En este tipo de enfermedades los autoanticuerpos actúan contra las moléculas nucleares o citoplasmáticas que van a participar de una forma u otra, en la replicación y la transcripción del ADN o en la traducción del ARN mensajero. Sus efectos pueden ser debidos a dos factores diferentes: • A los efectos directos de los autoanticuerpos. • A la acumulación de los complejos autoinmunitarios derivados a la unión del Antígeno/Anticuerpo. 2.2. • Enfermedades reumáticas Lupus eritematoso sistémico (LES): Enfermedad autoinmunitaria en la que el sistema inmunitario del cuerpo ataca por error el tejido sano. Éste puede afectar la piel, las articulaciones, los riñones, el cerebro y otros órganos. El LES es mucho más común en mujeres que en hombres. Puede presentarse a cualquier edad, pero es frecuente entre los 15 y 44 años. Los síntomas van a ser diferentes de un paciente a otro y pueden aparecer y desaparecer. Sintomatología: hinchazón y el dolor articular en manos y muñecas, dolores torácicos, fatiga, malestar, pérdida de cabello, sensibilidad a la luz solar, etc. Existe un síntoma que va a afectar a más de la mitad de los pacientes de LES que es una erupción en forma de "mariposa" en las mejillas y en el puente nasal. 3 Técnicas de inmunodiagnóstico • Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Artritis reumatoide: El sistema inmunitario ataca a los tejidos de su propio cuerpo. Las causas se relacionan con el medioambiente, las hormonas o la genética. Afecta al casi1% de la población por todo el mundo. ➢ Sintomatología: afecta las articulaciones causando dolor, hinchazón y rigidez, malestar, cansancio, fiebre. Se puede presentar a cualquier edad, pero es más común en la mediana edad. Las mujeres la sufren con mayor frecuencia que los hombres. • Esclerodermia: consiste en la acumulación de tejido con colágeno similar al cicatricial en la piel y en otras partes del cuerpo. Destruye el tejido sano y suele darse al mismo tiempo que otras patologías del sistema inmunitario, tales como la LES. Daña las células que recubren las paredes de las arterias pequeñas. Suele afectar a personas de 30 a 50 años de edad, es más frecuente en mujeres. 2.3. Vasculitis Son enfermedades que tienen en común la inflamación de los vasos sanguíneos (arterias, arteriolas, capilares, vénulas y venas). Como consecuencia, se va a producir una disminución del flujo vascular o incluso una interrupción completa del mismo. El problema reside en determinar su causa. Las vasculitis por hipersensibilidad se identifican con frecuencia por estímulo antigénico desencadenante de la enfermedad que puede ser debido a fármacos, infecciones víricas o bacterianas o, incluso, algunas proteínas defectuosas. En el resto de las vasculitis, la etiología se desconoce (no se sabe cuál es el estímulo antigénico). • Poliarteritis nudosa clásica: enfermedad vascular grave, por la cual las arterias pequeñas y medianas resultan inflamadas y dañadas. La afección se presenta cuando ciertas células inmunitarias atacan las arterias afectadas, sin motivo aparente. Los tejidos irrigados por las arterias afectadas no van a recibir el oxígeno y la nutrición que necesitan, en consecuencia, se presenta daño tisular. • Enfermedad de Kawasaki: Es una afección poco común que se manifiesta como una inflamación de los vasos sanguíneos, presentándose normalmente en los niños. Es un trastorno autoinmunitario que termina afectando a membranas mucosas, los ganglios 4 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. linfáticos, las paredes de los vasos sanguíneos y el corazón. • Poliangitis microscópica: Vasculitis sistémica, inflamatoria y necrotizante, que afecta predominantemente a los vasos pequeños en múltiples órganos. Se desconoce su prevalencia exacta. La incidencia anual es aproximadamente de 1/100.000 y la edad media de aparición de 50-60 años. Es una enfermedad autoinmune asociada a autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), sin apenas depósito de inmunocomplejos. Hay evidencias que indican que los ANCA pueden activar neutrófilos y monocitos, lo que origina la lesión de la pared vascular. 2.4. Las enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano En este caso, una serie de anticuerpos van a estar dirigidos contra un solo órgano o para una serie de órganos que se encuentran relacionados. Existe una diferencia fundamental con respecto a las enfermedades autoinmunes generalizadas, los autoanticuerpos son normalmente patogénicos. Tiroides: tiroiditis autoinmunes: La enfermedad de Basedow se produce cuando los autoanticuerpos se fijan sobre la tiroides y estimulan la secreción de hormonas dando como resultado un hipertiroidismo, concretamente cuando aparecen las TSI (inmunoglobulinas estimuladoras de tiroides) dirigidas contra el TSH-R (receptor para la hormona estimuladora de tiroides). Hay otras variantes de las enfermedades autoinmunes que pueden afectar al tiroides dando lugar a su inflamación, como es el caso de la Tiroiditis de Hashimoto. Inicialmente, la tiroiditis provoca un aumento en la secreción de hormonas tiroideas para dar luego paso a un hipotiroidismo. Tubo digestivo: Enfermedad celíaca: intolerancia permanente al Gluten. Se trata de una enfermedad sistémica, se van a producir una serie de Autoanticuerpos que pueden afectar a otros órganos. Suele aparecer en individuos que están predispuestos genéticamente a padecer trastornos en sistema de antígenos leucocitarios de Histocompatibilidad (HLA) de clase II, siendo los HLA, una serie de antígenos presentes en la superficie de la mayor parte de las células del individu. 5 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Enfermedad de Crohn: El sistema inmunológico del paciente va a atacar a su intestino grueso inflamándolo. Entre sus posibles causas, muy probablemente se trate de una enfermedad poligénica que, compartiendo genes que aumentarían la susceptibilidad de padecerlas y una serie de factores ambientales, se producirá una alteración de la respuesta inmunológica del paciente. Hígado: Hepatitis autoinmunitaria: Se produce la inflamación y posterior destrucción del hígado. La causa es una respuesta inmunológica anómala frente a determinados antígenos presentes en la superficie de los hepatocitos. Para su diagnóstico, se suele requerir el hallazgo de una serie de anticuerpos en la sangre tales como: ANA, LKM-1, AML, SLA/LP. Colangitis esclerosante primaria: Enfermedad inflamatoria de los conductos biliares. Su etiología exacta es desconocida, se cree que se debe a una serie de factores genéticos y ambientales que inducen a que los linfocitos T a atacar a los conductos biliares internos y externos del Hígado. Para su diagnóstico, se suele buscar la presencia de anticuerpos anti-citoplasma del neutrófilo, p-ANCA, que suele darse en el 50 % de los pacientes. Sistema nervioso: Miastenia grave: Enfermedad neuromuscular autoinmune que produce debilidad en los músculos esqueléticos como consecuencia de un defecto entre la transmisión de los impulsos nerviosos y dichos músculos. Los Autoanticuerpos bloquean, alteran y finalmente destruyen, los receptores de la acetilcolina, evitándose la contracción muscular. Para su diagnóstico, se suele usar la búsqueda de anticuerpos contra receptores de la acetilcolina para detectar presencia de anticuerpos ACRA presentes en el 75 % de los casos. Esclerosis múltiple: Se producen lesiones desmielinizantes neurodegenerativas de carácter crónico en el sistema nervioso central. Se cree que es un problema autoinmune, combinado con factores ambientales. Para su diagnóstico suele buscarse la detección de bandas oligoclonales referentes a anticuerpos en el líquido de cefalorraquídeo. 6 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Piel: Dermatitis herpetiforme: Se produce una afectación cutánea de origen autoinmune e inflamatorio, produciendo una gran cantidad de lesiones cutáneas. Está causada por el depósito de IgA en las papilas dérmicas y parece que se trata de una enfermedad que puede presentar las mismas causas genéticas que la enfermedad celíaca. 3. ANTICUERPOS ORGANOESPECÍFICOS Son autoanticuerpos específicos frente a los componentes de algún órgano determinado o a una serie de órganos que se encuentran relacionados entre sí. Se diferencian de los autoanticuerpos no Órgano específicos, en que suelen ser patogénicos, pueden ser buscados por diferentes técnicas, su especificidad es mucho más identificable, puesto que tienen como antígeno diana, una parte o componente muy concreto de la estructura de un órgano. Entre los más característicos, podemos enumerar: - Tiroides→Anticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH). - Suprarrenales→ Anticuerpos contra las suprarrenales. - Páncreas→ Anticuerpos contra la glutamato descarboxilasa 65 (GAD65). - Tubo digestivo→ Anticuerpos contra las células parietales gástricas. - Hígado→ Anticuerpos contra el músculo liso (ASMA). Anticuerpos contra las mitocondrias (AMA). Anticuerpos contra los microsomas hepáticos y renales (LKM). 4. ENZIMOINMUNOANÁLISIS APLICADOS A LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS Las técnicas de enzimoinmunoanálisis son las más utilizadas en el campo de las patologías autoinmunitarias, mediante el empleo de reactivos marcados. Para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes vamos a estudiar las siguientes moléculas: 7 Técnicas de inmunodiagnóstico 4.1. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Anticuerpos antinucleares También llamados Autoanticuerpos ANA, se determinan mediante dos tipos de ELISA para ANA de amplia especificidad, que se denominan: ➢ Pruebas genéricas de ANA. Nos da unos resultados similares a la Inmunofluorescencia Indirecta para ANA, sin informarnos sobre los patrones de fluorescencia. Los resultados son semicuantitativos y es una técnica que está sustituyendo a la Inmunofluorescencia indirecta. ➢ Pruebas específicas de un antígeno que detectan ANA y reacciones con un solo autoantígeno, en este caso se trata de los ELISA para autoanticuerpos contra el núcleo de una especificidad conocida. Los ELISA para ANA van a usar una serie de antígenos que provienen de una serie de homogeneizados nucleares o de unas mezclas de estos antígenos purificados o de antígenos recombinados. Como ventaja de los ensayos ELISA podemos destacar su gran sensibilidad y capacidad de detección de los negativos. Como parte negativa de las técnicas de ELISA, estará su baja capacidad de detectar un valor predictivo positivo. 4.2. Anticuerpos contra el citoplasma de los neutrófilos (ANCA) En este caso, podremos usar dos variantes de los Ensayos ELISA: • Los que usan Antígenos purificados. • Los que usan Anticuerpos Recombinantes. Se han llevado a cabo numerosos intentos para poder conseguir PR3 (es el principal antígeno objeto de los autoanticuerpos antineutrófilos citoplásmicos (ANCA)) recombinante pero aún no se ha conseguido una proteína que sea reactiva con los Anticuerpos humanos. La PR3 nativa puede llegar a producir la desnaturalización parcial, ya que se va a producir una alteración de los Epítopos lo que puede provocar la pérdida de la reactividad de los anticuerpos. Cuando empleamos un ensayo ELISA de captura, va a existir el riesgo de que el anticuerpo de captura vaya a ocultar algunos epítopos. 8 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. La metodología de los ensayos ELISA y sus resultados sigue haciendo que sea más usada que los Inmunoensayos Indirectos en la captura y determinación de los anticuerpos ANCA. 4.3. Factor reumatoide Para este tipo de patología, existen diferentes ensayos comercializados. Los ensayos ELISA diseñados para detectar el factor reumatoide, se dirigen principalmente para los factores reumatoides tipo IgG e IgA. ✓ En el caso del factor reumatoide de tipo IgA, conviene destacar que suele ser el primer isotipo que aparece cuando aparece la enfermedad, por lo que adquiere una gran relevancia a la hora de predecir la posible aparición de la patología. ✓ En el caso de los factores reumatoides de tipo IgG cabe destacar que este tipo es exclusivo de la artritis reumatoide y descarta otros tipos de artritis. 4.4 Anticuerpos contra la glutamato descarboxilasa (GAD) La búsqueda de este tipo de autoanticuerpos sirve para determinar la Diabetes de tipo 1, puesto que los anti-GAD se relacionan con la progresión de dicha enfermedad, además de tener un posible uso predictivo de dicha patología. Para detectar los anti-GAD, se vienen usando los ensayos ELISA que van a emplear GAD nativa y recombinante para poder determinar su presencia. No obstante, podría existir un problema relacionado con la posible pérdida de la conformación nativa de la GAD nativa a la hora de llevar a cabo su fijación en la placa. Para solucionar esto, se desarrolló una GAD recombinante que ha sido previamente biotinilada para poder cubrir una placa tratada previamente con estreptavidina. 4.5 Anticuerpos antifosfolípidos Los autoanticuerpos frente a los fosfolípidos suelen presentarse en el Síndrome antifosfolípido, que se trata de un trastorno en el que la sangre va a coagular más rápido de lo normal, con las consiguientes manifestaciones secundarias, tales como problemas en el embarazo, trombosis, cefaleas, etc. Para su determinación, suelen emplearse técnicas de ensayo ELISA para buscar la presencia de dichos autoanticuerpos (aPL). En este sentido, se usan como antígenos dianas una mezcla de fosfolípidos cargados negativamente o cardiolipina purificada, aunque esta última opción presenta numerosos 9 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. problemas a la hora de poder llegar a la estandarización de los resultados. 5 DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: PATRONES DE FLUORESCENCIA. Cuando trabajamos con los autoanticuerpos, vamos a ver que producen una serie de patrones de fluorescencia característicos que consisten en una serie de imágenes tipo con las que podremos llegar a orientarnos sobre el tipo de autoanticuerpo, e incluso podremos identificarlo. ➢ En el caso de la Inmunofluorescencia indirecta vamos a tener un problema añadido que consiste en la llamada fluorescencia de fondo. Esto se debe a que el suero contiene anticuerpos circulantes; se soluciona empleando una dilución inicial en función de las propias recomendaciones de las casas comerciales, las necesidades analíticas, etc. Dicha solución inicial nos va a determinar la especificidad y la sensibilidad, de manera que cuánto más grande sea la dilución, menor serán estos parámetros. Para poder determinar los resultados tendremos que valorar el patrón de fluorescencia y la intensidad de ésta. Para ello, deberemos saber que aquellos especímenes que sean positivos deben tener un patrón de fluorescencia que se pueda identificar y, además, deberán presentar una intensidad de fluorescencia mayor que un valor umbral. En el caso de la búsqueda de autoanticuerpos deberemos tener en cuenta, además, que cuanto mayor sea la intensidad de la fluorescencia, mayor será la posibilidad de que la prueba positiva tenga significación clínica, es decir, que tendremos que estar pendientes del título que presente la muestra. ➢ En las pruebas de Inmunofluorescencia Indirecta aplicadas a la Autoinmunidad, vamos a emplear como sustratos cortes de tejidos ya sea de humanos o, también, de animales; dichos sustratos suelen adquirirse en empresas de suministros técnicos, aunque también pueden prepararse en el mismo laboratorio, lo que resulta algo complicado puesto que ha de intentarse, ante todo, que se mantenga íntegra la estructura del tejido. Una vez obtenido, se deberá proceder a la congelación de este empleando N2. Tras su congelación, se procederá a llevar a cabo el corte con el Criostato. 10 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. En cuanto a las aplicaciones de la inmunofluorescencia en las enfermedades autoinmunitarias destacamos la Inmunofluorescencia Indirecta en el diagnóstico de las enfermedades Autoinmunes. 5.1 Anticuerpos antinucleares (ANA) Para ello, las técnicas de Inmunología Indirecta para ANA, van a emplear las llamadas Células HEp-2 que son células del epitelio de laringe humano, pero células que proceden de un carcinoma de laringe, no de células sanas. Estas células, al proceder de un tumor, son células con una gran actividad mitótica y que van a presentar células en diferentes fases del ciclo celular. En este caso, vamos a poder observar los antígenos presentes en las diversas fases de este. A continuación, se permeabiliza la membrana plasmática mediante un disolvente lipídico para que puedan penetrar todos los anticuerpos existentes en el suero. Como método de fijación se suele usar paraformaldehído-tritón X-100. Como conjugado contra la inmunoglobulina, vamos a usar una IgG específica. Como Fluorocromo se suele usar el isotiocianato de fluoresceína. Existe una serie de sueros de referencia procedente de la OMS y del Laboratorio de Referenciade ANA de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de Estados Unidos (AF/CDC 1-10); que ya presentan un contenido y una determinada especificidad de ANA definidas. Además, desde el Laboratorio de Referencia de ANA de los CDC, también se dispone de determinados sueros de referencia para autoanticuerpos de patrón homogéneo, patrón centromérico, patrón moteado y patrón nucleolar. Patrón homogéneo: Los patrones principales que se observan en la Inmunofluorescencia Indirecta de ANA son patrones de Tipo homogéneo. En este caso, veremos que todo el núcleo va a presentar una fluorescencia algo difusa pero uniforme en aquellas células que se encuentran en la interfase. En las células que se encuentran en esta fase, puede llegarse a observar una intensidad mayor de la fluorescencia justo en la región externa del 11 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. núcleo, es decir, se da un refuerzo periférico. Este patrón lo dan: • Los anticuerpos contra el ADNds. • Los anticuerpos contra las histonas. Se presenta en el lupus eritematoso sistémico (LES). Eso sí, en las células que se encuentren en plena mitosis, la intensidad de la fluorescencia va a ser mucho más pronunciada en la región cromosómica siendo el citoplasma totalmente negativo. Patrón moteado: En este caso, en aquellas células que se encuentran en la interfase van a presentar una gran cantidad de puntos de fluorescencia que se encuentran diseminados por todo el núcleo. Dicho moteado puede ser grueso o fino. En cambio, las células que se encuentran en la metafase no presentarán ningún resto de fluorescencia en la región cromosómica condesada. Este tipo de patrón se va a dar en el LES. Patrón nucleolar: En este caso, se van a teñir los nucléolos y puede ser una tinción homogénea o moteada, que va a depender del estado de la célula. Así, en el patrón homogéneo nucleolar, aquellas células que se encuentran en la metafase, presentarán una tinción bastante difusa en el nucleoplasma y no va a haber fluorescencia en la región cromosómica condensada. Si se presenta el patrón moteado nucleolar, se podrá ver como los nucléolos de las células que se encuentran en la interfase y en la metafase. Cuando aparece este patrón de tinción moteada de los nucléolos, suele venir acompañada de una tinción moteada/homogénea del núcleo y de una tinción homogénea de los cromosomas de las células que se encuentran en la fase de Metafase. Este tipo de comportamiento viene asociado a las siguientes enfermedades autoinmunes: • El LES. • La esclerosis sistémica. 12 Técnicas de inmunodiagnóstico Diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Patrón centromérico: En este caso se va a dar un patrón moteado en las células que se encuentran en plena metafase. Se da en esclerosis sistémica limitada. Patrón en anillo: En este caso vamos a observar un patrón bastante homogéneo que presentará una concentración de fluorescencia en los bordes del núcleo, mientras que las células que se encuentran en la metafase no van a mostrar ninguna tinción en la región cromosómica condesada. Este patrón se asocia con enfermedades hepáticas autoinmunitarias. Patrón en huso mitótico: En este caso, cuando las células se encuentran en metafase y anafase, vamos a observar una tinción fluorescente de los polos del huso, pero sin tinción en las fibras interpolares ni en el ecuador celular en metafase. Si vemos las células en interfase, observaremos una tinción nuclear moteada muy fina con los nucléolos en negativo. 5.2 Anticuerpos contra el citoplasma de los neutrófilos (ANCA) Este tipo de autoanticuerpos estarán dirigidos frente a determinados antígenos que están presentes en los gránulos presentes en el citoplasma de los neutrófilos. Se dan sobre todo en las vasculitis sistémicas necrosantes. Las pruebas que están diseñadas para determinar su presencia suelen usar preparaciones de neutrófilos que pueden ser adquiridos en los propios laboratorios de inmunodiagnóstico o adquirirse en los diferentes laboratorios farmacéuticos que los comercializan. Cuando se desarrollan las pruebas, es importante que los neutrófilos elegidos no se lleguen a activar debido ya que puede darnos una serie de perfiles y patrones que pueden llevarnos a equívocos. Es normal que aparezcan tres tipos de patrones de Inmunofluorescencia diferentes: - El Patrón atípico (A-ANCA). - El Patrón Citoplasmático (C-ANCA): En el caso de aquellos neutrófilos que han sido fijados en etanol van a darnos una tinción citoplasmático granular homogéneo. - El Patrón Perinuclear (P-ANCA). 13