Tehnologija in varnost živil Vaje PDF

TEHNOLOGIJA IN VARNOST ŽIVIL vaje mikrobiološke preiskave ZF Izr. prof. dr. Karmen Godič Torkar  Tehnologija in varnost živil Priprava na vaje SU: izročki-navodila za vaje, delovni list Oddate delovni list z izračunom rezultatov (delovni list je v SU,...

TEHNOLOGIJA IN VARNOST ŽIVIL vaje mikrobiološke preiskave ZF Izr. prof. dr. Karmen Godič Torkar  Tehnologija in varnost živil Priprava na vaje SU: izročki-navodila za vaje, delovni list Oddate delovni list z izračunom rezultatov (delovni list je v SU, izpolnjenega oddate v wordovi obliki do 30. 11. 2024 v SU) Na koncu vaj kratek kolokvij z nekaj vprašanji SU geslo: TVŽ4883  RAZPORED VAJ Zap. št. vaje h Vsebine Lokacija 1 2 Teoretični del: splošno o mikrobioloških preiskavah ZF Zakonodaja Mikroorganizmi, ki so pomembni za higieno živil Vzorci, vzorčenje, potek dela v mikrobiološkem laboratoriju DLP Potek posameznih mikrobioloških preiskav Prenosi vzorca na (v) gojišča Mleko: SŠMO 2 3 Skuta: KPS (S. aureus), E. coli ZF Konzerve zelenjavne: preiskava na SRKL Pregled in izračun rezultatov prejšnjih vaj, potrditveni testi 3 3 Jušni koncentrat: Enterobacteriaceae; Glive (plesni) ZF Margarina: Bacillus cereus Pregled in izračun rezultatov prejšnjih vaj, potrditveni testi 4 2 Začimbe: ZF KPS (S. aureus), E. coli, SRKL, B. cereus, SŠMO, glive 5 1 pregled rezultatov, kolokvij ZF Zap. št. vaje h Vsebine Lokacija 6 2 Senzorična ocena VF Preiskava na Salmonellae spp.- demonstracija Trdi sir: E. coli, S. aureus Vzorec mleka z znanim št. mikrobov (B. subtilis)-kontrolne karte 7 2 Pregled gojišč, izračun rezultatov VF Uredba 2073/05 Preiskava na Campylobacter spp.-prisotnost; demonstracija - Mleto meso: E. coli, S. aureus - Meso piščanca: S. aureus, E. coli, SRKL 8 2 Pregled gojišč, izračun rezultatov, Ocena skladnosti VF Preiskava na L. monocytogenes.- prisotnost; demonstracija Mesna enolončnica (kvantit. pozitiven vzorec): SŠMO, E. coli, Enterobacteriaceae 9 2 Pregled gojišč, izračun rezultatov, vnos rezultatov na VF kontrolno karto Demonstracija: število L. monocytogenes - število Campylobacter spp. 10 2 Pregled gojišč, izračun rezultatov VF Preiskave opravljene v skladu s Smernicami – vzorci: NAMEN ZDRAVSTVENEGA NADZORA NAD ŽIVILI PRI VAJAH OSREDOTOČILI NA ZDRAVSTVENO USTREZNOST (VARNOST) ŽIVIL  ZAKONODAJA ❖ Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (Uradni list RS, št. 52/00, 42/02 in 47/04 - ZdZPZ) ❖ Smernice za izvajanje uredbe komisije ES 2073/2005 o mikrobioloških merilih za živila ❖ Uredba 1441/2007 o spremembi uredbe 2073/2005 ❖ Uredba ES 853 2004 o posebnih higienskih pravilih za živila živalskega izvora Pravilnik o posebnih ukrepih pri zastrupitvah in infekcijah oseb s hrano in o njihovem preprečevanju (1981, 1985). Ur List. SRS24:1296 Smernice za mikrobiološko varnost živil, ki so namenjena končnemu potrošniku (IVZ-NIJZ, ZPS, 2019) https://www.gzs.si/Portals/Panoga-Kmetijska- Zivilska/Smernice_2019.pdf  Opredelitve pojmov Mikrobiološko merilo je merilo, ki določa sprejemljivost živila, vode, brisa površine, itd. ali drugega vzorca, serije živil ali proizvodnega postopka na podlagi odsotnosti, prisotnosti ali števila MO in /ali količine njihovih toksinov/metabolitov na enoto mase, površine ali serije. Merilo varnosti živila, je merilo, ki opredeljuje sprejemljivost živila ali serije živil in se uporablja za živila, dana v promet. Smernice za izvajanje uredbe komisije 1441/2007  Opredelitve pojmov… Proizvodno higiensko merilo določa sprejemljivost higiene (DHP) proizvodnega postopka. se ne uporablja za proizvode, dane v promet. Določa okvirno stopnjo onesnaženja, pri kateri je potrebno izvesti korektivne ukrepe. Da se zagotovi higiena proizvodnje v skladu z zakonodajo. Vzorec je določena količina snovi, sestavljena iz ene ali več enot ali delov snovi, ki je iz celotne količine snovi izbrana na različne načine z namenom pridobiti podatke o določeni lastnosti snovi in je podlaga za odločanje o omenjeni snovi ali postopku njene izdelave. UREDBA KOMISIJE (ES)št. 2073/2005 o mikrobioloških merilih za Živila, UREDBA 1441/2007  Opredelitve pojmov… Reprezentativni vzorec je vzorec živila, ki ohranja značilnosti serije, iz katere je odvzet. ŠARŽA, PROIZVODNA SERIJA, LOT: proizvod ali skupina proizvodov, ki so bili v nekem definiranem času proizvedeni pod enakimi pogoji. Surovina, pogoji, zaposleni… Smernice, 2019, Uršič s sod., 2002  Vzorci za mikrobiološke preiskave Vzorčimo lahko: o ŽIVILA, v proizvodnji (iz proizvodne partije ali njegovega dela) ali v prometu – iz embalažnih enot o delovne ali druge POVRŠINE o pitno, površinske, bazenske VODE iz izkopanih vodnjakov ali kapnic, odpadne vode o ZRAK o ZEMLJO o …………..  ODVZEM IN LASTNOSTI VZORCA OB SPREJEMU V LABORATORIJ ✓ odvzame se tako, da se prepreči vsako njegovo naknadno onesnaženje, kvarjenje in poškodbe, ✓ vzorčevalec upošteva načela dobre higienske prakse, ✓ količina vzorca mora biti zadostna. ✓ minimalna količina vzorca (ene vzorčne enote) 300 do 500 g ali ml. ✓ dodatni kontrolni vzorec (T, -K) ✓ Vzorcem za mikrobiološko preiskavo se ne smejo dodajati sredstva za konzerviranje. ✓ Opazovalna lista ali zapisnik o vzorčenju  OB SPREJEMU VZORCA PREVERIMO ALI: je bil vzorec odvzet pravilno, je embalaža nepoškodovana, je količina vzorca ustrezna, so bili pogoji transporta ustrezni (temperatura, čas od odvzema, ostali pogoji), je vzorec ustrezno označen, je vzorčevalec dostavil pozitivno, negativno kontrolo, je temperatura kontrolnega vzorca ob sprejemu ustrezna (zamrznjena -15 do -18°C, hlajena živila od 2 do 8 °C, nehlajena živila 18 do 27 °C ), je ustrezno izpolnjen spremni list, katera preskušanja moramo opraviti (najprej mikrobiološka, nato kemijska) ali gre za : uradni vzorec; referenčni vzorec (se hrani v laboratoriju največ tri mesece, ima težo uradnega vzorca in služi morebitnim kasnejšim potrebam uradnega laboratorija oz. nadaljnjim preiskavam); kontrolni vzorec (se da na razpolago lastniku vzorca kot zagotovitev pravice do drugega mnenja; stranka razpolaga z njim po lastni vesti). ali zahtevajo pripravo strokovnega mnenja  Podatki v zapisniku o vzorčenju podatki o lastniku vzorca (ali koda, če anonimnost) kraj in čas vzorčenja, Podatki o izdelku (količina, vrsta, proizvodna serija, datum izdelave in uporabnosti, pogoji hranjenja…) število poslanih vzorcev, oz. enot, metoda vzorčenja, dobavitelj, proizvajalec vrsta preiskav, naslov laboratorija, pogoji transporta, ime vzorčevalca in njegov podpis. (SIST EN ISO 707,1999)  Dobra laboratorijska praksa sprejem vzorca (datum, ura, ustreznost vzorca) ZAGOTOVLJENA SLEDLJIVOST VZORCA DO POROČILA O PRESKUŠANJU Shranjevanje (preiskave čim prej, 24 do 48 urah, odvisno od vzorca. Hladna veriga, zamrzniti-ne v vseh primerih, če niso opravljena preskušanja v predpisanem roku (upoštevati rok uporabnosti!)  Dobra laboratorijska praksa MIKROBIOLOŠKE PREISKAVE: Standardi ISO, IDF, akreditirane metode, validirane metode, stalne kontrole reagentov, gojišč, merilnih instrumentov, aparatov, kontrolne karte (kontrola izvajalcev)  VRSTE MO V ŽIVILIH Bakterije so raznovrstni prokariontski enocelični organizmi, Glive so evkariontski organizmi,(kvasovke so pretežno enocelične glive; plesni, ki so nitaste glive) Praživali se v živilih ne razmnožujejo, z njimi se le prenašajo. Nezaželeni so kot povzročitelji parazitskih zoonoz Ostali paraziti (nematodi, členonožci) prenos z živili, vodo, z vektorji, v živilih se ne razmnožujejo Virusi so necelične enote, ki razvijejo značilnosti živega šele kot znotrajcelični paraziti v živih celicah. V okolju (na površinah, v vodi, živilih) se ne morejo razmnoževati, lahko pa se z njimi prenašajo. Določamo tudi njihove toksine in metabolite  ES ŠT. 1441/2007, PRILOGA 1 1. poglavje Merila varnosti živil: L. monocytogenes (dojenčki: odsotnost v 25 g), 100 CFU/g (živila za neposredno uživanje, če omogočajo rast bakterije) Salmonella (odsotnost v 25 g ali 10 g)-meso, mleko, mehkužci,semena, sadje zelenjava Stafilokokni enterotoksini (siri, mleko v prahu) E. coli (živi mehkužci) Enterobacter sakazakii (formule za dojenčke) (novo ime Cronobacter sakazakii )  ES ŠT. 1441/2007, PRILOGA 1 Poglavje 2: Proizvodna higienska merila Meso in mesni proizvodi: SŠMO Enterobakterije Salmonella E. coli kot indikator slabe higiene pri predelavi (pri živilih ne govorimo o fekalni kontaminaciji)  ES ŠT. 1441/2007, PRILOGA 1 Poglavje 2: Proizvodna higienska merila Mleko in mlečni proizvodi Enterobakterije E. coli Koagulaza pozitivni stafilokoki Bacillus cereus (formule za dojenčke)  ES ŠT. 1441/2007, PRILOGA 1 Poglavje 2: Proizvodna higienska merila Jajčni proizvodi: Enterobakterije Ribiški proizvodi E. coli koagulaza pozitivni stafilokoki Zelenjava, sadje in njihovi proizvodi: E. coli  Seznam MO, ki se jih določa v Smernicah (odvisno od vrste živila) Več kriterijev MO , kot v Uredbi 1441 SŠMO: Skupno število aerobnih mezofilnih m.o. Aeromonas hydrophila (gotove jedi iz surovih sestavin) Bacillus cereus (tudi v mesu, ne samo v formulah) Campylobacter Clostridium perfringens (sulfit reducirajoči klostridiji) MO V Uredbi 1441 Enterobacter (Cronobacter) sakazakii (formule za dojenčke) Enterobacteriaceae Dodatni MO v Escherichia coli (VTEC , verotoksična E. coli) Smernicah Lipolitične bakterije (maslo, ocvirki) Listeria monocytogenes Plesni, kvasovke Salmonella Staphylococcus aureus Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Smernice za mikrobiološko kakovost živil, ki so namenjena končnemu potrošniku, 2019  Metode vzorčenja, število vzorcev in ovrednotenje rezultatov preiskav METODA VZORČENJA Z ATRIBUTI: Kadar vzorec sestavlja več enot (vzorci iz lota, proizvodne serije) se vsak vzorec in rezultat preskušanja povezuje z vsako enoto vzorca, ki se odvzame iz lota. Ta način vzorčenja se večinoma uporablja za vzorčenje iz lota v proizvodnji, veleprodaji oziroma ob uvozu. Kadar vzorec sestavlja ena enota se vsak vzorec in rezultat preskušanja nanaša na eno samo enoto. Ta način vzorčenja se večinoma uporablja za vzorčenje v maloprodaji in sistemu javne prehrane. Smernice…, 2019  Pomen oznak po metodi vzorčenja z atributi n.n. = ni najdeno (kvalitativno) n = število vzorčnih enot, ki sestavljajo vzorec c = število vzorčnih enot, kjer je število bakterij lahko med "m" in "M", pri čemer vzorec velja za sprejemljivega, če je število bakterij v drugih vzorčnih enotah "m" ali manj m = če so rezultati mikrobiološkega preskušanja manjši ali enaki kot mejna vrednost »m« (≤ m), velja vzorec (ali vzorci) za skladnega (zadovoljivega, ustreznega), M = mejna dopustna vrednost, nad katero se rezultati ne štejejo več za zadovoljive. V kolikor en sam rezultat preseže to vrednost je vzorec nezadovoljiv (nesprejemljiv). Npr. Pasterizirano mleko: SŠMO (n=5, c= 1) m= 5x104 CFU/ml, M=5x105 CFU/ml Smernice…, 2019  OCENA SKLADNOSTI GLEDE NA MIKROBIOLOŠKE KRITERIJE - OCENA VZORCA: Vzorec je ocenjen kot skladen (zadovoljiv, ustrezen), ko so rezultati mikrobiološkega preskušanja, za vse preiskane parametre ocenjeni kot skladni (zadovoljivi, ustrezni) (pod m). V primeru, ko je en ali več parametrov ocenjen kot sprejemljiv (med m in M) in so rezultati za ostale preiskane parametre skladni (pod m), je vzorec sprejemljiv. Če je eden ali več rezultatov za posamezen parameter ocenjen kot neskladen (nad M) je vzorec neskladen (nezadovoljiv, neustrezen in potencialno nevaren). Smernice…, 2019  Ovrednotenje rezultatov V primeru ocenjevanja parametra za vzorec, ki ga sestavlja samo ena vzorčna enota, je potrebno upoštevati, da je parameter skladen (zadovoljiv, ustrezen), če: so rezultati skladni z zahtevami "m" ali "n.n.". Kadar je rezultat večji od "m" ali n.n. (iskan parameter je najden) je vzorec glede preiskanega parametra neskladen (nezadovoljiv, neustrezen in potencialno nevaren) Smernice…, 2019  Metode preiskave vzorca Kvantitativne (število MO) Kvalitativne (prisotnost in identifikacija posameznih vrst mo.) Klasične mikrobiološke metode odkrivanja in identifikacije mikroorganizmov: Mikroskopske metode Štetje (ugotavljanje) značilnih kolonij na gojiščih Biokemijske metode identifikacije Druge metode identifikacije (masna spektrometrija MALDI TOF) serotipizacija Encimsko-imunske metode Molekulsko-genetske metode …….. Klasični postopki preiskave vzorca na gojiščih Kultivacija na gojiščih (bakterije, glive) Porast mešane kulture Štetje MO oz. kolonij ali osamitev ene kolonije in.. …priprava čiste kulture Identifikacija Prisotnost toksinov  Vrste gojišč OSNOVNA (tekoča, trdna) (pept. voda, hranljivi agar, itd.) OBOGATENA (osnovnim dodamo npr beljakovine-kri, serum, mleko, jajca, itd.) BOGATITVENA pospešujejo razmnoževanje specifičnih bakterij DIFERENCIALNA na njih se morfološko ločijo različne skupine MO SELEKTIVNA zavirajo razmnoževanje drugih bakterij, pospešujejo rast želenih bakterij BIOKEMIČNA z dodanimi substrati (sladkorji, alkoholi, AK) za ugotavljanje biokemijske (metabolne) aktivnosti posameznih MO, oz. njihovih encimov, omogočajo identifikacijo  NAČINI PRENOSOV VZORCEV NA (V) GOJIŠČA ❑GLOBINSKO - V prazno petrijevko, inokuliran vzorec prelijemo z gojiščem - V epruveto z bujonom (1 ml, 0,1 ml) ❑POVRŠINSKO - Na že pripravljeno gojišče v petrijevkah – vzorec razmažemo po površini  Gojenje MO na gojiščih Kvantitativno ovrednotenje: štetje kolonije tvorečih celic, poraslih na gojišču (CFU: colony forming units, kolonijske enote) Posamične celice Pari Verižice Kvalitativno ovrednotenje: diferenciacija kolonij  Kolonijske enote določanje števila živih bakterij ali gliv v vzorcu. izražamo s številom mikroorganizmov, ki so na nekem trdnem gojišču sposobni tvoriti kolonije (kolonijske enote ali angl. CFU- colony forming units). Ena kolonija na gojišču je posledica razmnoževanja ene same bakterijske ali glivne celice iz vzorca, zato pomeni skupek gensko popolnoma enakih MO.  PRIPRAVA VZORCA ZA PREISKAVO Za mikrobiološko preiskavo pripravimo vzorce STERILNO!!! Vzorci v trdnem stanju (meso, salame, siri) – površino (ovojnino) razkužimo (ožgemo), jo odstranimo in vzorec vzamemo iz globine Pločevinke – obrišemo z alkoholom, površino ožgemo, pretresemo vsebino, odpremo ob ognju Tekoči izdelki (mleko, smetana, voda...) – dobro premešamo (penjenje), embalažo obrišemo z alkoholom, odpremo ob ognju Sipki izdelki – dobro pretresemo embalažo, embalažo obrišemo z alkoholom, odpremo ob ognju Jajca – očistimo lupino, razkužimo, sterilno jo razbijemo ob ognju Zamrznjeni izdelki – pred odvzemom vzorca kontrolirano odmrznemo (na T največ 37 °C, izjeme; Za nekatere vzorce standardi posebej določajo način priprave (npr. mešanje, odmrzovanje, topljenje) in odvzema vzorca ODVZETI LABORATORIJSKI VZOREC MORA PREDSTAVLJATI STANJE CELOTNEGA PREISKOVANEGA MATERIALA  Priprava vzorcev Tekoči Trdni (v tekočo obliko) Število MO v vzorcu veliko: decimalno razredčevanje Število v vzorcu majhno: a. predobogatitev, b. MPN (angl. Most probable number: metoda najverjetnejšega števila) c. prenos večje količine vzorca parcialno na več petrijevk d. filtracija (voda)  PRIPRAVA OSNOVNE SUSPENZIJE ❑ PRIMARNA (OSNOVNA) SUSPENZIJA TRDNI (POLTEKOČI) vzorci : 20 g + 180 ml (g) razredčevala 1:9 10-1 HOMOGENIZACIJA: lahko uporabimo peristaltični mešalec (gnetilnik) ali ročno (uporablja se za praškaste vzorce) RAZREDČEVALA za pripravo osnovne suspenzije: Peptonska – slana raztopina (pepton, NaCl) Puferska raztopina fosfata (2% K2HPO4 ali KH2PO4) Raztopina natrijevega citrata LASTNOSTI RAZREDČEVAL: ne vplivajo na MO v vzorcu, omogočijo sprostitev MO iz matriksa, delujejo kot pufer, izotonično, ne povzročijo razmnoževanja MO posebna razredčevala (npr. puferska raztopina) + antipenilci Temperatura – sobna temperatura oz. za nekatere vrste vzorcev standardi določajo segreto raztopino za redčenje (45 ⁰C) ISO 6887, 2010. Priprava preskusnih vzorcev, začetna suspenzija in decimalne razredčitve za mikrobiološko preiskavo)  RAZTOPINE ZA DECIMALNE RAZREDČITVE Po potrebi nadaljnja decimalna razredčevanja (števnost kolonij na gojiščih v petrijevkah) Za decimalno razredčevanje: Ringerjeva raztopina (NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3) Fiziološka raztopina (0,9 % NaCl) ISO 6887, 2010. Priprava preskusnih vzorcev, začetna suspenzija in decimalne razredčitve za mikrobiološko preiskavo)  NADALJNJE DECIMALNE REDČITVE 1 ml 10-1 + 9 ml raztopine za redčenje 10-2 1 ml 10-2 + 9 ml raztopine za redčenje 10-3 1 ml 10-3 + 9 ml raztopine za redčenje 10-4 Razredčevanje vzorca ali Vmešavanje vzorca v gojišče osnovne suspenzije UGOTAVLJANJE BAKTERIJ, KI SO PRISOTNE V MANJŠEM ŠTEVILU a. predobogatitev * Salmonella spp. * Listeria monocytogenes * Campylobacter jejuni * Yersinia enterocolitica PREDOBOGATITEV (oživitev tudi tistih m.o., ki so zaradi stresa oslabljeni) inkubacija OBOGATITEV (razmnožitev m.o.) inkubacija SELEKTIVNA, DIFERENCIALNA GOJIŠČA (izkorišča značilne lastnosti iskanih organizmov) inkubacija PRISOTNOST  UGOTAVLJANJE BAKTERIJ, KI SO PRISOTNE V MANJŠEM ŠTEVILU b. Metoda najverjetnejšega števila (MPN) Večja količina vzorca  UGOTAVLJANJE BAKTERIJ, KI SO PRISOTNE V MANJŠEM ŠTEVILU c. Prenos vzorca parcialno na več petrijevk ali vmešavanje večje količine vzorca z raztopljenim gojiščem in prenos na več petrijevk Po 1 ml v 5 petrijevk n≤10 Nato prelijemo z gojiščem, rezultate CFU na vseh petrijevkah seštejemo Vzorec ali osnovna suspenzija OS neposredno v petrijevke Mešanico gojišča in vzorca razlijemo v 5 petrijevk, rezultate CFU na vseh petrijevkah seštejemo 10 ml vzorca ali OS vmešamo v 90 ml raztopljenega gojišča  UGOTAVLJANJE BAKTERIJ, KI SO PRISOTNE V MANJŠEM ŠTEVILU d. Metoda membranske filtracije TEKOČI VZORCI (vino, pivo, bistri sokovi, voda…..) ali lahko tekoče osnovne suspenzije) Namesto razredčevanja, opravimo koncentracijo vzorca večjo količino vzorca prefiltriramo skozi membrano in jo položimo na ustrezno gojišče, po inkubaciji štejemo ali opazujemo prisotnost poraslih kolonij na membrani.  VAJA 1. Ugotavljanje SŠMO v mleku SKUPNO ŠTEVILO AEROBNIH MEZOFILNIH MIKROORGANIZMOV (SŠMO) Kakšno sme biti SŠMO v surovem, pasteriziranem steriliziranem mleku (UVT=UHT)? Uredba ES 853 2004 o posebnih higienskih pravilih za živila živalskega izvora *Smernice za mikrobiološko kakovost živil, 2019  VAJA 1. Ugotavljanje SŠMO v mleku SKUPNO ŠTEVILO AEROBNIH MEZOFILNIH MIKROORGANIZMOV (SŠMO) Merilo za higiensko pridobivanje in predelavo: Normativi: Surovo mleko brez termične obdelave: manj kot 100 000 CFU/ml (povprečje 2 mesecev). *Pasterizirano mleko: SŠMO (n=5, c= 1) m= 5x104 CFU/ml, M=5x105 CFU/ml *Sterilizirano mleko: SŠMO (aerobne mezofilne bakterije) (n=5, c= 1) m= 10 CFU/ml, M=102 CFU/ml Anaerobne bakterije (n=5, c= 0) n.n. v 1 ml Uredba ES 853 2004 o posebnih higienskih pravilih za živila živalskega izvora *Smernice za mikrobiološko kakovost živil, 2019  1. vaja: Mleko: SKUPNO ŠTEVILO AEROBNIH MEZOFILNIH MIKROORGANIZMOV (SŠMO) *Kvantitativna metoda *Vmešavanje vzorca v gojišče mleko: decimalno razredčevanje samega vzorca) Dodatna decimalna redčenja, če so potrebna (D, 10-1, 10-2, 10-3…) po 1 ml vsake decimalne razredčitve v petrijevke Prelijemo z ustreznim neselektivnim gojiščem (PCA) inkubacija 30 °C/72 ur Preštejemo vse kolonije na gojišču  NADALJNJE DECIMALNE REDČITVE 1 ml 10-1 + 9 ml raztopine za redčenje 10-2 1 ml 10-2 + 9 ml raztopine za redčenje 10-3 1 ml 10-3 + 9 ml raztopine za redčenje 10-4 Razredčevanje vzorca ali Vmešavanje vzorca v gojišče osnovne suspenzije  Izračun rezultata števila mikroorganizmov v 1 ml vzorca (ob prenosu 1 ml vsake razredčitve v gojišče): ΣC N = ------------------------------ V × (n1 × 1 + n2 × 0,1 + n3 × 0,01 …). d N = število CFU/ ml Σ C = vsota preštetih kolonij na vseh števnih petrijevih posodic n1 = število petrijevih posodic prve razredčitve, ki se upoštevajo pri izračunu; n2 = število petrijevih posodic druge razredčitve, ki se upoštevajo pri izračunu; n3 = število petrijevih posodic tretje razredčitve, ki se upoštevajo pri izračunu; d = faktor decimalnega razredčevanja (enak prvi razredčitvi, ki jo upoštevamo pri izračunu) V. količina vzorca, ki ga prenesemo na gojišče v ml - Izračunan rezultat zaokrožimo na dve celi mesti: - Če je na tretjem mestu število manjše od 5, npr. 173 000, zaokrožimo navzdol: 170 000 - Če je število večje od 5, npr. 176 000, zaokrožimo navzgor: 180 000 - Če je število 5, zaokrožimo navzgor (11 500 = 12 000)  Primer: Števnost petrijevk: SŠMO: neselektivna gojišča: