Preparación de Materiales y Reactivos (Parte 1) en Cultivos Celulares

UD5. Preparación de Materiales y Reactivos Módulo de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1  Unidad 5 : Preparación de materiales y reactivos  Limpieza y lavado de superficies, equi...

UD5. Preparación de Materiales y Reactivos Módulo de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1  Unidad 5 : Preparación de materiales y reactivos  Limpieza y lavado de superficies, equipos y material.  Desinfectantes.  Esterilización.  Métodos físicos (calor húmedo y seco, filtración y radiación)  Métodos químicos.  Control de esterilidad  Manejo del material estéril  Pesaje y medida de volúmenes en el laboratorio.  Disolución y diluciones. Etiquetado. 2  Asepsia Antisepsia α - σῆψις αντι - σῆψις Sin - putrefacción Contra - putrefacción Procedimientos o Procedimientos o actividades destinados a actividades destinados a prevenir inhibir o destruir la introducción de los microorganismos microorganismos 3 4 Es un proceso que elimina la suciedad de un objeto combinando la frotación la acción química de los detergentes En algunas ocasiones es suficiente por sí mismo. En otras se aplica como un paso previo a una desinfección o a una esterilización. Circulo de Sinner Factores de los que depende la efectividad de un procedimiento de limpieza 1. Acción mecánica: Limpieza manual. Limpieza con lavavajillas. Limpieza con un baño de ultrasonidos. 2.Acción química. 3.Tiempo. 4.Temperatura 5.Cantidad y calidad del agua 5  Las superficies, cabinas, incubadores, estufas, baño de agua, centrífugas, Casi todo el material es de un solo uso, micropipetas, pipetus … aunque hay excepciones Material de vidrio y plástico, utensilios de disección,, contenedores dispensadores de células….. Suele ir seguido de esterilización si va a haber contacto directo con las células Suele ir seguido de desinfección 6 1) Debemos ponernos guantes y si hace falta bata. 2) Frotamos el material con agua fría y detergente Usamos cepillos, escobillas u otros productos que nos ayuden a eliminar la suciedad, sobre todo para el material de disección. Nunca usar agua caliente porque coagula las proteínas de la materia orgánica y hace que se adhieran más. Si hay restos muy pegados que no se liberan, será necesario poner el material en remojo con algún producto corrosivo para poder arrancarlos. En este caso, debemos seguir las instrucciones de uso y de seguridad del fabricante del producto. 3) Una vez retirada la suciedad más gruesa, frotamos el material con agua caliente y detergente, cepillando bien todos sus rincones. 4) Aclaramos bien con agua del grifo 5) Efectuamos un segundo aclarado, enjuagar con abundante agua desionizada o destilada, para eliminar restos de iones 6) Dejamos secar el material en un soporte adecuado 7 A veces se utiliza el lavavajillas, pero primero nos aseguramos de que no hay mucha materia orgánica incrustada. La limpieza con un baño de ultrasonidos Los baños de ultrasonidos son útiles para la limpieza de instrumentos que tienen partes de las que es muy difícil quitar la suciedad. Consta de una cubeta que se llena con agua y detergente, en la que se sumergen los objetos sucios. Cuando se pone el equipo en marcha genera ultrasonidos que hacen que el agua vibre a unas frecuencias muy altas, friccionando los objetos sumergidos en ella; esta fricción desprende la suciedad que se haya adherido. 8 Dependerá del material del que estén fabricados. En general: 1) Limpiar con jabón o detergente suave muy diluido para que no haga espuma 2) Con papel o paños de algodón que no suelten fibras. 3) No es necesario aclarar. 9 Se utilizan detergentes que son mezclas de sustancias tensioactivas que tienen la propiedad química de disolver la suciedad o las impurezas de un objeto sin corroerlo. Tensioactivos o surfactantes Dispersión Poder humectante Dispersión Suspensión Tensioactivos Poder humectante Suspensión: Emulsión de Micelas Se reduce la atracción entre las moléculas de agua y “moja mejor”. 10 Procedimiento que destruye la mayoría de los microorganismos de los microorganismos patógenos sobre un objeto, material o superficie, con 1) Desinfección de intensidad baja La desinfección puede conseguirse mediante: Destruye la mayoría de las formas vegetativas bacterianas. 1) Métodos físicos: Algunos virus y hongos. CALENTAMIENTO RADIACIÓNUV No destruye las esporas bacterianas. ULTRASONIDOS 2) Desinfección de intensidad media: FILTRADO Destruye todas las formas vegetativas bacterianas 2. Métodos químicos: PRODUCTOS DESINFECTANTES La mayoría de los virus y los hongos. Sea cual sea el método escogido, previamente No destruye las esporas bacterianas. debemos limpiar el material o superficie. 3) Desinfección de intensidad alta. Destruye todos los microorganismos, excepto algunas esporas bacterianas. 11 Radiación UVA (254nm)  La acción durante 20 segundos de lámparas de radiación UV mata la mayoría de los gérmenes.  Son poco penetrantes: Solo son efectivas para desinfectar objetos de superficie lisa.  La fuente ha de estar cerca de ellos, de forma que la radiación pueda incidir directamente en toda la superficie.  Las radiaciones ultravioleta se emplean para de desinfectar superficies de trabajo. Filtros de flujo laminar:  Los sistemas con filtros de flujo laminar se usan para:  Desinfectar el aire en salas.  Desinfectar el aire en cabinas de seguridad.  Este tipo de desinfección es necesario cuando se trabaja con determinados microorganismos, para reducir el riesgo de:  contagio del personal  contaminación de la muestra.  Un equipo capta el aire de la sala o de la cabina, lo pasa a través de filtros que retienen gérmenes y lo devuelve a la sala o cabina. La captación, filtración y devolución del aire se va produciendo de forma continuada.  Dependiendo del tipo de filtros que se usen, el aire filtrado tendrá uno u otro nivel de desinfección o, incluso, se puede llegar a considerar que es prácticamente estéril.  En función del tipo de microorganismo sobre el que actúa el desinfectante, este se denomina: Se basa en el uso de productos desinfectantes. SI LOS DESTRUYE - Bactericida. Desinfectante: - Fungicida. - Es una sustancia química. - Viricida - Puede aplicarse sobre material inerte sin alterarlo de SI SOLO INHIBE SU CRECIMIENTO : forma apreciable. - Bacteriostático. - Fungistático. - Virustático. Diferencia entre antiséptico y desinfectante: Los antisépticos son desinfectantes que pueden aplicarse sobre materia viva, ej. el etanol puede usarse para desinfectar la piel. Hipoclorito sódico (lejía): Utiliza siempre la cantidad recomendada ya que ¡mayor cantidad no es sinónimo de mayor poder - Potente bactericida. de limpieza o desinfección! Según la -De acción rápida pero transitoria, porque su agente activo, el cloro, Organización Mundial de la Salud (OMS) se se evapora. recomienda una concentración del 0,5% lo que - Es el desinfectante ambiental de uso más común corresponde a mezclar 130 ml de lejía en 870 ml - Se usa para desinfectar suelos, paredes, etc. - No puede usarse como antiséptico porque es corrosivo. de agua -No sirve para desinfectar ciertos instrumentos, porque corroe los metales, algunos plásticos y el caucho.  Alcohol etílico al 70%: - Elimina muchas bacterias y algunos virus (VIH incluido) y hongos, pero no las esporas. -Desventaja: tiene un espectro antibacteriano limitado. -Se usa más para la desinfección de superficies de trabajo en los laboratorios. - Puede usarse como antiséptico de uso externo (piel). Viricidas y Fungicidas Virkon es un desinfectante de espectro total, bactericida, fungicida y virucida con formulación a base de peroxígeno. Aqua Stabil Aditivo protector para agua Previene el crecimiento de algas, bacterias y otros microorgánismos. Adicione 2 ml de Aqua Stabil por litro de agua. Cada vez que la coloración azul desaparece, o al menos cada tres meses, llene el baño con agua fresca y Aqua Stabil. 18  Precuaciones en el uso de desinfectantes: Nos pondremos guantes para manipular los desinfectantes ya que irritan la piel y las mucosas. Prestaremos atención a las advertencias sobre los riesgos respiratorios, ya que algunos desinfectantes producen vapores tóxicos y solo se pueden usar en espacios con ventilación. No mezclaremos desinfectantes, salvo que los fabricantes lo aconsejen. La mayoría de las soluciones desinfectantes no se pueden guardar de un día para otro. Por tanto, a la hora de prepararlas tendremos presente el tiempo durante el cual se puede guardar para que no sobre disolución que se deba tirar. Conservar las disoluciones que se puedan guardar en recipientes correctamente tapados, que protejan de la luz y del calor, y etiquetarlos para que no puedan producirse confusiones. En la etiqueta: - Informacióngeneral. - la concentración - la fecha de preparación. Al someter a un grupo de bacterias a un proceso de esterilización mueren exponencialmente Muchas morirán llegado a un punto nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero. 20 21 Los métodos basados en el calor son los más utilizados para controlar el crecimiento microbiano. Microorganismos mueren a temperaturas mayores a la óptima de su metabolismo El medio (pH, [sal], [azúcares], [agua]…) en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Muy importante para esterilización de alimentos 22  -Un recipiente de paredes gruesas con tapa hermética, en cuyo interior hay: - una rejilla para situar los objetos  Vapor de Agua AUTOCLAVE -y un recipiente con agua destilada, que se convertirá en vapor. -Mandos para programar la Vapor de agua a temperatura y la presión de su interior, y el tiempo del >100ºC proceso. -Una válvula de seguridad por si la presión interior se eleva demasiado Habitual  120°C y 2atm. El tiempo depende del volumen.  Min 20’ para 3 litros Para casi todo el material no termosensible Corrosivo en metal Económico y Atóxico Deteriora filos cortantes Controlable y modificable No para endoscopios flexibles 23 Rápido y Eficaz  El autoclave, consta de: -Un recipiente de paredes gruesas con tapa hermética, en cuyo interior hay: - una rejilla para situar los objetos -y un recipiente con agua destilada, que se convertirá en vapor. Este vapor de agua produce un aumento de presión en el interior del autoclave, hasta los niveles que hayamos marcado. -El vapor de agua calienta más rápidamente el interior, con menos temperatura y difunde más -Mandos para programar la temperatura y la presión de su interior, y el tiempo del proceso. -Una válvula de seguridad por si la presión interior se eleva demasiado El aumento de presión hace que aumente la temperatura de ebullición del agua y, por tanto, que el vapor de agua tenga una temperatura más elevada que si la presión fuera la atmosférica, llegando hasta unos 121ºC.  Consideraciones importantes en cuanto al uso del autoclave:  El vapor necesita estar en contacto con todas las superficies. Para ello abrir o desmontar todos los instrumentos y demás objetos, y colocarlos en el autoclave de tal forma que el vapor pueda circular entre ellos.  El autoclave no puede trabajar a presiones superiores a las que puede resistir.  Nunca debemos introducir recipientes herméticamente cerrados en el autoclave.  No debemos abrir el autoclave antes de que su presión haya igualado a la atmosférica y su temperatura sea inferior a los 90ºC. Mejor esperar hasta los 60ºC para sacar el material.  Para vaciar el autoclave, debemos usar guantes de seguridad que protejan de quemaduras.  Debemos comprobar la esterilidad. Para ello, existen diversos tipos de indicadores (físicos, químicos y biológicos) que nos permiten verificar la efectividad del sistema. https://www.youtube.com/watch?v=4WFt5jhRaBQ www.youtube.com/watch?v=g0TcVQ8_H0s   Tindalización Se utiliza cuando no pueden calentarse por encima de 100° C. -  100ºC 1º Las esporas germinarán  30-60 minutos 2º Formas vegetativas mueren  3 días. 3º Seguridad 26   Horno Pasteur Se utiliza para vidrio, sólidos termoestables y objetos que no pueden humeder - Vidrio de laboratorio a 160ºC, 2 horas. Pasteurización UHT  Venta a Tª ambiente La pasteurización SOLO elimina los patógenos (leche, zumos…) 27   Incineración Destruir residuos  Flameado Asas de siembra, agujas, pinzas, etc - 28  Para algunos productos líquidos o gaseosos termolábiles (soluciones nutricionales, medicamentos, antibióticos...). - 29  - Video: LifeStraw makes toilet water drinkable 30  Destruye ADN Poco penetrante Superficies Zonas señalizadas Personal formado Ioniza ADN  Rayos UV Muy penetrante (plástico e incluso  Rayos Gamma dentro de cajas de cartón o madera) Material desechable, cosméticos… Material termosensible Industria 31   Acido peracético 2%  Inmersión  35ºC  Ciclos cortos (ej. 18min) No apto para material embolsado No apto para aluminio Muy útil en punto de uso 32  Sirve para esterilizar material termosensibles (plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. ) Está en desuso en centrales Inflamable hospitalarias Explosivo Cancerígeno 33  Es efectivo en frío Se usa para sumergir al 2-4% Endoscopios Superficies Descontaminar edificios, Destruyen formas vegetativas de ambientes.. Muy irritante bacterias, hongos y virus. Pierde actividad en No esporas desinfección alto nivel ambientes refrigerados 34  Calculemos cuanto Glutaraldehido necesito para llenar barreño de 4 litros. Añadimos a apuntes y libreta. 35  Alternativa al Óxido de Etileno  Plasma  Vaporizado  Vaporizado con O3 No tóxico No deja residuos No humede el material Funciona a baja Tª (50ºC) Ciclos cortos (45-55 min) Nube de gas altamente ionizado Control automático del proceso que llegan a ser visibles (algo muy Elimina Priones similar a las auroras boreales). 36  Diferentes sistemas y materiales de empaquetado Puntas de micropipetas Tubos y plásticos resistentes Mangas mixtas y bolsas tyvek Material de disección Botes de vidrio Vidrios Contenedores estériles de filtrado Líquidos 37  Indicadores Físicos: lectura de los paneles o informes impresos por el equipo de tiempo, temperatura y presión alcanzados Indicadores Químicos: Son sustancias químicas que impregnan un papel especial y que cambian de color al calentarse. Se colocan en los paquetes a esterilizar. No muestran si la temperatura se ha mantenido en el tiempo. Indicadores Biológicos: Son preparados comerciales que contiene una cantidad conocida de esporas de Bacillus stearothermophilus. Si el tratamiento destruye a dicha espora habrá destruido todos los microorganismos y sus formas de resistencia. Se introducen junto con el material y en la zona más alejada de la fuente de calor-vapor  El material debe guardarse de forma correcta y protegido del polvo Realizar siempre la Técnica Aséptica Siempre abrir en cabina o debajo del mechero Abrir bolsas por la zona que no estará en contacto con las células Nunca volver a introducir puntas o tubos en sus contenedores Asegurarse que todo está bien cerrado al terminar el trabajo 39  Líquidos Autoclavables -Agua destilada/ didestilada -Tampones (PBS-0.05%EDTA) -Medios LB para plaqueo y amplificación bacteriana (plásmidos de transfección)  Autoclavar y cuándo se enfríe se le añaden los reactivos termolábiles como los antibiótioticos, hormonas etc  Nunca llenar >75%  Los matraces se tapan con papel de aluminio  Las botellas nunca se cierran completamente. Una vez que la botella se saca del autoclave, cerrar.  Siempre poner cinta indicadora de esterilización 40  Líquidos NO Autoclavables -Tampones con sustancias termolábiles - Compuestos químicos termolábiles (proteínas, hormonas, DMSO,etc) -Medios de cultivo complejos con sospecha de contaminación  Filtración dentro de cabina  Comprobar esterilización mediante prueba de crecimiento bacteriano 41  Sólidos Autoclavables  El material siempre saldrá húmedo pero únicamente por fuera del recipiente  Se debe secar en estufa a 60ºC durante al menos 24 horas  Si los paquetes están mojados por dentro es que están dañados. Descartar 42 Preparación de Reactivos  Pesaje y medida de volúmenes en el laboratorio.  Disolución y diluciones. Etiquetado. 43 44