TP Microbiologie Pratique PDF

# SEANCE D’INITIATION ## NOTIONS DE MICROBIOLOGIE PRATIQUE Ces travaux pratiques mettent l’accent essentiellement sur l’initiation aux techniques de base de la microbiologie et sur son lexique. ## I. Quelques instruments utilisés en Microbiologie ### 1. Le microscope: Appareil pour observer des...

# SEANCE D’INITIATION ## NOTIONS DE MICROBIOLOGIE PRATIQUE Ces travaux pratiques mettent l’accent essentiellement sur l’initiation aux techniques de base de la microbiologie et sur son lexique. ## I. Quelques instruments utilisés en Microbiologie ### 1. Le microscope: Appareil pour observer des détails visibles à l’œil nu C’est l’un des instruments les plus utilisés par le microbiologiste. Nous utiliserons un microscope photonique à grossissement 40X à 1000X (voir schéma). ### 2. Le fil à ensemencer: Fil en métal inoxydable (tungstène) maintenu à l’extrémité d’une tige métallique (manche) par un mandrin. Ce fil était autrefois en platine d’où le nom de " fil de platine " encore utilisé. On distingue le fil droit, l’anse ou Öse et la spatule: fil droit pour ensemencement en piqûre, la spatule pour l’ensemencement de cultures sèches, l’anse dans la plupart des autres cas (prélèvement des cultures bactériennes solides ou liquides et l’ensemencement). L’anse est tenue par le manche: la position des doigts est la même que celle adoptée pour l’écriture. Elle est stérilisée juste avant et après usage pendant quelques secondes par flambage (le fil devient rouge). ### 3. Les pipettes Pasteur ou graduées Utilisées dans le cas d’un inoculum liquide. ### 4. L’étaloir ou étaleur Pour l’étalement d’un inoculum liquide sur une gélose en boîte de Pétri. Il peut avoir la forme << L >>ou posséder à l’une des extrémités une forme triangulaire (étaleur Drigalski) ### 5. Les boîtes de Pétri : Ce sont des boîtes en verre ou en plastique, formées de deux parties (fond et couvercle) qui s’emboîtent l’une dans l’autre. Elles sont destinées à contenir des milieux de culture solides. Elles sont stérilisées comme toute la verrerie à l’étuve à 200°C, pendant une nuit. Quand elles sont en plastique, elles sont à usage unique. ## II. Milieux de culture ### 1. Principales caractéristiques d’un milieu de culture Les micro-organismes nécessitent des milieux de culture pour leur croissance et leur multiplication. Ils doivent y trouver tous les éléments chimiques les constituant, sous une forme appropriée. Ces milieux doivent donc satisfaire les exigences nutritionnelles des microorganismes. Un bon milieu doit : * Etre stérile * Etre nutritif: doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes. * Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien. * Avoir un pH convenable. *Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux micro-organismes est dit milieu minimum ### 2. Composition chimique Les milieux de cultures sont constitués de : * Une source de carbone (souvent un sucre); * Une source d’azote (synthèse protéique); * Des sels minéraux qui jouent un rôle important dans le maintien de la pression osmotique et de la force ionique; * Des facteurs de croissance (vitamines, cofacteurs, oligoéléments...). ### 3. Préparation des milieux de culture Sachant que de la préparation des milieux de culture dépendent les résultats de l’analyse microbiologique, un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc apporter un grand soin à leur fabrication. Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique : * Le prêt à l’emploi * Le prêt à couler * En poudre. Ce sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la dose à peser pour un volume final de milieu. Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en : * La pesée * La dissolution des ingrédients * La mesure du pH * La répartition * La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min) *L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la mesure du pH. Le milieu doit alors être porté à ébullition pour dissoudre l’agar. ### 3. Le pH du milieu de culture Les milieux de culture ont un pII bien précis, le plus souvent voisin de la neutralité (pH=7). Le pH est un paramètre très important dont le contrôle est obligatoire, vu son rôle éminent dans le maintien et l’établissement des échanges avec le milieu extérieur. On distingue trois type de micro-organismes selon leur pH de croissance optimum : * Les neutrophiles : PH neutre ; * Les basophiles : PH basique ; * Les acidophiles : PH acide. ### 4. La température des milieux de culture La croissance des micro-organismes exige également une température adéquate du milieu, le plus souvent ce sont des températures moyennes (20 à 40°C), c’est le cas des micro-organismes mésophiles. Cependant, il existe des micro-organismes : * Psychrophiles : Température < 20°C; * Et d’autres qui sont Thermophiles : Température > 40 °C Les psychrophiles et les thermophiles sont peu nombreux. ### 5. L’ oxygénation des milieux de culture (selon le mode respiratoire des bactéries) Selon leur besoin en oxygène, on définit plusieurs classes de bactéries : * Les bactéries aérobies : * Elles ont besoin d’une teneur en O2 voisine de la pression partielle de l’O2 dans l’atmosphère normale ; * Les bactéries aéro-anaérobies facultatives : * Elles peuvent vivre indifféremment en présence ou en absence d’O₂; * Les bactéries micro-aérophiles : * Elles ont besoin d’une faible teneur en oxygène pour se développer. * les bactéries anaérobies : * L’oxygène leur est toxique. Elles se développent en milieu très réducteur. Par exemple dans le fond des marécages, dans les eaux stagnantes, également dans le tube digestif des animaux. ### 6. Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont classés surtout en fonction de leur composition ou de leur utilisation. **a. Classification selon leur présentation** * **Milieux liquides** * Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente. * **Milieux solides** * Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. La solidification est assurée par des agents gélifiants tels, la gélatine ou l’agar-agar (gélose). L’agar-agar, extraite d’une algue marine, est une substance hydrocarbonée non nutritive: elle ne constitue qu’un support du milieu de culture. Capable d’absorber 200 à 250 fois son poids d’eau, la gélose forme une gelée qui se liquéfie à 65-70°: en refroidissant, cette gelée demeure en surfusion jusqu'à 40-45° et prend une masse aux températures inférieures. L'agar-agar est généralement incorporé aux milieux liquides à la dose de 15 à 20 g/l. On appelle gélose nutritive ou bouillon nutritif gélosé un milieu de culture complexe solidifié. Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose inclinée, ou molle prise en culot, etc. **b. Classification selon la composition.** * **Les milieux complexes de composition chimique non définie, ils sont soit naturels (sang, lait, sérum...) soit artificiels c'est-à-dire des milieux de composition définie auxquels on ajoute un extrait de levure, de viande ou autre substance de composition connue. Ce sont des milieux riches en nutriments et qui peuvent servir à la croissance d'une grande variété de germe.** * **Milieux naturels ou empiriques** * Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit végétale (pomme de terre, levure). * **Milieux synthétiques ou minima** * Milieux composés de substances chimiques exactement définies. ils ne contiennent que les éléments de base nécessaires à la croissance d'un germe particulier ou un groupe restreint de germes dont les besoins nutritifs sont connus. * **Milieux semi synthétiques** * Milieux synthétiques additionnés d'un produit naturel **c. Classification selon l'utilisation** * **Milieu usuels = milieu de base** * Milieu d'un emploi aussi général que possible. Il n'existe cependant pas de milieu de culture universel * **Milieu d'isolement** * Les milieux d'isolement peuvent être : * Des milieux de base * Des milieux enrichis de produits biologiques * Des milieux d'enrichissement * Des milieux électifs: Ce sont des milieux de culture permettant un développement particulièrement abondant de certains germes. * Des milieux sélectifs: Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des bactéries excepté celui de l'espèce recherchée. Ces milieux permettent donc d'isoler une espèce bactérienne au milieu d'un mélange de germes. * **Milieu d'identification** * Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les problèmes d'identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins. ## III. La stérilisation ### 1. Définition La stérilisation est l’opération qui consiste à détruire tous les microorganismes, tant sous leur forme végétative que sous leur forme de résistance (spores). Cette notion doit être différenciée de la désinfection et de la pasteurisation dans lesquelles la destruction des microorganismes, pratiquée dans un but différent peut être moins rigoureuse. La stérilisation est indispensable lors de la préparation du matériel et des milieux destinés aux manipulations. II existe plusieurs techniques de stérilisation. ### 2. Stérilisation par les méthodes physiques **a. Stérilisation par la chaleur** * **Le flambage** Il est basé sur l’emploi de la flamme du bec Bunsen. Cette méthode est utilisée pour la stérilisation extemporanée (pour utilisation immédiate) du matériel de manipulation: extrémité de l’anse, Les anses sont placée verticalement dans la flamme du bec bunsen, sont portées au rouge, puis passées horizontalement 2 à 3 fois, ce geste étant exécuté lentement. L’extérieur des pipettes Pasteur et pipettes graduées sont passées rapidement dans la flamme du bec bunsen. Col des tubes à essai, flacons, erlenmeyers...etc. sont également passés à la flamme en effectuant un mouvement de rotation * **La chaleur sèche (le four Pasteur)** C’est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients divers et objets métalliques). La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à l’intérieur du four et subit un chauffage de plusieurs heures à 160°C. Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l’étuve jusqu’à son refroidissement complet, puis stocké à l’abri des poussières. * **La chaleur humide (l’autoclave)** La chaleur humide agit sur les bactéries en dénaturant leurs protéines. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une température de 100° à 130°C, dans une enceinte de l’autoclave, pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. L’autoclave est un appareil très performant qui est indispensable dans une unité de microbiologie. Il est utilisé pour stériliser les milieux de culture (la chaleur humide évite l’évaporation de l’eau), mais peut également stériliser tout autre matériel de microbiologie. **A ▲ Remarque: Pour certains milieux de culture fragiles (comme les milieux au désoxycholate) ne supportant pas les températures élevées, on procède à une ébullition à 100°C.** * **Tyndallisation** John TYNDALL: physicien irlandais (1820-1893) a découvert l’effet qui porte son nom. Il a imaginé une méthode de stérilisation qui consiste en chauffages discontinus à une température relativement basse (60 ou 70°C suivant le cas), suivis de refroidissements. On admet qu’au cours de ces périodes de chauffage discontinu, les bactéries perdent leur aptitude à sporuler. Actuellement, la tyndallisation consiste en une série de 3 pasteurisations de 1h. à 70 - 80°C, séparées par un intervalle de 24 heures à température ambiante, ce qui permet la germination et la destruction des spores, sans l’emploi d’une température excessive. Cette méthode est utilisée pour les milieux fragiles contenant sérum, oeuf ou toute substance thermosensible de forte viscosité qui ne peut être stérilisée par filtration. * **Flambage à l'alcool** Il est utilisé pour la stérilisation de matériel de manipulation en verre (étaloir), ou la désinfection des paillasses. Attention, opération dangereuse ! **b. Stérilisation par filtration** Cette méthode est utilisée pour les milieux sensibles à la chaleur, mais n'est possible que lorsque la viscosité de ces milieux est faible. On utilise alors, suivant le cas, les bougies de porcelaine (type Chamberland), les filtres de verre poreux (le verre fritté N°5 arrête de nombreuses bactéries) ou les membranes filtrantes à usage unique, de type Millipore ou Sartorius. Ces dernières sont actuellement les plus utilisées dans les laboratoires. **c. Stérilisation par les radiations** La stérilisation par les U.V (345 à 254 nm) est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l’air et des paillasses situées sous la hotte de protection: le rayonnement n'agit que de façon directe et sa pénétration est faible. Des instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri peuvent être stérilisées de la sorte. Elles sont très efficaces puis elles provoquent de multiples mutations du génome bactérien. Ces mutations sont souvent létales D'autres radiations (rayons X,), peu utilisées, peuvent cependant servir pour la stérilisation industrielle des boîtes de Pétri en matière plastique: stérilisation par ionisation. ### 3. Stérilisation par des agents chimiques Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles et plans de travail et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être systématiquement pratiqué, dans nos laboratoires, pour les lames et pour la verrerie qui ne passe pas en autoclave. **a. Les antiseptiques liquides** * L’alcool éthylique à 60% pour la désinfection des paillasses et des instruments. Mais certains germes étant résistants, la désinfection n'est pas toujours évidente. * L'hypochlorite de sodium (eau de Javel) est utilisé dilué au 1/4 dans les bacs destinés à recevoir les lames usagées, ou en pissette pour la désinfection des mains, des paillasses et des sols. Rappelons que l'eau de Javel est toujours largement employée en milieu hospitalier, dans certaines industries et à domicile. * Les savons et détergents agissent surtout par leur pouvoir mouillant, ce qui facilite l'élimination des germes. **b. Les antiseptiques gazeux** * Les vapeurs d’une solution chauffée de formol sont utilisées pour désinfecter les pièces et les étuves. * L'oxyde d'éthylène est utilisé dans l'industrie pour la désinfection de certains matériels en plastique à usage unique. Dans les centres hospitaliers, une enceinte est réservée à ce type de désinfection pour le matériel d'intubation par exemple, qui ne supporte pas l'échauffement. Ce matériel, acheté stérile passe une seule fois dans l'enceinte à oxyde d'éthylène, pour une deuxième utilisation, puis il est détruit. ## IV. Organisation du poste de travail L'organisation du poste de travail est nécessaire pour travailler stérilement, ainsi la paillasse doit être lavée à l'eau de Javel et doit contenir : * Au centre: un ou deux bec bunsen allumés au moins 10 minutes avant le début des manipulations. Le bec Bunsen, réglé avec une flamme bleue, la plus chaude, crée une zone de stérilité d'un diamètre d'environ 15 cm, par ascendance de l'air de cette zone. Le bec bunsen restera allumé jusqu'à la fin de la séance.. Toutes les manipulations d'ouverture de tubes et boîtes de culture, d'ensemencement, devront être réalisées dans ce diamètre. Pour que cette zone soit effectivement stérile, les courants d'air et déplacements de personnes sont à proscrire. N.B.: La flamme du bec Bunsen doit être bleu (oxydation totale), pour cela régler l'aération en tournant la virole située à la base du bec. **Poste de Travail :** est un espace aménage pour réaliser l’ensemencement. * **incubateur:** Structure d'accompagnement destinée aux proteus de projet d'incubation: le processeur de maintien des cultures de micro-organismes dans des Conditions Contrôlées. * **Contamination :** **Zone de stérilité** * **A gauche :** le matériel sur lequel est effectué le travail : portoir à tubes vides ou contenant des solutions stériles et des milieux de culture à ensemencer, boîtes de Pétri, lames propres, erlenmeyers, flacons contenant les milieux de cultures...etc. * **A droite:** les instruments avec lesquels le travail est effectué: anses, pipettes graduée S stériles, pipettes pasteur, râteaux, marqueurs...etc. N.B.: Bien entendu, ce sera l'inverse pour les personnes « gauchers >>> ## MANIPULATION 1 ### TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT ### ET ### MISE EN EVIDENCE DES MICRO-ORGANISMES DANS DIFFERENTS MILIEUX **Objectif:** Cette séance permettra aux étudiants de: * S'initier au travail dans des conditions stériles * Se familiariser avec les différentes techniques d'ensemencement et de culture des bactéries * Mettre en évidence l'existence de microorganismes dans différents milieux naturels (eau, air sol...), dans des produits alimentaires (lait, jus de fruit) et sur des surfaces corporelles (doigt, bouche, oreille, cheveux....) ### I. Techniques d'ensemencement #### 1. Définition * L'ensemencement c'est mettre en culture un germe dans un milieu nutritif. #### 2. Règles fondamentales * L'ensemencement doit être pratiqué sur des milieux stériles avec des instruments stériles près de la flamme d'un bec Bunsen. * L'ensemencement ne doit en rien modifier la semence (inoculum), ni la contaminer, ni la stériliser. #### 3. Précautions générales et mode opératoire **a. Précautions générales :** * Réunir tout le matériel nécessaire et le disposer sur la paillasse de façon rationnelle. * Etiqueter les tubes à ensemencer (nom de la culture, date de l'ensemencement, nature du milieu) * Sortir à moitié environ les bouchons de coton (de façon à pouvoir les enlever rapidement par la suite). * Avant chaque prélèvement, flamber le fil ou la pipette et les laisser refroidir, extrémité ou pointe en bas. * Flamber l'orifice du récipient débouché avant et après chaque prélèvement ou ensemencement. Pendant ce flambage garder le bouchon de coton dans la main, entre le petit doigt et la paume; ne jamais le poser sur la paillasse. * Après flambage, reboucher immédiatement * Opérer rapidement et toujours à proximité de la flamme du bec Bunsen pour restreindre les possibilités de contamination. * Ne jamais poser le fil sur la paillasse sans l'avoir soigneusement flambé * Après leur dernière utilisation, placer les pipettes dans un récipient contenant une solution antiseptique puis stériliser avant de jeter. **b. Mode opératoire :** * **Semence liquide portée en milieu liquide** * Passer la pipette 3 ou 4 fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen; la laisser refroidir un instant, la partie effilée dirigée vers le bas. * Saisir le flacon contenant le produit à ensemencer, l'agiter correctement, le déboucher. * Flamber rapidement l'orifice du flacon * Plonger la pipette refroidie de 1 à 2 cm au plus dans le liquide sans toucher aux parois du flacon; homogénéiser par aspirations et refoulements successifs. * Retirer la pipette; flamber et reboucher le flacon * Prendre un tube en milieu, en flamber l'orifice, y introduire la pipette, laisser l'inoculum s'écouler librement, la pointe de la pipette reposant sur la paroi intérieure du tube au-dessus de la surface libre du liquide. * Retirer la pipette, flamber l'orifice du tube ensemencé, le boucher, homogénéiser son contenu. * **Semence solide portée en milieu liquide** * Flamber le fil à ensemencer, le laisser refroidir pendant quelques secondes, l'extrémité dirigée vers le bas. * Déboucher le tube-souche, en flamber l'orifice. * Introduire le fil dans le tube et prélever un peu de la culture. * Flamber l'orifice du tube et le reboucher. * Déboucher un tube de milieu stérile et en flamber l'orifice. * Introduire le prélèvement dans le milieu et agiter le fil pour bien incorporer l'inoculum. * Flamber l'orifice du tube ensemencé et le reboucher. * **Semence solide ou liquide portée en milieu solide** * Les milieux solides peuvent être inoculés de diverses manières, en fonction du but poursuivi (voir techniques d'ensemencement) **c.Techniques d'ensemencement** * **Ensemencement en stries d'une gélose inclinée** * Prélever la semence (gouttelette de liquide contenant les bactéries) à l'aide de l'anse. * Introduire le fil jusqu'au fond du tube de gélose inclinée stérile * Faire glisser l'anse sur la surface du milieu en décrivant une sinusoïde. * **Ensemencement en piqûre d'une gélose en culot** * La piqûre en gélose profonde consiste à ensemencer en milieu solide -- par exemple une gélose en culot ou le fond d'une pente -- en plongeant le fil droit, verticalement dans le milieu. * L'inoculum (à la pointe du fil) est ainsi distribué tout le long du trajet dans la gélose. On utilise ce procédé pour inoculer en profondeur les zones micro-aérobies ou anaérobies du milieu. * **Ensemencement par striation, méthode des cadrans ou épuisement de la semence pour l'ilsolement d'une souche bactérienne** * On recourt à l'ensemencement en stries ou striation quand on veut obtenir des colonies distinctes, bien séparées l'une de l'autre, et qu'on sait que l'inoculum (liquide ou solide) contient un grand nombre de cellules. Dans cette méthode, l'inoculum est progressivement << épuisé >> de telle sorte que, sur une partie au moins de la surface de la boîte, des cellules soient déposées individuellement et bien séparées. On arrive habituellement à ce résultat dans la troisième, quatrième ou cinquième série de stries. A l’incubation, chacune de ces cellules isolées donne naissance à une colonie distincte. * **Ensemencement par étalement d'une gélose en boîte** * Un étalement sur boîte consiste à étaler un petit volume d'inoculum liquide sur la surface du milieu solide au moyen d'une tige de verre stérile en forme de L (un << étaloir »). * **Ensemencement par incorporation dans la gélose (en profondeur ou par inclusion)** * Un petit volume d'inoculum liquide soit 1 ml est mis dans une boite de Pétri stérile et vide. Un milieu gélosé liquéfié et maintenu à une température de 45-50 °C est ensuite coulé dans la boite. Après homogéinisation', refroidissement et solidification du milieu, la boite ainsi ensemencée est incubée à l'étuve. * <Maintenir la boîte bien à plat sur la paillasse, effectuer des mouvements de translation circulaires, en évitant tout mouvement brusque. >> ### II. Manipulations: Mise en évidence des micro-organismes dans différents milieux #### 1. Mise en évidence des micro-organismes de l'air * Inscrire "30 min.", "1 heure" séparément sur deux boites contenant de la gélose nutritive. Les laisser ouvertes loin du bec Bunsen pendant les durées indiquées. * Pour mettre en évidence l'efficacité du bec Bunsen en ce qui concerne la zone de stérilité, 2 boîtes "T" témoin seront laissées ouvertes pendant les mêmes durées près d'un bec allumé. * A la fin de la séance, toutes les boîtes seront placées à l'envers, dans une étuve à 37°C pour incubation. #### 2. Mise en évidence des micro-organismes sur des surfaces corporelles : * Pour l'oreille et la bouche, on utilise l'ensemencement au moyen d'un écouvillon stérile (coton-tige stérile) pour prélever un inoculum. Une fois chargé, l'écouvillon sera promené délicatement en traçant des stries sur toute la surface du cadran de la boîte contenant le milieu adéquat. * Diviser une boite de Pétri en quatre cadrans avec le marqueur, chaque cadran sera ensemencé à partir de bouche, oreille, doigt et cheveux séparément : * Bouche (B): Gratter le palais buccal ou les dents à l'aide d'un coton tige stérile et ensemencer un quart de boîte par striation; * Oreille (O): Procéder de la même façon qu'avec la bouche et ensemencer cadran correspondant; * Cheveux (C): Placer un petit cheveu (là 2 cm) de la tête sur le troisième cadran de la boîte sans toucher la gélose nutritive avec les doigts; * Doigts (D): Poser très légèrement un doigt (empreinte) sur la gélose nutritive dans le dernier cadran. La gélose ainsi ensemencée sera incubée à 37°C pendant 24-48 h. le couvercle en dessous, afin que l'eau de condensation qui serait formée à l'intérieur de la boîte ne retombe sur la gélose afin d'éviter la contamination. #### 3. Mise en évidence des micro-organismes dans des produits alimentaires: le jus d'orange et le lait * **Mise en culture en milieu liquide** * Elle se fait dans des tubes à culture contenant un bouillon nutritif. On prélève un peu de lait ou de jus avec l'anse ou la pipette et on l'introduit dans le tube de culture. Les tubes seront ensuite placés dans l'étuve à 37°C. Ils serviront lors de la prochaine séance pour observation microscopique des bactéries. * **Ensemencement par la méthode des cadrans** * Prélever une goutte de lait frais pasteurisé à l'aide de l'anse flambée. Procéder comme indiqué en * **Ensemencement par étalement** * Avec un étaloir, répandre un volume de 1 ml de jus d'orange sur toute la surface du milieu de culture. * **Ensemencement par piqûre centrale** * Il sera réalisé à partir d'une culture en bouillon nutritif * **Ensemencement par stries sur gélose inclinée.** * Il sera réalisé également à partir d'une culture en bouillon nutritif ### III. Résultats La séance prochaine, sera consacrée à l'observation macroscopique des colonies et à l'étude microscopique des bactéries. Les cultures en milieu liquide et sur gélose nutritive seront également examinées. ## MANIPULATION 2 ### ETUDE MORPHOLOGIQUE DES BACTERIES **Objectif:** Cette étude constitue une étape fondamentale pour l'identification et la classification des bactéries. Elle s'effectue à deux niveaux: * L'étude morphologique à l'échelle macroscopique des colonies. * L'étude morphologique à l'échelle microscopique des bactéries. ### I. ETUDE MACROSCOPIQUE DES CULTURES BACTERIENNES : #### 1. En milieux liquides : * Le niveau et le mode de développement des germes, varie selon les espèces et selon leur exigence vis-à-vis de l'oxygène (aérobies, anaérobies, facultatifs). Dans tous les cas, le développement des bactéries en milieux liquides se manifeste par l'apparition d'un trouble dans la milieu (cellules bactériennes en suspension). Certaines espèces peuvent également former soit un dépôt au fond du milieu liquide, soit un voile à la surface. #### 2. Sur milieux solides: * La multiplication des bactéries sur les milieux de culture solides se traduit par l'apparition de colonies visibles à l'œil nu, soit à la surface (aérobies), soit en profondeur du milieu (anaérobies) selon leur type respiratoire. Les caractères morphologiques des colonies sont spécifiques d'un groupe bactérien (Famille, genre, espèce, souche...) et peuvent servir dans l'identification des germes. Les caractères morphologiques les plus fréquemment étudiés pour décrire une colonie sont : * La taille: déterminée par le diamètre de la colonie. * Les contours ou formes: réguliers, lobés, ondulés, crénelés, fimbriés, rhizoïdes (Schéma 1). * L'aspect ou relief : c'est l'élévation par rapport à la surface de la gélose. On a des colonies plates, sur levées, bombées, convexes basses, convexes en dôme, convexes ombiliquées, convexes à surface papillaire. (Schéma 1). * La surface des colonies : lisse (S), rugueuse (R), muqueuse (M). Ce caractère peut être déterminé en observant la réflexion de la lumière par les colonies. * L'odeur: présence ou absence d'odeur spécifique. Ce caractère ne peut être étudié que si la boîte de Pétri contient les mêmes types de colonies. * La couleur : les colonies sont le plus souvent blanche - grisâtre, maie certains germes élaborent des pigments caractéristiques. (Exemples: *Serratia marcescens* / colonies rouges; *Staphylococcus aureus* / colonies jaunes ou orangées; *Pseudomonas aeruginosa* / colonies bleu – verdâtres). * La consistance: ce caractère se détermine en touchant la colonie avec l'anse stérile. Les colonies sont soit visqueuses, soit granuleuses. * La transparence : ce caractère se détermine en regardant la lumière à travers les colonies. Les colonies peuvent être transparentes, translucides ou opaques. #### 3. Résultats : * Examiner la boîte de Pétri à l'œil nu, choisir 2 colonies représentatives différentes parmi toutes les colonies présentes et décrire leur différents caractères morphologiques. (Ne pas étudier les caractères odeur et consistance). ### I. ETUDE MICROSCOPIQUE DES CULTURES BACTERIENNES : * L'examen microscopique est une étape primordiale dans l'étude d'une bactérie. L'observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration. Dans le premier cas, on examine des individus vivants: on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme des germes; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration, après fixation et desséchage des préparations sous forme de frottis (opérations tuant les germes sans les détruire). #### 1. Prélèvement de culture pour l'observation microscopique : * Culture en milieu liquide: Une goutte de la culture bactérienne en milieu liquide (Bouillon nutritif) prélevée à l'anse avec les précautions de stérilité habituelle, est déposée au centre d'une lame propre, dégraissée et séchée à la flamme du bec bunsen. La préparation est recouverte de la lamelle sans que le liquide ne déborde. * Culture sur milieu solide: On dépose au centre de la lame une goutte d'eau distillée ou d'eau physiologique, sur laquelle on dissocie un fragment de la colonie prélevé au fil de l'anse stérile. La lamelle est ensuite déposée comme précédemment. #### 2- Examen microscopique à l'état frais : * Déposer une goutte (à l'anse) de la culture bactérienne (bouillon ou eau de condensation d'une gélose inclinée) ou d'un bout de colonie mise en suspension. Il peut être nécessaire de diluer la culture. * Recouvrir la lame d'une lamelle. Le liquide ne doit pas déborder. L'observation de l'état frais se réalise à l'objectif x 40, le condenseur descendu, et le légèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit la propriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants. La technique opératoire consiste à déposer une goutte de la culture liquide ou solide comme mentionné ci-dessus, la couvrir de lamelle et l'observer à l'objectif x 40. Noter la forme des cellules bactériennes, leur taille (en présence d'un microscope à oculaires gradués), leur mode de groupement et leur mobilité (Schéma 2). **N.B.:** Les cellules peuvent être mobiles : la présence de cils (non visibles à l'état frais) favorise le déplacement qui ne doit pas être confondu avec le mouvement général du liquide ou avec le mouvement brownien si la température du liquide est trop élevée (du fait de l'éclairage continu). Un corps microbien est mobile lorsqu'un individu observé traverse le champ du microscope ou lorsque deux individus se croisent. #### 3. Examen après fixation et coloration : * Les observations après coloration se font à l'objectif 100 avec une goutte d'huile à immersion, le condenseur relevé à fond, et le diaphragme ouvert entièrement. * **Réalisation d'un frottis :** * On dépose une goutte de la culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte d'eau au centre d'une lame propre dégraissée. * On étale la préparation avec l'anse de façon à obtenir une couche mince * On sèche la lame à la température ambiante. * On fixe la préparation en chauffant très légèrement à au moins 50 cm au dessus de la flamme bleue du bec bensen ou bien en écrasant la flamme du bec 2 à 3 fois avec la lame. * On attend le refroidissement de la lame avant d'entamer la coloration. * **Coloration de Gram :** * C'est la technique de coloration la plus utilisée en microbiologie. Elle a été découverte en 1883 par Ch. GRAM. Elle est à la base